魏建明 曹湘玉 葉紫陽 楊 霞

湖南醫(yī)藥學(xué)院, 湖南省懷化市 418000

缺血性腦卒中(Ischemic stroke, IS)占腦卒中總數(shù)的70%～80%,具有高發(fā)病率、病死率、致殘率、復(fù)發(fā)率及年輕化趨勢等特點[1],已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。IS發(fā)生機制主要包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、鐵死亡、細(xì)胞焦亡等,其中炎癥反應(yīng)是關(guān)鍵機制之一。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞,在調(diào)控神經(jīng)炎癥方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明腦缺血再灌注損傷后,腦缺血區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活,加劇炎癥因子的釋放,導(dǎo)致腦缺血損傷導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[2]。Kruppel樣因子2(Kruppel-like factor 2,KLF2)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)域的核轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)合靶基因啟動子GC富含序列,調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)[3]。研究表明激活KLF2能抑制內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子、趨化因子的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用[4]。姜黃素(Curcumin)是姜黃根莖的主要生物活性成分,有天然的抗氧化性、抗炎特性和抑制凋亡等多種生物學(xué)功能[5]。研究證實姜黃素對IS具有神經(jīng)保護(hù)作用,但具體作用機制仍未明確[6]。本研究擬通過(Oxygen-Glucose Deprivation, OGD)模型模擬神經(jīng)元缺血缺氧環(huán)境誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞活化,觀察姜黃素對BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞損傷后的抗炎作用,探討KLF2是否介導(dǎo)姜黃素治療IS的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 BV2細(xì)胞。小鼠源性BV2細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫,批號SCSP-5208)。

1.1.2 試劑與儀器。 姜黃素(長沙鼎國生物技術(shù)有限公司),胎牛血清(美國Gibco公司),DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司),MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、ELISA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),KLF2-si RNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),Lipofectamine2000試劑(美國Invitrogen公司),KLF2抗體(abs124444)、p-NF-κB抗體(SAB4301496)、NF-κB抗體(SAB4502615);酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)、Forma Steri-Cycle型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。BV2細(xì)胞采用含4.5g/L葡萄糖和10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基在37℃、95%氧氣、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),觀察細(xì)胞密度達(dá)到約90%以上進(jìn)行消化,按1∶4比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 OGD建模及處理。將BV2細(xì)胞隨機分為正常培養(yǎng)的對照組(Control組)、氧糖剝奪模型組(OGD組)、姜黃素干預(yù)組(Cur組)。對照組在培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)細(xì)胞,模型組加入無糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、95%氮氣、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)2h,然后更換含糖DMEM培養(yǎng)基并置于37℃、5%CO2環(huán)境中孵育24h。姜黃素組在構(gòu)建OGD模型后采用不同濃度(1、5、10、20μmol/L)的姜黃素處理BV2細(xì)胞24h。

1.2.3 噻唑藍(lán) (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)檢測BV2細(xì)胞活力。 將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔細(xì)胞密度5×104個,每組各孔加入20μL的MTT溶液,37℃孵育4h,3 000r/min離心5min,吸取并棄去上清液,各孔再加150μL二甲基亞砜(DMSO)溶解,振蕩混勻10min,使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定其吸光度(OD)。細(xì)胞活力=(OD值實驗組-OD值空白組)/OD值空白組,其中OD值實驗組為實驗組的吸光度,OD值空白組為空白組的吸光度。

1.2.4 Western blot檢測KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達(dá)水平。將BV2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞密度為106個/孔,加入600μL細(xì)胞裂解液,冰上裂解5min, 用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞,收集于離心管中,4℃離心5min,取上清蛋白溶液,進(jìn)行蛋白定量檢測,采用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳后,切膠、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉2h,加入KLF2、p-NF-κB、NF-κB抗體(1∶1 000),4℃孵育過夜。用1×TBST洗膜3次,每次10min, 加入稀釋后的二抗溶液 (1∶5 000),室溫孵育1h,洗膜3次,用化學(xué)發(fā)光法分析儀顯影,使用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將BV2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞密度為106個/孔,24h后, 分別加入KLF2-siRNA或亂序-siRNA(SC-siRNA)孵育6h后,然后根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟,使用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行輔助轉(zhuǎn)染,37℃孵育24h,Western blot檢測KLF2表達(dá)水平,以評價干擾效果,β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6 ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β水平。吸取各組細(xì)胞上清液至離心管中,4℃ 2 000r/min離心5min,小心吸取上清,分裝后-20℃凍存。取出ELISA試劑盒平衡至室溫,按試劑盒內(nèi)說明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量姜黃素對OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活力的影響 為觀察姜黃素對OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的保護(hù)作用,我們將BV2細(xì)胞分為6組,分別為Control組、OGD組、OGD+1μmol/L Cur組、OGD+5μmol/L Cur組、OGD+10μmol/L Cur組、OGD+20μmol/L Cur組。MTT結(jié)果顯示(見表1):與Control組相比,OGD組BV2細(xì)胞活力顯著降低 (P<0.05),而與OGD組相比,OGD+10μmol/L Cur組、OGD+20μmol/L Cur組均可顯著升高BV2細(xì)胞活力 (P<0.05)。本研究還發(fā)現(xiàn),在姜黃素的濃度為10μmol/L時,細(xì)胞存活率最高。因此,本研究后續(xù)的實驗選擇姜黃素的濃度為10μmol/L。

表1 不同劑量姜黃素對OGD誘導(dǎo)的B V2細(xì)胞活力的影響

2.2 姜黃素可調(diào)控OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞KLF2、p-NF-κB、NF-κB的表達(dá) 為探索KLF2是否介導(dǎo)姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用,分別檢測Control組、OGD組和OGD+10μmol/L Cur組KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示 (見表2):與Control組相比,OGD組KLF2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),p-NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),而姜黃素可顯著增加OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞KLF2蛋白表達(dá)(P<0.05),降低p-NF-κB蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

表2 各組BV2細(xì)胞的KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達(dá)比較

2.3 姜黃素可降低OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平 為探討姜黃素在OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用機制,分別檢測Control組、OGD組和OGD+10μmol/L Cur組炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平,ELISA結(jié)果顯示(見表3):與Control組相比,OGD組炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平顯著升高(P<0.05),而姜黃素可顯著降低OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TNF-α、IL-1β的水平(P<0.05)。

表3 各組BV2細(xì)胞的TNF-α、IL-1β水平比較

2.4 KLF2- siRNA顯著逆轉(zhuǎn)了姜黃素對OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的保護(hù)作用 為進(jìn)一步研究KLF2在姜黃素保護(hù)OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中的作用,采用KLF2-siRNA干擾BV2細(xì)胞KLF2的表達(dá)以評價干擾效果。先將細(xì)胞分為3組,分別為Control組、KLF2-siRNA組和SC-siRNA組。Western blot結(jié)果顯示(見表4):與Control組相比,KLF2-siRNA可顯著下調(diào)細(xì)胞KLF2蛋白表達(dá)水平(P<0.05),SC-siRNA未對KLF2表達(dá)產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表4 各組BV2細(xì)胞的KLF2蛋白表達(dá)比較

隨后,我們將細(xì)胞分為5組,分別為Control組、OGD組、Cur+OGD組、KLF2-siRNA+Cur+OGD組、SC-siRNA+Cur+OGD組。Western blot結(jié)果顯示 (見表5) :與Control組相比,OGD組p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05),姜黃素組p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),KLF2-siRNA處理可顯著消除Cur對p-NF-κB表達(dá)的降低作用(P<0.05),SC-siRNA處理未對p-NF-κB表達(dá)產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。ELISA結(jié)果顯示(見表6):與Control組相比,OGD組炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平顯著升高(P<0.05),而姜黃素可顯著降低OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TNF-α、IL-1β的水平(P<0.05),KLF2-siRNA處理可顯著消除Cur對TNF-α、IL-1β水平的影響(P<0.05),SC-siRNA處理未對TNF-α、IL-1β的水平產(chǎn)生影響(P>0.05)。

表5 各組BV2細(xì)胞的KLF2、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達(dá)比較

表6 各組BV2細(xì)胞的TNF-α、IL-1β水平比較

3 討論

缺血性腦卒中(IS)是由于腦部血管內(nèi)發(fā)生缺血而造成大腦血液供應(yīng)中斷和能量提供不足,可促使神經(jīng)元發(fā)生不可逆性損傷壞死。目前主要通過靜脈溶栓及血管內(nèi)再通治療以挽救缺血區(qū)腦細(xì)胞并改善神經(jīng)功能,仍有部分患者遺留神經(jīng)功能障礙。研究表明[7-8],炎癥反應(yīng)是 IS的關(guān)鍵發(fā)病機制之一,而IS后炎癥反應(yīng)造成的神經(jīng)功能損傷與小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活密切相關(guān),而抑制炎癥反應(yīng)能保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞和改善神經(jīng)功能缺損,對IS的治療具有重要的意義。

據(jù)報道,姜黃素是姜黃的主要成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用,且具有親脂性,容易透過血腦屏障,有利于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,尤其是腦血管疾病的治療[9]。TNF-α、IL-1β是機體重要的促炎細(xì)胞因子,在炎癥和免疫中起關(guān)鍵作用。研究表明急性腦梗死患者血清TNF-α、IL-1β水平明顯增高,且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),提示TNF-α、IL-1β可用于急性腦梗死的程度判斷及預(yù)后評估[10-11]。研究表明[7],姜黃素能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及增殖,降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平,對腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。研究表明,姜黃素通過抑制Toll樣受體4(TLR4)及炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá),進(jìn)而降低MCAO大鼠腦梗死體積,改善神經(jīng)功能缺損起到腦保護(hù)作用。本研究顯示,姜黃素抑制ODG誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞TNF-α、IL-1β的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,與上述研究[7-8]報道一致。

KLF2是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和增殖等細(xì)胞應(yīng)激過程,參與多種疾病的病理生理發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)[12-13]急性腦梗死患者血清KLF2下降,隨著梗死面積增大,KLF2水平降低,且與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),表明血清KLF2水平是評估急性腦梗死的病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一。研究表明,在腦出血大鼠模型中,去泛素化酶USP11表達(dá)增高,抑制KLF2表達(dá),激活核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路,引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化,增強促炎介質(zhì)IL-1β、TNF-α的釋放,導(dǎo)致腦出血后炎癥[14],而下調(diào)USP11表達(dá),促進(jìn)KLF2表達(dá),能明顯減輕炎癥反應(yīng)。Shi 等[15]在大鼠肺組織纖維化模型中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)KLF2可減輕肺間質(zhì)的破壞和膠原增生,抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的合成與釋放,減輕炎癥反應(yīng),改善肺組織纖維化和肺組織損傷。研究表明[16],姜黃素能抑制豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)的增殖和成脂分化作用與其增加KLF2 mRNA的表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,姜黃素能上調(diào)KLF2表達(dá),抑制炎癥因子的釋放;而下調(diào)KLF2表達(dá),姜黃素產(chǎn)生的上述保護(hù)作用也隨之消失。由此可見,KLF2可能介導(dǎo)了姜黃素對OGD誘導(dǎo)BV2細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白,參與調(diào)節(jié)腦缺血缺氧后炎癥反應(yīng)并釋放促炎細(xì)胞因子、趨化因子及黏附分子等[17]。徐飛飛等[2]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血時小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB被激活后,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的合成和釋放增加,同時這些促炎細(xì)胞因子又可以激活NF-κB,從而使該過程在腦細(xì)胞間不斷擴(kuò)散,加重炎癥反應(yīng)。研究表明[18]KLF2能直接與p300及其相關(guān)因子PCAF相互作用來抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗炎作用[19-20]。有研究證實[21],姜黃素通過抑制NF-кB的激活以減輕阿爾茨海默病(AD)大鼠大腦中的炎性反應(yīng),提高其學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果顯示,姜黃素上調(diào)KLF2表達(dá),降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的水平,可能是通過抑制NF-κB信號通路來實現(xiàn)對神經(jīng)元缺血缺氧損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。另有研究表明[22]姜黃素減輕腦梗死后炎癥反應(yīng),其機制可能與其阻斷NLRP3/Caspase-1信號通路有關(guān)。結(jié)合本研究和其他學(xué)者的研究,可以確定姜黃素能通過多種信號通路對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述,姜黃素對OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,可能是通過上調(diào)KLF2,抑制NF-κB信號通路,降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平,以減輕腦缺血再灌注損傷。本研究為探索姜黃素的現(xiàn)代應(yīng)用提供新靶點,也為IS治療提供理論支持、實驗依據(jù)及帶來臨床應(yīng)用前景。