＊李芳 劉萬(wàn)蓮 高斌 劉楠

（寧夏泰益欣生物科技股份有限公司 寧夏 750205）

引言

泰萬(wàn)菌素被稱之為乙酰異戊酰泰樂(lè)菌素（3-acetyl-4"-isovalerytylosin，AIV），同時(shí)，也被稱為超級(jí)泰樂(lè)菌素，是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要是由耐熱鏈霉菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵后獲得，最初是由英國(guó)伊科動(dòng)物保健品有限公司發(fā)現(xiàn)的[1]。近年來(lái)，泰萬(wàn)菌素是由泰樂(lè)菌素發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的，用于生產(chǎn)的原料藥為泰樂(lè)菌素的酒石酸鹽。

泰萬(wàn)菌素因?qū)﹄u和豬的治療效果明顯，已成為畜牧業(yè)中常用的抗生素[2]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，泰萬(wàn)菌素在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上的銷量也在急劇增加，故在泰萬(wàn)菌素發(fā)酵過(guò)程中提升泰萬(wàn)菌素的效價(jià)是藥物發(fā)展的重要研究方向。

泰萬(wàn)菌素屬于泰樂(lè)菌素的衍生物，是動(dòng)物專用第三代大環(huán)內(nèi)脂類藥物，唯一能真正到達(dá)支氣管腔，殺滅支原體的藥物，其抗菌效價(jià)是泰樂(lè)菌素的5～10 倍，替米考星的2～5 倍；堿性側(cè)鏈能有效改變細(xì)胞內(nèi)pH值，抑制藍(lán)耳病病毒繁殖。用于畜禽支原體?。ㄘi喘氣病、雞慢呼）、豬藍(lán)耳病、豬增生性回腸炎、傳染性胸膜肺炎、鏈球菌病的防治。泰萬(wàn)菌素發(fā)酵生產(chǎn)菌產(chǎn)生的乙酰化酶和異戊?；?，可將泰樂(lè)菌素對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上的羥基進(jìn)行乙?；彤愇祯；铣商┤f(wàn)菌素。泰萬(wàn)菌素制劑作為一種新型專業(yè)獸用藥，具有抗菌譜廣、細(xì)菌耐藥性低、毒性低、殘留少等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)原廣泛使用的替米考星等同類制劑有一定的替代性，2018—2021 年，泰萬(wàn)菌素類產(chǎn)品行業(yè)產(chǎn)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，目前公司處于滿負(fù)荷生產(chǎn)狀態(tài)，相關(guān)產(chǎn)品供不應(yīng)求。

查閱文獻(xiàn)，近年來(lái)研究者們主要采用基因改造手段提高耐熱鏈霉菌的轉(zhuǎn)化能力，以提高泰萬(wàn)菌素的發(fā)酵單位[3]。發(fā)酵過(guò)程是為耐熱鏈霉菌提供豐富的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和適宜的生長(zhǎng)條件，包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、溫度、濕度及pH 等。

在泰萬(wàn)菌素生物合成過(guò)程中會(huì)先生成3-O-乙酰泰樂(lè)菌素或4"-O-異戊酰泰樂(lè)菌素等中間產(chǎn)物，再進(jìn)一步乙?；虍愇祯；铣商┤f(wàn)菌素，過(guò)程中會(huì)受到部分前體物質(zhì)供應(yīng)不足，造成泰萬(wàn)菌素合成過(guò)程受阻，最終導(dǎo)致泰萬(wàn)菌素發(fā)酵效價(jià)偏低。因此在泰萬(wàn)菌素發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加前體物質(zhì)是提高泰萬(wàn)菌素效價(jià)的有效方法之一[4]。

已有報(bào)道顯示發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)加小分子物質(zhì)可以有效促進(jìn)泰萬(wàn)菌素的合成，明顯提升其發(fā)酵效價(jià)[5]。經(jīng)查閱相關(guān)資料，乙酸、丙酸、丁酸等小分子酸為泰萬(wàn)菌素生物合成過(guò)程中的必要物質(zhì)。

基于上述理論基礎(chǔ)，本研究將乙酸、丙酸、丁酸補(bǔ)加至泰萬(wàn)菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察以上三種小分子酸對(duì)泰萬(wàn)菌素發(fā)酵效價(jià)的影響，同時(shí)探究了前體物質(zhì)的添加比例、周期、濃度對(duì)其效價(jià)的影響。

1.試劑與儀器

表1 所用原材料列表

表2 所用儀器設(shè)備列表

2.材料與方法

(1)材料

泰萬(wàn)菌素生產(chǎn)菌種由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

(2)方法

將泰萬(wàn)菌素種子液接種至種子罐中，待種子培養(yǎng)結(jié)束，達(dá)到移種的標(biāo)準(zhǔn)移入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，采用單因素分析法，探究發(fā)酵過(guò)程中分別添加前體物質(zhì)乙酸、丙酸、丁酸對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響，確定最優(yōu)添加物質(zhì)后，再探究添加比例分別為發(fā)酵液總體積的0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%時(shí)，添加周期分別為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 時(shí)，添加濃度分別為0.05 mol/L、0.15 mol/L、0.25 mol/L、0.35 mol/L、0.45 mol/L、0.55 mol/L 時(shí)對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響，從而確定前體物質(zhì)添加的最優(yōu)工藝。

3.結(jié)果與分析

(1)不同前體物質(zhì)添加種類對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

小分子物質(zhì)可以有效促進(jìn)泰萬(wàn)菌素的合成，常見(jiàn)的小分子酸有乙酸、丙酸和丁酸，本研究考察以乙酸、丙酸和丁酸三種短鏈脂肪酸為前體物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)[6]。探究前體物質(zhì)添加乙酸、丙酸和丁酸對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響。結(jié)果如表3 所示。

表3 不同前體物質(zhì)添加種類對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

由表3 可知，加入乙酸、丙酸、丁酸對(duì)泰萬(wàn)菌素的效價(jià)有顯著影響，其中加入乙酸后對(duì)泰萬(wàn)菌素的效價(jià)提升最為明顯，效價(jià)提升2.34%，故本文確定采用乙酸作為前體物質(zhì)進(jìn)行后續(xù)研究。

(2)不同添加比例對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

以乙酸作為前體物質(zhì)，不同的添加比例對(duì)泰萬(wàn)菌素的生物合成具有不同程度的影響，合適的添加比例會(huì)對(duì)泰萬(wàn)菌素生物合成反應(yīng)具有一定的促進(jìn)作用，若發(fā)酵過(guò)程中添加濃度過(guò)大，可能會(huì)導(dǎo)致菌絲斷裂及染菌，或?qū)铣捎幸种谱饔?；若添加濃度較低，會(huì)導(dǎo)致合成不徹底，原料反應(yīng)不完全[7]，故本次研究設(shè)計(jì)以發(fā)酵液總體積的0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%，6 個(gè)梯度添加比例進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)周期均為170 h?？疾觳煌砑颖壤龑?duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響。結(jié)果如表4、圖1 所示。

圖1 不同添加比例對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

表4 不同添加比例對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

由表4 和圖1 可知，乙酸添加比例對(duì)泰萬(wàn)菌素的效價(jià)有明顯的影響，效價(jià)整體的變化趨勢(shì)隨添加比例的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)添加比例達(dá)到1.0%時(shí)，效價(jià)達(dá)到頂峰為35872μg/mL；當(dāng)添加比例大于1.0%后，效價(jià)逐漸程呈下降趨勢(shì)。故以1.0%為最優(yōu)添加比例進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

(3)不同添加周期對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

前體物質(zhì)添加周期的長(zhǎng)短會(huì)影響泰萬(wàn)菌素的效價(jià)，添加時(shí)間太早，導(dǎo)致無(wú)法充分參與反應(yīng)，造成物質(zhì)積累，影響菌絲成長(zhǎng)；添加時(shí)間太晚導(dǎo)致生物合成時(shí)間較短，菌絲老化，反應(yīng)不完全[8]，恰當(dāng)?shù)奶砑訒r(shí)間會(huì)影響菌絲的生命活力，從而提高效價(jià)，故本次研究共設(shè)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，6 個(gè)添加周期進(jìn)行驗(yàn)證，考察最優(yōu)添加周期。如表5 所示。

表5 不同添加周期對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

由表5 可知，隨著添加周期的延長(zhǎng)泰萬(wàn)菌素效價(jià)呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，整體的變化呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且當(dāng)添加周期在72 h 時(shí)泰萬(wàn)菌素效價(jià)達(dá)到峰值為35372μg/mL，相比對(duì)照增加了2871μg/mL，但當(dāng)添加周期大于72 h 后，效價(jià)增長(zhǎng)相比對(duì)照較小，故以72 h 為最優(yōu)添加周期進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

(4)不同添加濃度對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

以72 h 添加乙酸進(jìn)行試驗(yàn)，篩選最優(yōu)的添加濃度，在泰萬(wàn)菌素的發(fā)酵過(guò)程中，以0.05 mol/L、0.15 mol/L、0.25 mol/L、0.35 mol/L、0.45 mol/L、0.55 mol/L 為試驗(yàn)濃度，考察不同添加濃度對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響，如表6 所示。

表6 不同添加濃度對(duì)泰萬(wàn)菌素效價(jià)的影響

由表6 可知，隨著添加濃度的增加，對(duì)泰萬(wàn)菌素的效價(jià)有積極影響，添加濃度在0.35% 時(shí)，泰萬(wàn)菌素效價(jià)達(dá)到峰值為35020μg/mL，相比對(duì)照增長(zhǎng)了2389μg/mL，但當(dāng)濃度＞0.35%時(shí)，泰萬(wàn)菌素的效價(jià)逐步下降，因此可以確定添加濃度為0.35%時(shí)，泰萬(wàn)菌素的效價(jià)達(dá)到最優(yōu)。

4.結(jié)論

綜上所述，通過(guò)泰萬(wàn)菌素的發(fā)酵工藝優(yōu)化，確認(rèn)添加前體物質(zhì)確實(shí)有助于提高泰萬(wàn)菌素的效價(jià)，本次研究主要是在泰萬(wàn)菌素發(fā)酵過(guò)程中，篩選出最優(yōu)的前體物質(zhì)添加工藝，確定乙酸作為最佳添加試劑，且添加比例為1.0%，在72 h 進(jìn)行添加，添加濃度為0.35%，此方法可有效提升泰萬(wàn)菌素效價(jià)，表明此工藝條件能有效提高泰萬(wàn)菌素的效價(jià)，為生產(chǎn)泰萬(wàn)菌素的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)，從而更好的滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求。