張婷婷，錢炳碩，王明霞，朱明星

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)科技中心，寧夏 銀川 750004；5.寧夏常見傳染病防治重點實驗室，寧夏 銀川 750004

細(xì)粒棘球蚴病又稱囊型包蟲病，中間宿主由于誤食了細(xì)粒棘球絳蟲（Eg）的蟲卵而感染該?。?-2］。胞外囊復(fù)合物2（EXOC2）是一種多蛋白復(fù)合物，是胞外囊泡極化靶向細(xì)胞膜上特定對接位點所必需的，相關(guān)研究［3-4］顯示外囊功能喪失在酵母、秀麗隱桿線蟲、果蠅、小鼠及多個細(xì)胞系中都是致命的，但是EXOC2 在Eg 感染中的作用目前尚未有系統(tǒng)性研究。本研究利用生物信息學(xué)的方法對Eg EXOC2 蛋白進(jìn)行分析，旨在了解EXOC2 在Eg 生物功能及免疫診斷方面的價值，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列獲取

登錄NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索并下載EgEXOC2 蛋白的氨基酸序列，該蛋白的序列號為XP_024353820.1。

1.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測

利用蛋白質(zhì)在線分析網(wǎng)站Protparam 工具預(yù)測EXOC2的理化性質(zhì)，包括氨基酸組成、等電點、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)及GRAVY 值等。使用ProtScale 數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)的疏水性并進(jìn)行驗證，其中＞0 表示疏水性，＜0 表示親水性。

1.3 進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用MEGA 11.0 軟件構(gòu)建秀麗隱桿線蟲、Eg、圓頭蟲、人、小鼠、線蟲、威得利纖毛蟲、單色微絲蟲、裂尾蚴、血吸蟲、紫圓線蟲、鼠類圓線蟲等12種生物的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 信號肽、蛋白跨膜區(qū)及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

利用SignalIP-5.0 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測該蛋白的信號肽，使用TMHMM-2.0 數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。使用SMART在線數(shù)據(jù)庫分析該蛋白的結(jié)構(gòu)域。

1.5 蛋白質(zhì)抗原表位預(yù)測

使用ABCPred 數(shù)據(jù)庫和IEDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測該蛋白的優(yōu)勢B 細(xì)胞表位，使用IEDB 數(shù)據(jù)庫和SYFPEITHI 數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白的優(yōu)勢T細(xì)胞表位。

1.6 蛋白相互作用關(guān)系預(yù)測

使用STRING 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測與該蛋白相互作用的其他蛋白。

1.7 相互作用基因的篩選及GO和KEGG富集分析

利用R 軟件“clusterProfiler”包和“ggplot2”包對差異基因進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，以可視化條形圖和氣泡圖的方式呈現(xiàn)。

1.8 磷酸化及修飾位點預(yù)測

利用NetPhos-3.1 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測該蛋白的磷酸化位點，使用motif_scan數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白修飾位點。

2 結(jié)果

2.1 EXOC2的理化性質(zhì)分析

使用ProtParam對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，EXOC2的分子量為123 874.86；由1 117個氨基酸組成，包含66個酸性氨基酸，96 個堿性氨基酸；理論等電點為7.86；分子式為C5446H8686N1552O1662S43；原子總數(shù)為11 524；半衰期為30 h；不穩(wěn)定系數(shù)為60.21，表明該蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；GRAVY值為-0.625，說明該蛋白為親水性蛋白，見表1。

表1 EXOC2的理化性質(zhì)

2.2 親/疏水性分析

使用ProtScale數(shù)據(jù)庫預(yù)測該蛋白的親/疏水性，該蛋白在第812 個氨基酸處疏水性最強(qiáng)，最大值為2.444，在第109 個氨基酸處親水性最強(qiáng)，其最小值為-3.098，由結(jié)果可知，該蛋白大部分氨基酸具有親水性質(zhì)，其中親水性強(qiáng)的部分可能存在抗原表位，見圖1。

圖1 EXOC2親水性預(yù)測分析

2.3 EXOC2進(jìn)化樹的構(gòu)建

進(jìn)化樹結(jié)果顯示，EXOC2 在生物進(jìn)化上與紫圓線蟲、裂尾蚴、血吸蟲和鼠圓線蟲的親緣關(guān)系較近，與威得利纖毛蟲和人的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，見圖2。

圖2 EXOC2進(jìn)化樹

2.4 蛋白質(zhì)的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

信息學(xué)預(yù)測顯示該蛋白不含信號肽序列，也不存在跨膜區(qū)。

2.5 蛋白優(yōu)勢表位分析

利用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測該蛋白的B 細(xì)胞表位，得到的B細(xì)胞表位肽有11 條。使用IEDB 預(yù)測軟件預(yù)測長度＞10 個氨基酸的區(qū)域位于100-115、539-540、851-866、896-911、988-992、704-749。利用SYFPEITHI 在線分析軟件的表位預(yù)測功能分析蛋白的HLA-A0201 限制性（9aa）細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）表位，篩選出預(yù)測分值＞25 的表位肽，共13 條；分析蛋白的HLA-DRB1*0401 和HLADRB1*0701 限制性（15aa）輔助性T 細(xì)胞（Th）表位，篩選出預(yù)測分值＞26 的肽段，并通過IEDB 在線網(wǎng)站預(yù)測HLA-DRB1*0401 限制性Th 表位，篩選出評分較高的細(xì)胞表位，分別取交集，得到HLA-A0201 優(yōu)勢表位氨基酸區(qū)域為697-698、821-824，HLA-DRB1*0401限制性Th表位氨基酸區(qū)域為821-823、920-930，HLA-DRB1*0701 限制性Th 表位氨基酸區(qū)域為270-275、920-922，見圖3、表2、表3、表4、表5。

表2 HLA-A0201限制性CTL表位

表3 HLA-DRB1*0401限制性Th表位

表4 HLA-DRB1*0401限制性Th表位

表5 HLA-DRB1*0701限制性Th表位

圖3 EXOC2優(yōu)勢B細(xì)胞表位結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.6 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

SOMPA 在線軟件分析顯示，在蛋白的二級結(jié)構(gòu)中a-螺旋占45.84%，β-轉(zhuǎn)角占13.56%，延伸連占13.7%。無規(guī)則卷曲占36.62%，以a-螺旋為主，見圖4。

圖4 EXOC2蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 蛋白相互作用關(guān)系預(yù)測

通過在線數(shù)據(jù)庫對EXOC2 進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)其與EXOC5、EXOC6、EXOC3等EXOC蛋白家族及Ras相關(guān)蛋白密切相關(guān)。

2.8 相互作用基因的篩選及GO和KEGG富集分析

利用R 軟件“clusterProfiler”包和“ggplot2”包對差異基因進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。生物學(xué)過程中與EXOC2 相關(guān)程度最高的是蛋白單泛素化，RNA 3'末端加工，染色體正向調(diào)控，大分子甲基化等；細(xì)胞定位中與EXOC2 相關(guān)程度最高的是轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物因子，雙鏈斷裂位點等；分子功能中與EXOC2相關(guān)程度最高的是GTP酶激活劑活性，3' - 5'外切酶活性，基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制結(jié)合，基礎(chǔ)RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄機(jī)制結(jié)合，外切酶活性等。KEGG富集到的通路主要有內(nèi)吞作用、同源重組、內(nèi)分泌等因子調(diào)節(jié)鈣重吸收、Hedgehog信號通路等。

2.9 磷酸化及修飾位點分析

結(jié)果顯示，EXOC2 蛋白共有81 個絲氨酸磷酸化位點，33個酪氨酸磷酸化位點，10個蘇氨酸磷酸化位點。MotifScan 分析EXOC2 蛋白共有70 個翻譯后修飾位點，包括1 個酰胺化位點、5 個N-糖基化位點、4 個cAMP 和cGMP 依賴性蛋白激酶磷酸化位點、25 個酪蛋白激酶II 磷酸化位點、14個N-豆蔻?；稽c、20個蛋白激酶C磷酸化位點和1個酪氨酸激酶磷酸化位點，見圖5。

圖5 EXOC2的磷酸化及修飾位點分析

3 討論

胞外囊復(fù)合物是一種多蛋白復(fù)合物，是胞外囊泡極化靶向細(xì)胞膜上特定對接位點所必需的。在高等真核生物中，外囊復(fù)合體的組成蛋白和功能已被證明是高度保守的［4-5］。至少有8種胞外復(fù)合物成分被發(fā)現(xiàn)與肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑和囊泡轉(zhuǎn)運機(jī)制相互作用，這種相互作用已被證明介導(dǎo)成纖維細(xì)胞中絲狀體的形成［6-7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，EXOC2 及其他外囊復(fù)合亞單位對神經(jīng)元功能至關(guān)重要，EXOC2發(fā)生變異時會導(dǎo)致患者神經(jīng)功能的障礙。該蛋白已被證明與GTPases 的Ral亞家族相互作用，從而通過將囊泡系在質(zhì)膜上介導(dǎo)胞吐選擇性剪接導(dǎo)致多個轉(zhuǎn)錄變體［9］。但EXOC2在Eg等寄生蟲中的研究尚未見報道。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對EXOC2 蛋白進(jìn)行分析，通過NCBI 獲得其氨基酸序列，利用一系列在線數(shù)據(jù)庫對其理化性質(zhì)、同源性及抗原表位等進(jìn)行了預(yù)測。這些有效信息的預(yù)測，也為EXOC2 蛋白成為包蟲病抗原肽疫苗的候選分子提供了可能性。研究［10］表明，與傳統(tǒng)疫苗相比，多肽疫苗的效果可能更安全更高效。

本研究利用生物信息學(xué)方法對EgEXOC2 蛋白的相關(guān)性質(zhì)及功能進(jìn)行了預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)EXOC2 蛋白具有較豐富的T、B 優(yōu)勢抗原表位，有可能成為抗原肽疫苗新的潛在靶點，研究結(jié)果期望能為包蟲病抗原肽疫苗的研制提供一定的理論基礎(chǔ)。