＊趙立成 劉艷飛 彭飛城

（1.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 湖南 410083 2.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 湖南 410001 3.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南 410001）

甲硫酸新斯的明化學(xué)名為N,N,N-三甲基-3-[(二甲氨基)甲酰氧基]苯銨甲基硫酸鹽，是一種常用異逆性抗膽堿酯酶藥，常用于內(nèi)科、婦科及五官科的各種弛緩麻痹、肌肉和神經(jīng)官能癥，如重癥肌無(wú)力、競(jìng)爭(zhēng)型肌松藥的過(guò)量中毒、陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速、手術(shù)后功能性腸脹氣及尿潴留等病的治療，也能發(fā)揮改善眼睛調(diào)節(jié)功能，減輕眼結(jié)膜充血的作用[1-3]。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道了甲硫酸新斯的明制劑的HPLC 法測(cè)定含量的方法[4-7]，但有關(guān)物質(zhì)研究測(cè)定報(bào)道很少。2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》（ChP 2020）[8]、USP 2022、EP 11.0 和JP 18 均有收載甲硫酸新斯的明質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

僅ChP 2020 和EP 11.0 甲硫酸新斯的明質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)置了有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)目，且二者色譜條件基本一致，但僅控制一個(gè)特定雜質(zhì)。此次試驗(yàn)建立了甲硫酸新斯的明原料藥有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定法，控制已知雜質(zhì)個(gè)數(shù)更多，專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、雜質(zhì)控制更全面，能更好地控制本品有關(guān)物質(zhì)。

1.試驗(yàn)部分

(1)試驗(yàn)試劑

甲硫酸新斯的明原料藥（批號(hào)：NS0010918、NS0010219、NS0010420，生產(chǎn)企業(yè)提供）；甲硫酸新斯的明對(duì)照品（批號(hào)：NEWS2101，純度100%）、雜質(zhì)A（批號(hào)：NSGM/AA249/3A(Hydroxy)/01，含量96.03%）、雜質(zhì)B（批號(hào)：NSGM/AA249/M-1520/01，含量99.88%）、雜質(zhì)C（批號(hào)：NSGM/AA249/2A/01，含量99.84%），均來(lái)自MSN Laboratoriies Private Limited；乙腈為色譜純，Honeywell。

(2)試驗(yàn)儀器

分析天平（XP205），梅特勒-托利多（中國(guó)）公司；液相色譜儀（Nexera LC-40），島津公司。

(3)試驗(yàn)方法

①液相色譜條件

色譜柱：Kromasil 100（250 mm×4.6 mm，5 mm）；檢測(cè)器：UV；柱溫：25.0 ℃；波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20μL；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：以緩沖液（取85% 磷酸2.0 mL，無(wú)水1-辛烷磺酸鈉鹽3.0 g，精密稱(chēng)定，用水溶解并稀釋至1000 mL，用10% 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 至4.3）為流動(dòng)相A。以緩沖液-乙腈（30:70）為流動(dòng)相B；梯度洗脫（0～2，60%A；2～10，60%A →15%A；10～15，15%A；15～15.5，15%A →60%A；15.5～22，60%A）。

②專(zhuān)屬性試驗(yàn)

空白溶劑（稀釋劑）：水-乙腈（95:5）。

甲硫酸新斯的明對(duì)照品的貯備液：取大約15 mg甲硫酸新斯的明對(duì)照品，精密稱(chēng)定之后，加入100 mL的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，使其溶解（必要時(shí)可超聲），放至室溫，并用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。

甲硫酸新斯的明對(duì)照品溶液：精密量取1 mL 配制的甲硫酸新斯的明對(duì)照品貯備液，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

雜質(zhì)A 的對(duì)照品貯備液：取大約15 mg 雜質(zhì)A 的對(duì)照品，精密稱(chēng)定之后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，振搖使其溶解（必要時(shí)可超聲），放至室溫后，再用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。

雜質(zhì)B 的對(duì)照品貯備液：取大約15 mg 雜質(zhì)B 的對(duì)照品，精密稱(chēng)定之后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，振搖使其溶解（必要時(shí)可超聲），放至室溫，并加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

雜質(zhì)C 的對(duì)照品貯備液：取大約15 mg 雜質(zhì)C 的對(duì)照品，精密稱(chēng)定之后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，振搖使其溶解（必要時(shí)可超聲），放至室溫，并加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液：稱(chēng)取大約15 mg 甲硫酸新斯的明對(duì)照品，精密稱(chēng)定之后，加入100 mL 的棕色量瓶中，精密加入雜質(zhì)B 的對(duì)照品貯備液10μL，加稀釋劑超聲溶解，然后再加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

系統(tǒng)適用性要求：對(duì)于系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖，新斯的明的峰與雜質(zhì)B 的峰之間的分離度不得小于3.0；新斯的明峰的理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000，拖尾因子應(yīng)不大于2.0。對(duì)照品溶液色譜圖中，新斯的明峰高的信噪比應(yīng)不小于50。

供試品溶液：取大約15 mg 供試品，精密稱(chēng)定后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入適量稀釋劑，振搖使其溶解。加入稀釋劑，稀釋至刻度，搖勻。

精密量取以上溶液各20μL，然后注入高效液相色譜儀，再記錄液相色譜圖。

③精密度與重復(fù)性

精密度試驗(yàn)供試品：選取專(zhuān)屬性項(xiàng)下甲硫酸新斯的明對(duì)照品溶液，按方法項(xiàng)下的液相色譜條件進(jìn)樣分析樣品，連續(xù)進(jìn)樣分析6 次，并記錄其高效液相色譜圖。

重復(fù)性試驗(yàn)供試品：取甲硫酸新斯的明原料藥約15 mg，精密稱(chēng)定后，加入100 mL 的棕色量瓶中，再加入稀釋劑使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻。同樣平行配制6 份。精密量取配制的溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，并記錄液相色譜圖。

④線性關(guān)系與校正因子考察

甲硫酸新斯的明對(duì)照品貯備液：取專(zhuān)屬性項(xiàng)下甲硫酸新斯的明對(duì)照品貯備液。

線性貯備液：精密量取專(zhuān)屬性試驗(yàn)項(xiàng)下甲硫酸新斯的明對(duì)照品貯備液、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 及雜質(zhì)C 對(duì)照品貯備液各為5 mL，置于50 mL 的量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述線性貯備液適量，加溶劑稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

精密量取上述線性溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，并記錄液相色譜圖。X 軸以濃度為坐標(biāo)，Y 軸以各成分相對(duì)應(yīng)峰面積為坐標(biāo)，繪制曲線進(jìn)行線性回歸。

⑤定量限與檢測(cè)限

精密量取“線性關(guān)系與校正因子考察”項(xiàng)下線性溶液1.3.4 進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)捶椒?xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量20μL，記錄色譜圖。

2.結(jié)果與討論

圖1 有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

（1）專(zhuān)屬性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：空白溶劑不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定；系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中甲硫酸新斯的明峰與雜質(zhì)B 峰之間的分離度為11.58，甲硫酸新斯的明峰的理論塔板數(shù)為13052，甲硫酸新斯的明峰拖尾因子為1.629；甲硫酸新斯的明對(duì)照品溶液峰高的信噪比為402.96，符合系統(tǒng)適用性要求。該方法專(zhuān)屬性良好。

（2）精密度與重復(fù)性試驗(yàn)。取甲硫酸新斯的明對(duì)照品溶液，以主峰面積計(jì)算精密度試驗(yàn)的RSD，結(jié)果為0.44%，表明方法的精密度良好。

圖2 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液色譜圖

取甲硫酸新斯的明原料藥，按方法項(xiàng)下平行地制備6 份供試品溶液，再按方法項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以甲硫酸新斯的明為對(duì)照，乘以相對(duì)校正因子以計(jì)算各雜質(zhì)的含量。從該6 份甲硫酸新斯的明原料藥中，均檢出已知雜質(zhì)A，且雜質(zhì)A 平均含量為0.001%（RSD=1.6%），而雜質(zhì)B 與雜質(zhì)C 均未檢出。其他單個(gè)雜質(zhì)平均含量為0.015%（RSD=2.6%）,各雜質(zhì)總和平均含量為0.024%（RSD=2.7%），方法的重復(fù)性良好。

（3）線性試驗(yàn)及校正因子考察。以濃度為X 軸，相應(yīng)的各成分峰面積為Y 軸繪制曲線，接著以各雜質(zhì)線性方程斜率與甲硫酸新斯的明線性方程斜率的比值計(jì)算相對(duì)校正因子。試驗(yàn)結(jié)果表明：甲硫酸新斯的明對(duì)照品、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 及雜質(zhì)C 的峰面積分別與其濃度具有良好的線性關(guān)系。

（4）定量限與檢測(cè)限。以各成分色譜峰信噪比為3時(shí)的濃度為檢測(cè)限，以各成分色譜峰信噪比為10 時(shí)的濃度為定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 甲硫酸新斯的明、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 及雜質(zhì)C 的線性關(guān)系、相對(duì)校正因子、定量限及檢測(cè)限結(jié)果

3.結(jié)論

本文建立了HPLC 法測(cè)定甲硫酸新斯的明原料藥的有關(guān)物質(zhì)，通過(guò)對(duì)方法專(zhuān)屬性、重復(fù)性、線性范圍、定量限與檢測(cè)限等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)研究，結(jié)果表明該方法靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，本文提供的方法可用于甲硫酸新斯的明的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定和質(zhì)量控制。

EP 11.0 甲硫酸新斯的明標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)采用加校正因子的主成分外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)的量，規(guī)定雜質(zhì)B不得過(guò)0.01%，其他未知單雜不得過(guò)0.10%，總雜不得過(guò)0.2%。2020 年版《中國(guó)藥典》按主成分自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)的量，規(guī)定雜質(zhì)A（標(biāo)準(zhǔn)中命名為雜質(zhì)Ⅰ）不得過(guò)1.0%，其他雜質(zhì)總和不得過(guò)0.5%，限度明顯寬于EP 11.0 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本試驗(yàn)通過(guò)線性試驗(yàn)及校正因子考察，得到各個(gè)已知雜質(zhì)的相對(duì)校對(duì)因子，雜質(zhì)A 與雜質(zhì)B 采用相對(duì)保留時(shí)間定位，解決了雜質(zhì)對(duì)照品較難獲得的問(wèn)題。采用加校正因子的主成分外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)的量，限度參考EP 11.0 標(biāo)準(zhǔn)，限度擬定為“雜質(zhì)A 不得過(guò)0.10%，雜質(zhì)B 不得過(guò)0.01%，雜質(zhì)C 不得過(guò)0.10%，其他單個(gè)雜質(zhì)不得過(guò)0.10%，各雜質(zhì)總和不得過(guò)0.20%”，要求較現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格，有助于更好地控制甲硫酸新斯的明原料質(zhì)量。本研究將為提高《中國(guó)藥典》中原料藥甲硫酸新斯的明系列品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要的依據(jù)和參考，也可用于其系列品種的質(zhì)量控制。