沈宇涵 王 冰 趙 堃 武 昊 王 凇 嚴(yán) 昆 楊 薇

目前超聲引導(dǎo)下射頻消融已廣泛應(yīng)用于肝腫瘤的治療，尤其對最大徑≤3 cm 的肝細(xì)胞癌、肝轉(zhuǎn)移癌具有根治性效果［1-4］。腫瘤較大和邊界不清晰是射頻消融后早期復(fù)發(fā)的危險因素［5］，部分患者由于肝炎、肝硬化背景或轉(zhuǎn)移癌灶經(jīng)化療、放療后，二維超聲圖像上病灶顯示不清或邊界模糊，導(dǎo)致消融過程中超聲難以精準(zhǔn)定位腫瘤，常需結(jié)合超聲造影、CT 或MRI 等影像學(xué)檢查。由于腫瘤呈浸潤性生長，為確保消融范圍達(dá)到安全邊界［6-8］，較大的腫瘤常需進(jìn)行重疊消融，但首次消融過程中產(chǎn)生的氣體在二維超聲圖像中呈團(tuán)狀強回聲，可使殘余腫瘤顯示不清，導(dǎo)致再次布針時精準(zhǔn)定位腫瘤邊界更為困難。若能在超聲引導(dǎo)下射頻消融肝腫瘤時直接于腫瘤邊緣微創(chuàng)并便捷地植入顯示清晰、持久的定位標(biāo)記物，則可指導(dǎo)適形消融腫瘤。腫瘤放療時可在CT或MRI引導(dǎo)下利用基準(zhǔn)標(biāo)記定位腫瘤，具有良好的可行性且嚴(yán)重并發(fā)癥極少［9-13］，由此推測探尋二維超聲可顯示的定位標(biāo)記物并植入肝內(nèi)，有望實現(xiàn)射頻消融術(shù)前準(zhǔn)確標(biāo)記腫瘤安全范圍，并進(jìn)一步在消融過程中指導(dǎo)較大腫瘤重疊消融。本實驗旨在探討不同狀態(tài)材料作為射頻消融術(shù)中腫瘤位置及安全邊界參照的可行性，從而實現(xiàn)直觀定位腫瘤、精準(zhǔn)指導(dǎo)消融范圍以實時引導(dǎo)布針，保障治療的準(zhǔn)確性。

材料與方法

一、標(biāo)記物材料

本實驗納入24種醫(yī)用材料作為標(biāo)記物（表1）。其中氣體材料使用空氣。固體材料中金屬使用22 G 穿刺針芯分別制成長度為1 mm、3 mm、5 mm的短棒狀標(biāo)記物。液體材料中，碘油+碳酸氫鈉混合溶液由碘油與碳酸氫鈉以2∶1 比例配置；聲諾維（SonoVue?，注射用六氟化硫微泡，意大利博萊科公司）每瓶使用5 ml生理鹽水配制；聲諾維-F127 配置方法為預(yù)冷Pluronic F127 溫敏凝膠及注射器，注射前每瓶聲諾維于冰上使用5 ml溶液相Pluronic F127溶解；無水乙醇+透明質(zhì)酸鈉混合溶液由無水乙醇與透明質(zhì)酸鈉溶液以2∶1比例配置。

表1 24種不同狀態(tài)標(biāo)記物材料

二、實驗儀器、對象及方法

1.儀器：體外實驗的超聲引導(dǎo)使用GE Logiq E9彩色多普勒超聲診斷儀，9L線陣探頭，頻率2～8 MHz；動物實驗的超聲引導(dǎo)使用飛依諾VINNO 8便攜式彩色多普勒超聲診斷儀，X4-12L 線陣探頭，頻率4～12 MHz。射頻消融使用LDRFT-50 射頻治療儀（綿陽立德電子技術(shù)有限公司），體外實驗使用RFDJ-03 單針電極；動物實驗使用RFDJ-01單針電極。

2.體外實驗：將新鮮離體牛肝置于貼附負(fù)極電極片的容器中，應(yīng)用二維超聲掃查全肝，選取無裂隙或韌帶處并于超聲引導(dǎo)下穿刺進(jìn)針，深度約3～5 cm。其中固體標(biāo)記物使用20 G 穿刺針穿刺植入，大小適于穿刺針內(nèi)徑；氣體、液體標(biāo)記物使用2 ml 注射器連接已除去針芯的20 G穿刺針注射植入，注射量0.2 ml，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，本實驗采用中等、勻速推注氣體、液體標(biāo)記物。然后連接射頻治療儀，電極針尖長度設(shè)置為1 cm，于超聲引導(dǎo)下避開肝臟大血管穿刺，依次以消融電極針距標(biāo)記物垂直距離1.0 cm、0.5 cm 及消融電極針緊貼標(biāo)記物由遠(yuǎn)及近進(jìn)行單電極針消融。設(shè)置參數(shù)為定時模式，輸出功率45 W，消融時間2 min。超聲引導(dǎo)及穿刺過程均由同一操作者完成，每種材料植入及消融時盡量保證入針角度一致。

3.動物實驗：選取8 只健康雌性比格犬，體質(zhì)量13～16 kg［北京芳元緣養(yǎng)殖場，許可證號：SCXK（京）2020-0001］，本實驗獲得機構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會的批準(zhǔn)。比格犬射頻消融前禁食12 h，肌肉注射鹽酸氯胺酮（20 mg/kg，西南藥業(yè)股份有限公司）麻醉充分后將犬左側(cè)臥位放置于操作臺上固定，對右側(cè)腹部及后肢剃毛，將電極板貼附于右后肢皮膚上。消毒右側(cè)腹部皮膚，超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺于肝內(nèi)植入標(biāo)記物，30 min 后采用單針經(jīng)皮穿刺插入消融電極針，于針尖距標(biāo)記物垂直距離1 cm 處進(jìn)行消融，設(shè)置消融參數(shù)為直徑模式1 cm。

三、觀察內(nèi)容

1.標(biāo)記物的超聲可視性及持久性：①超聲可視性通過觀察二維超聲圖像中標(biāo)記物植入肝內(nèi)后回聲強度、與周圍肝實質(zhì)對比度、邊緣是否清晰進(jìn)行評價，本實驗將標(biāo)記物與周圍肝實質(zhì)對比明顯且邊界清晰判為超聲可視性良好。②持久性通過觀察標(biāo)記物在植入原位的形狀、回聲強度、范圍隨時間的變化情況進(jìn)行評價，空氣及固體標(biāo)記物均能夠在植入原位保存1 h以上、液體標(biāo)記物能夠在植入原位保存10 min 以上即為持久性良好。

2.體外實驗中觀察射頻熱場對標(biāo)記物的影響：分別于射頻消融后即刻及20 min 后觀察標(biāo)記物形狀、范圍、回聲強度變化，以及標(biāo)記物與射頻強回聲區(qū)的位置關(guān)系、可否快速辨認(rèn)標(biāo)記物位置。

3.動物實驗觀察射頻熱場對標(biāo)記物的影響并評估其安全性：分別于標(biāo)記物植入即刻、5 min、30 min 觀察其位置是否隨呼吸移動及其在體內(nèi)回聲變化。觀察實驗犬肝血流灌注和射頻熱場對標(biāo)記物持久性的影響；射頻消融后觀察實驗犬并發(fā)癥發(fā)生情況，于消融后第7 天復(fù)查超聲觀察實驗犬肝內(nèi)標(biāo)記物及肝組織情況；然后處死實驗犬，以與針道平行的切面多斷面剖開犬肝，評估標(biāo)記物與消融灶的關(guān)系及肝組織損傷情況。

結(jié)果

一、體外實驗評估標(biāo)記物的超聲可視性及持久性

1.超聲可視性：①空氣在二維超聲圖像中呈橢圓形強回聲，超聲可視性良好。②固體標(biāo)記物中，吸收性明膠海綿、碳酸氫鈉、金屬、聚乙醇酸（PGA）可吸收手術(shù)縫線在二維超聲圖像中均呈強回聲，邊緣清晰，形狀規(guī)則，超聲可視性均良好，且不同長度金屬的成像效果不同，3 mm、5 mm 金屬較1 mm 金屬的彗星尾征更明顯；塑料在二維超聲圖像中未見顯示。③液體標(biāo)記物中，海藻酸鈣、50%高滲葡萄糖、聚桂醇、PEG400、無水乙醇在二維超聲圖像中均呈類圓形或片狀偏強回聲；聲諾維及聲諾維-F127 在二維超聲圖像中均呈強回聲，且后者形狀更規(guī)則，不易隨探頭加壓流動；超聲耦合劑在二維超聲圖像中呈邊界清晰的低或無回聲，以上標(biāo)記物超聲可視性均良好；還原型谷胱甘肽溶液二維超聲圖像中未見顯示；其余液體標(biāo)記物與肝實質(zhì)回聲差異較小或回聲不均勻，邊界不清晰，形狀不規(guī)則，超聲可視性較差。見圖1。

圖1 不同材料標(biāo)記物植入離體牛肝即刻二維超聲圖

2.持久性：空氣及固體標(biāo)記物中的吸收性明膠海綿、PGA 可吸收手術(shù)縫線、5 mm 金屬均能在植入原位保存1 h 以上，持久性均良好。液體標(biāo)記物中，聲諾維-F127、海藻酸鈣、超聲耦合劑、聚桂醇靜置10 min后變化不明顯，持久性均良好；碳酸氫鈉、50%高滲葡萄糖、碘油+碳酸氫鈉溶液、基質(zhì)膠、無水乙醇、PEG400及卡波姆940 雖可見顯影，但標(biāo)記范圍縮小，形狀變化較大；其余液體標(biāo)記物靜置10 min 后二維超聲圖像中顯影不明顯，不易快速辨認(rèn)。

二、體外實驗中射頻熱場對標(biāo)記物的影響

根據(jù)離體牛肝實驗結(jié)果，選擇超聲可視性及持久性均良好的標(biāo)記物（空氣、吸收性明膠海綿、PGA 可吸收手術(shù)縫線、5 mm金屬、聲諾維-F127、海藻酸鈣、超聲耦合劑、聚桂醇）進(jìn)行射頻消融。結(jié)果顯示，5 mm金屬、海藻酸鈣在消融后即刻及20 min后均仍可見彗星尾征或后方回聲衰減，可與消融區(qū)氣體的強回聲區(qū)分（圖2）；其余標(biāo)記物在消融電極針垂直距離距其1.0 cm、0.5 cm 消融時可見，在消融電極針緊貼標(biāo)記物消融時被團(tuán)狀強回聲覆蓋，二維超聲圖像中不能辨別標(biāo)記物位置。

圖2 不同材料標(biāo)記物植入離體牛肝射頻消融后二維超聲圖

三、動物實驗評估標(biāo)記物的超聲可視性及持久性

經(jīng)體外實驗篩選并考慮到材料的安全性，于實驗犬肝內(nèi)植入空氣、PGA可吸收手術(shù)縫線、5 mm金屬、超聲耦合劑4種標(biāo)記物。各標(biāo)記物超聲表現(xiàn)與體外實驗一致，其中空氣、PGA可吸收手術(shù)縫線、5 mm金屬均呈強回聲，超聲耦合劑呈低回聲。標(biāo)記物隨呼吸時肝臟的移動而相對肝外結(jié)構(gòu)移動，但在肝內(nèi)的相對位置保持不變。4 種標(biāo)記物在植入5 min 及30 min 時，其形狀、回聲強度與植入后即刻比較無明顯變化。實驗犬肝血流灌注、呼吸均未對標(biāo)記物植入過程及超聲成像產(chǎn)生明顯影響，各標(biāo)記物的超聲可視性及持久性均良好。見圖3。

圖3 不同材料標(biāo)記物植入實驗犬肝即刻、5 min、30 min二維超聲圖

四、動物實驗中射頻熱場對標(biāo)記物的影響及其安全性評估

1.射頻熱場對標(biāo)記物的影響：消融后即刻二維超聲示實驗犬肝內(nèi)空氣、PGA 可吸收手術(shù)縫線、5 mm 金屬、超聲耦合劑均可見，消融灶直徑為（1.13±0.06）cm，標(biāo)記物距消融電極針約0.5 cm。消融后第7 天二維超聲示5 mm 金屬仍清晰顯示，周圍肝組織無明顯改變；植入PGA 可吸收手術(shù)縫線處回聲增強且范圍較前擴(kuò)大；植入空氣、超聲耦合劑處均未見顯影。見圖4。

圖4 不同材料標(biāo)記物植入實驗犬肝射頻消融后即刻、第7天二維超聲圖

2.標(biāo)記物的安全性：4 種標(biāo)記物穿刺植入過程中實驗犬呼吸、心跳平穩(wěn)，消融后7 d 內(nèi)均未發(fā)生出血、感染等并發(fā)癥，超聲檢查均未見肝前區(qū)出血及大血管損傷。消融第7 天處死實驗犬，犬肝大體標(biāo)本示5 mm金屬肉眼可見，PGA 可吸收手術(shù)縫線肉眼未能確認(rèn)標(biāo)記位置；病理組織學(xué)檢查示標(biāo)記物植入處周圍未見炎癥、出血等肝組織損傷性反應(yīng)。見圖5。

圖5 實驗犬肝消融灶切面大體圖及肝組織病理圖

討 論

超聲引導(dǎo)下射頻消融肝腫瘤具有微創(chuàng)、安全、有效的優(yōu)勢，目前在臨床的應(yīng)用逐漸廣泛。肝腫瘤進(jìn)行射頻消融時，消融不完全的腫瘤可通過自噬逃逸［14］、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［15］、增加腫瘤細(xì)胞干性［16］等多種機制促進(jìn)其在肝內(nèi)局部或全身復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［17-19］，因此進(jìn)行根治性治療時需達(dá)到完全消融，這要求對腫瘤精確定位并保證消融安全范圍充分，避免因消融布針偏移導(dǎo)致不完全消融，尤其是對體積較大、邊界不清晰、形態(tài)不規(guī)則的肝腫瘤更需確保消融區(qū)完全覆蓋腫瘤［20］。放療中使用的基準(zhǔn)標(biāo)記在影像學(xué)檢查時可保持?jǐn)?shù)月內(nèi)清晰顯像且位置穩(wěn)定，已有學(xué)者［21-22］嘗試在CT引導(dǎo)下于肝腫瘤邊緣植入線圈或金標(biāo)等市售基準(zhǔn)標(biāo)記，并對化療后消失的肝轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行隨訪。近年來研究［23-25］證實液體標(biāo)記物較金屬標(biāo)記物可減少成像產(chǎn)生的偽影，并提高患者接受度，但尚無研究探討在超聲檢查中使用基準(zhǔn)標(biāo)記定位腫瘤的可行性。本實驗探索性分析了24種醫(yī)用材料的超聲可視性及持久性，旨在尋找價廉、植入簡單、獲取便利的標(biāo)記物，以實現(xiàn)超聲引導(dǎo)下射頻消融術(shù)中精準(zhǔn)標(biāo)記腫瘤安全邊界，從而指導(dǎo)消融范圍及布針。

本實驗結(jié)果顯示，在標(biāo)記物植入的便捷程度方面，固體材料中吸收性明膠海綿、碳酸氫鈉難以進(jìn)入穿刺針內(nèi)；液體材料中超聲耦合劑成分為高分子聚合物水凝膠，透聲性、穩(wěn)定性及可注射性均較好，是超聲定位的理想標(biāo)記物，動物實驗也表明其在消融后即刻的超聲可視性尚可，但其成分復(fù)雜尚不能直接應(yīng)用于人體，后續(xù)充分驗證耦合劑成分安全性后有望作為肝內(nèi)標(biāo)記物。同時，本實驗通過探索其他單一成分凝膠類材料發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)膠和甲基纖維素黏度較大，抽吸時易混入氣泡且注射阻力較大，導(dǎo)致完成單處標(biāo)記耗時長，形成的標(biāo)記回聲不均；新型材料中海藻酸鈣安全、無毒且成本相對低，多作為促進(jìn)傷口愈合的可生物降解材料［26-27］，植入離體牛肝內(nèi)后超聲成像效果穩(wěn)定，且不易受消融熱場的影響；Pluronic F127 溫敏凝膠的特性為低溫時為可注射溶液，20℃～30℃時轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，黏度增大，且該過程可逆，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)凝膠態(tài)Pluronic F127對造影劑微泡的原位固定性能優(yōu)于生理鹽水，但目前海藻酸鈣和Pluronic F127僅用于皮下、肌肉等局部遞送給藥，需進(jìn)一步驗證其在肝組織內(nèi)注射的安全性［28］。體外實驗和動物實驗結(jié)果均表明，5 mm金屬在二維超聲圖像中可見彗星尾征，與周圍組織較易辨別，且超聲可視化效果不受消融熱場的影響，可作為腫瘤邊界的長期理想標(biāo)記物，但由于植入后無法取出，可能存在著潛在的醫(yī)源性損傷問題，有待進(jìn)一步探究價廉且更安全的金屬標(biāo)記物。PGA 可吸收手術(shù)縫線的超聲可視性良好，較液體材料形狀固定，且動物實驗發(fā)現(xiàn)消融后第7 天標(biāo)記處回聲增強、范圍稍增大，可能為組織吸收引起的局部機化所致，可進(jìn)一步深入探究液-固相變可吸收性聚合物材料作為標(biāo)記物。此外，本實驗將空氣注射植入離體牛肝和實驗犬肝作為定位標(biāo)記物，二維超聲示其呈團(tuán)狀強回聲，易與肝內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)分并穩(wěn)定持續(xù)顯影，射頻消融后即消散，引起排斥反應(yīng)的可能性較低，通過改進(jìn)注射方法并控制標(biāo)記物形狀一致性，有望作為肝腫瘤射頻消融術(shù)的超聲定位標(biāo)記物。

本實驗中離體牛肝射頻消融結(jié)果顯示，當(dāng)標(biāo)記物距消融電極針垂直距離為0.5 cm 及以上時，二維超聲圖像中可清晰顯示其回聲；當(dāng)標(biāo)記物緊貼消融電極針尖時，消融后即刻因被團(tuán)狀強回聲覆蓋，二維超聲圖像中不能準(zhǔn)確定位。提示于腫瘤邊界外0.5 cm處進(jìn)行標(biāo)記，射頻消融后標(biāo)記物消失則表明消融灶邊界達(dá)到安全范圍。此外，較大的腫瘤單次布針可導(dǎo)致消融不完全，此時可利用標(biāo)記物指導(dǎo)重疊消融布針，即先于距腫瘤邊界1.0 cm 處進(jìn)行標(biāo)記，首次布針消融后參照標(biāo)記物再次布針，通過測量消融區(qū)邊界距標(biāo)記物的距離可以評估消融安全范圍是否充分。近年來，多模態(tài)影像融合技術(shù)及導(dǎo)航系統(tǒng)逐漸應(yīng)用于肝腫瘤的定位［29-31］，其通過融合CT或MRI圖像指導(dǎo)超聲引導(dǎo)下介入治療，但目前臨床工作中消融肝腫瘤時受肝臟硬度、患者體位變化、呼吸幅度及麻醉深度的影響，多模態(tài)影像融合技術(shù)仍有一定的融合定位誤差，且圖像質(zhì)量受圖像配準(zhǔn)技術(shù)的影響，需進(jìn)行多次CT或MRI檢查及較長時間的圖像處理，在圖像對位以保證融合準(zhǔn)確度時操作復(fù)雜且耗時較長。根據(jù)本實驗結(jié)果推測，與超聲造影、多模態(tài)影像融合技術(shù)及體表定位標(biāo)記相比，肝內(nèi)標(biāo)記更加簡便、直接、可實時顯示，不僅有助于辨別腫瘤位置，還方便比對消融后消融灶邊界在指定徑線上是否達(dá)到安全范圍，標(biāo)記點位及數(shù)量亦可根據(jù)腫瘤位置靈活選擇，更有助于指導(dǎo)臨床適形消融肝腫瘤。

本實驗的局限性：①雖然體外實驗中探索了24種醫(yī)用材料，但仍未全面覆蓋潛在可用的材料，今后仍需進(jìn)一步積累；②動物實驗中犬肝病理檢查時并未發(fā)現(xiàn)二維超聲圖像顯示的PGA 可吸收手術(shù)縫線及5 mm金屬標(biāo)記處，需進(jìn)一步優(yōu)化病理取材方法，根據(jù)臨床實際操作情況進(jìn)行精確的模擬以提供詳細(xì)數(shù)據(jù)。

綜上所述，本實驗探索了超聲可視化定位標(biāo)記物的材料選擇，發(fā)現(xiàn)空氣在二維超聲圖像中顯示清晰且持久，材料容易獲取，控制注射速度及注射量等有望作為臨床應(yīng)用的定位標(biāo)記物，以指導(dǎo)適形消融肝腫瘤；超聲耦合劑和聲諾維-F127 在二維超聲圖像中與肝實質(zhì)回聲差異明顯，作為肝內(nèi)標(biāo)記物可能成為其臨床新用途；金屬在消融后能穩(wěn)定保留，可作為肝腫瘤長期定位的理想標(biāo)記，為臨床精準(zhǔn)定位腫瘤及指導(dǎo)射頻消融布針提供指導(dǎo)。