田 勝 吳 偉

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006）

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是由軀體神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的一種復(fù)雜的慢性疼痛，主要表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、觸誘發(fā)性疼痛、痛覺過敏和感覺異常等特點(diǎn)[1]。NP 也是最難治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，其患病率為3.3%～8.2%，我國目前NP 病人高達(dá)9000 萬[2]。長期的疼痛嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，且易合并睡眠障礙、焦慮、抑郁等疾病，給病人家庭及社會帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。中樞敏化和外周敏化共同參與NP 的發(fā)生發(fā)展，其中神經(jīng)元過度興奮以及神經(jīng)免疫細(xì)胞的功能失調(diào)改變了傷害性信號的傳導(dǎo)和處理，最終導(dǎo)致痛閾降低[3]。然而，目前的治療方法僅能緩解病人的疼痛癥狀，未能從NP 的病理機(jī)制上解決疼痛問題。因此，探究NP 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，不僅有利于加深對疼痛本質(zhì)的認(rèn)識，也對疼痛病人的臨床診治具有極其重要的意義。

細(xì)胞死亡普遍存在于多種病理生理過程中，細(xì)胞死亡形式主要包括細(xì)胞凋亡、鐵死亡、細(xì)胞壞死、內(nèi)源性死亡、壞死性凋亡等。除壞死與凋亡兩種常見的死亡形式外，隨著研究的不斷發(fā)展，細(xì)胞焦亡也引起了廣泛的關(guān)注，不同于其他細(xì)胞死亡形式，細(xì)胞焦亡是一種由核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體(NODlike receptor, NLR)炎癥小體介導(dǎo)的促炎性程序性細(xì)胞死亡方式，表現(xiàn)為細(xì)胞持續(xù)腫脹直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量促炎因子的釋放進(jìn)而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡在NP 發(fā)展中扮演重要角色，其機(jī)制可能是通過炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)神經(jīng)元致敏，以及影響神經(jīng)損傷修復(fù)和神經(jīng)元突觸可塑性[4]。因此，積極探討NP 中誘發(fā)細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制，從而抑制細(xì)胞焦亡過程可能是疼痛相關(guān)疾病一種有效的治療策略。但目前關(guān)于細(xì)胞焦亡在NP 中作用的相關(guān)研究比較分散，缺少系統(tǒng)性的綜述?；诖?，本文就近年來細(xì)胞焦亡在NP 中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為深入了解NP 的分子機(jī)制提供新見解，為未來鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)提供新方向。

一、細(xì)胞焦亡的激活因素

1.K+外流

K+外流已經(jīng)被確定為NLRP3 炎癥小體激活的一個常見因素。Perregaux 等[5]首次報道了鉀離子誘導(dǎo)脂多糖處理后的小鼠巨噬細(xì)胞中Pro-IL-1β 的成熟。研究發(fā)現(xiàn)，P2X7R 是一種由鉀離子為載體和三磷酸腺苷介導(dǎo)的配體門控離子通道，可通過K+外流來激活炎癥小體的組裝，并激活Caspase-1 放大促炎信號[6]。在糖尿病小鼠牙周炎模型和脂多糖處理的巨噬細(xì)胞模型中，過表達(dá)P2X7R 通過K+外流增加細(xì)胞膜的通透性，增加細(xì)胞焦亡的發(fā)生[7]。隨后的研究進(jìn)一步證明了K+外流在激活NLRP3 炎癥小體過程中的重要性。Pétrilli 等[8]研究表明，細(xì)胞外高濃度的K+可抑制NLRP3 炎癥小體的活化，但不能抑制AIM2 或NLRC4 的活化。因此，有理由推測，K+大量外流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度過低可能是介導(dǎo)NLRP3 炎癥小體激活的原因。

2.鈣離子信號

Feldmeyer 等[9]報道，Ca2+螯合劑 BAPTA-AM可以抑制IL-1β 的分泌，表明Ca2+信號可能參與了NLRP3 炎癥小體的激活。當(dāng)NLRP3 炎癥小體被激活時，NLRP3 活化會導(dǎo)致Ca2+動員。而抑制Ca2+信號只能阻斷NLRP3 炎癥小體的激活，對AIM2和NLRC4 炎癥小體的激活卻沒有明顯影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER) 是一個重要的Ca2+儲存庫，對NLRP3 的活化至關(guān)重要。藥物抑制或敲除ER 中的1, 4, 5-三磷酸肌醇受體(inositol 1, 4,5-triphosphate receptor, IP3R)可以減少Ca2+的動員并抑制NLRP3 的激活[10]。這些研究結(jié)果表明ER在NLRP3 激活機(jī)制中的關(guān)鍵作用。根據(jù)Lee 等[10]的研究，Ca2+動員和NLRP3 的激活是由G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)和鈣傳感受體(calcium-sensing receptor, CASR)引發(fā)的。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體的激活可能并不需要Ca2+信號[11]。因此，關(guān)于Ca2+信號在NLRP3激活中的主要功能尚需進(jìn)一步研究。

3.活性氧和線粒體功能失調(diào)

關(guān)于活性氧(reactive oxygen species, ROS) 和線粒體功能對激活NLRP3 炎癥小體的作用，長期以來一直存在爭議。根據(jù)藥學(xué)抑制劑相關(guān)研究，NADPH 氧化酶催化產(chǎn)生的細(xì)胞質(zhì)ROS 以前被認(rèn)為是NLRP3 炎癥小體激活的常見信號[12]。然而，在缺乏NADPH 氧化酶的小鼠巨噬細(xì)胞和人類外周血單核細(xì)胞中，可以觀察到NLRP3 炎癥小體的非典型激活。此外，破壞線粒體功能會促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的激活。同時，研究發(fā)現(xiàn)ROS 抑制劑會影響NLRP3 激活的起始階段。進(jìn)一步研究表明，抑制ROS 可阻止IL-18/1β 的分泌和Caspase-1 的激活。Bae 等[13]觀察到，氧化還原條件的變化會使NLRP3 的PYD 結(jié)構(gòu)域和核苷酸結(jié)合位點(diǎn)之間的二硫鍵結(jié)構(gòu)受到影響。這一結(jié)果表明，ROS 可通過影響二硫鍵來激活NLRP3 炎癥小體。不過，線粒體功能失調(diào)在激活NLRP3 炎癥小體過程中的確切分子機(jī)制尚不清楚。然而，目前多認(rèn)為ROS 可能是引發(fā)細(xì)胞焦亡和NLRP3 激活的關(guān)鍵因素，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

4.溶酶體滲漏

既往一項(xiàng)研究表明當(dāng)細(xì)胞顆粒碎片破壞溶酶體膜并將組織蛋白酶B 釋放到細(xì)胞質(zhì)時，NLRP3 炎癥小體就會被激活[14]。此外，吞噬的晶體會誘導(dǎo)溶酶體損傷，釋放半胱氨酸蛋白酶B (cysteine cathepsin B,CTSB)，進(jìn)而激活NLRP3 炎癥小體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體的激活并非是由于晶體的存在所致，而是溶酶體膜破裂所致。Wang 等[15]的研究表明，CTSB 的缺失會顯著抑制NLRP3 的激活。并且，CTSB 抑制劑CA-074-Me 可通過阻斷多種組織蛋白酶來抑制 NLRP3 的活化。

二、細(xì)胞焦亡的分子途徑

細(xì)胞焦亡又稱細(xì)胞炎性壞死，形態(tài)學(xué)特征主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜上形成2 nm 左右的小孔，導(dǎo)致胞內(nèi)鉀離子外流造成細(xì)胞逐漸脹大至胞膜破裂，進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)容物釋放到胞外，引起免疫細(xì)胞浸潤以及周圍細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，最終加重組織的損傷[16]。一般來說，根據(jù)不同的Caspase 分子類型和刺激信號，將依賴于Caspase-1 的分子途徑稱為經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑；而Caspase-1 非依賴的分子途徑則是由人類的Caspase-4 和Caspase-5 或小鼠的Caspase-11 誘導(dǎo)，稱為非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑。

在經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中，一系列炎癥小體識別受體和Caspase-1 的激活會誘發(fā)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。炎癥小體通常由NLR 家族的上游傳感器蛋白、包含PYD 和CARD 結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptotic speck-like protein containing a caspase recruitment domain, ASC)以及下游效應(yīng)蛋白Caspase-1組成。傳感器蛋白，如模式識別受體 (pattern recognition receptors, PRRs)，可被病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)或損害相關(guān)分子模式 (damage-associated molecular patterns, DAMPs)激活形成不同的炎癥小體。目前只有NLRP1、NLRP3、NLRC4、Pyrin 和AIM2 能夠直接組裝炎癥小體并激活Caspase-1[17～21]（見表1）。NLRP3 炎癥小體是研究最廣泛且與細(xì)胞焦亡關(guān)系最為密切。研究表明，炎癥小體在與NP 相關(guān)的細(xì)胞焦亡和炎癥過程中起著至關(guān)重要的作用。例如，在大鼠NP 模型中，經(jīng)嗎啡治療后可介導(dǎo)NLRP3 炎癥小體的激活，加重大鼠的疼痛癥狀。但可通過調(diào)節(jié)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞中的硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxininteracting protein, TXNIP)/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3)軸調(diào)控NP 的發(fā)生發(fā)展[22]。在炎癥小體激活后，這些傳感器蛋白與銜接蛋白ASC 相互作用，通過Pro-Caspase-1 的募集和切割，進(jìn)而激活Caspase-1?；罨腃aspase-1，一方面切割消皮素 D (gasdermin D,GSDMD)，形成 GSDMD 的N 末端和C 末端，活性N 端特異性結(jié)合細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，進(jìn)而形成大量的蛋白孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓發(fā)生變化，引起細(xì)胞腫脹并最終破裂，最終誘發(fā)細(xì)胞焦亡；另一方面促進(jìn)IL-1β、IL-18 成熟并釋放到細(xì)胞外，引發(fā)炎癥反應(yīng)[23]（見圖1）。

圖1 細(xì)胞焦亡的分子途徑

表1 不同類型炎癥小體的特征

在非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中，Caspase4/5/11 可直接結(jié)合細(xì)菌內(nèi)脂多糖，切割GSDMD 蛋白而誘發(fā)細(xì)胞焦亡[24]。并且，GSDMD 的N 末端片段還會激活NLRP3 炎癥小體并促進(jìn)依賴于Caspase-1分子途徑中的IL-1β 和IL-18 的成熟。其發(fā)生機(jī)制為GSDMD 介導(dǎo)的鉀離子外流以及產(chǎn)生的線粒體ROS，可進(jìn)一步激活NLRP3 炎癥小體，而不依賴于經(jīng)典途徑中的NLRP3、ASC 和Caspase-1。此外，Caspase-8 的激活被認(rèn)為屬于非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑。在缺乏 Caspase-1 的細(xì)胞中，NLRP3 通過建立一個Caspase-8 激活平臺，進(jìn)而切割Pro-IL-1β，最終誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[25]。因此，不依賴于Caspase-1的Caspase 蛋白激活途徑屬于一種非經(jīng)典途徑。目前有學(xué)者認(rèn)為，Caspase-3 是外源性和內(nèi)源性凋亡的執(zhí)行蛋白，并且有文獻(xiàn)報道Caspase-3 通過切割GSDME 也能引起細(xì)胞膜破裂，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，表明細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡不僅會競爭性誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，還可能同時發(fā)生，一起介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[26]（見圖1）。

三、細(xì)胞焦亡與NP

炎癥反應(yīng)在NP 的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在神經(jīng)損傷初期，炎癥對于促進(jìn)神經(jīng)再生和愈合是必不可少的。然而，當(dāng)炎癥反應(yīng)消退過程受到破壞后，會介導(dǎo)慢性疼痛的形成。此外，細(xì)胞焦亡是通過炎癥小體的激活并介導(dǎo)的炎癥性細(xì)胞死亡。

最近研究表明，在小鼠NP 模型中，NLRP3 炎癥小體的激活顯著增強(qiáng)，以及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白（如IL-1β、IL-18、ASC、Caspase-1 和NLRP3）表達(dá)水平也明顯升高[27]。并且，坐骨神經(jīng)功能指數(shù)檢查顯示，NLRP3-KO 小鼠的炎癥反應(yīng)減少，運(yùn)動功能明顯改善，表明細(xì)胞焦亡參與了NP 的病理生理過程，其可能是NP 的干預(yù)靶點(diǎn)。此外，研究發(fā)現(xiàn)NLRP3 炎癥小體的激活會加重NP 合并的焦慮和抑郁樣癥狀。而Albiflorin 制劑可以通過促進(jìn)Nrf2 核易位和阻斷NF-κB 核易位來抑制NLRP3 的表達(dá)和激活，從而緩解NP 和情感障礙相關(guān)癥狀[28]。在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中，Salidroside 可抑制背根神經(jīng)節(jié)中NLRP3 炎癥小體的激活，進(jìn)而緩解NP[29]。在高脂肪飲食誘導(dǎo)的糖尿病前期神經(jīng)病變小鼠模型，以及棕櫚酸鹽處理的小鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中，研究者觀察到NLRP3 炎癥小體明顯激活，以及背根神經(jīng)節(jié)中IL-1β 表達(dá)上調(diào)[30]。Cheng 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在2 型糖尿病小鼠和疼痛性神經(jīng)病變大鼠模型的背根神經(jīng)節(jié)中NLRP3 的表達(dá)水平顯著升高，這與既往的研究結(jié)果一致；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)高糖處理的施萬細(xì)胞可以促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的活化、IL-1β和IL-18的成熟以及GSDMD裂解水平的升高，表明細(xì)胞焦亡明顯增加。

大量研究表明，免疫機(jī)制介導(dǎo)的炎癥性疾病與NP 存在因果關(guān)系。Wang 等[32]發(fā)現(xiàn)，褪黑素可抑制NF-κB/NLRP3 依賴性信號傳導(dǎo)，從而調(diào)控細(xì)胞焦亡以緩解NP。為了研究褪黑素與細(xì)胞焦亡之間可能存在的聯(lián)系，該研究人員建立了大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation, SNL)模型。研究表明，SNL 術(shù)后的疼痛異常，可能是通過 NLRP3 和 NF-κB信號激活后，顯著上調(diào)的細(xì)胞炎性因子介導(dǎo)的。而使用小分子藥物抑制NLRP3 后，SNL 大鼠的疼痛程度及炎癥水平均顯著降低。這說明細(xì)胞焦亡的發(fā)生可能在介導(dǎo)NP 的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。綜上所述，NP 可誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，出現(xiàn)炎癥小體的活化和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的上調(diào)，靶向干預(yù)炎癥小體NLRP3/Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，能緩解炎癥反應(yīng)，是緩解疼痛的有效策略，可為NP 的治療提供新的思路。

四、細(xì)胞焦亡作為潛在的NP 治療靶點(diǎn)

1.NLRP3 炎癥小體抑制劑

由于炎癥小體可檢測到各種DAMP 和PAMP并誘導(dǎo)促炎性Caspase 的生理活性，所以炎癥小體被認(rèn)為是細(xì)胞焦亡的催化劑和重要參與者。因此，調(diào)控炎癥小體的組裝和活化可以抑制細(xì)胞焦亡及其導(dǎo)致的細(xì)胞功能障礙。

目前研究的熱點(diǎn)是對外來刺激產(chǎn)生反應(yīng)的NLRP3炎癥小體及其上游信號通路。NF-κB 信號通路是NLRP3 炎癥小體激活的必要條件。因此，首選的治療方法是防止NF-κB 通路被激活，以抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生。天然合成的褪黑素具有強(qiáng)大的抗炎特性，可預(yù)防各種炎癥疾病。此外，褪黑素通過調(diào)控NF-κB受體，可以顯著促進(jìn)NF-κB 向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。在SNL模型中，褪黑素已經(jīng)被證實(shí)通過調(diào)控NF-κB/NLRP3炎癥小體軸，從而抑制細(xì)胞焦亡，緩解NP[32]。Sun等[33]證實(shí)，金麥通通過抑制NLRP3 炎癥小體和細(xì)胞焦亡，最終緩解NP 動物模型的行為學(xué)表現(xiàn)和形態(tài)學(xué)損傷。鑒于NLRP3 在細(xì)胞焦亡過程中的關(guān)鍵作用，亟需開發(fā)更多的NLRP3 分子抑制劑。

2.Caspase-1 抑制劑

Caspase-1 對GSDMD、IL-1β 和IL-18 的活化至關(guān)重要。目前主要報道了兩種靶向Caspase-1 的藥物，如vx-740 (Pralnacasan)和vx-765。小分子Caspase-1抑制劑vx-765和vx-740 (Pralnacasan)是擬肽類藥物，經(jīng)血漿酯酶代謝后，分別活化為VRT-043198 和VRT-18858，其中vx-765 是一種可逆性的Caspase-1抑制劑，也是目前最多用于治療NP 的Caspase-1抑制劑[34]。目前這類藥物用于治療癲癇和銀屑病的II 期臨床研究已經(jīng)完成。進(jìn)一步研究表明，口服Caspase-1 抑制劑vx-765 后可以有效緩解SNL 動物模型的疼痛癥狀。此外，與褪黑素一樣，vx-765也能抑制SNL 模型中Caspase-1、NLRP3、ASC 和GSDMD 的表達(dá)上調(diào)[35]。因此，這些研究結(jié)果為使用Caspase-1 抑制劑治療NP 提供了理論基礎(chǔ)。

3.Gsdmd 抑制劑

Gasdermin 家族蛋白，尤其是GSDMD 在細(xì)胞焦亡過程中承擔(dān)著執(zhí)行者和整合來自炎癥小體的多種內(nèi)源性和外源性信號的關(guān)鍵作用[36]。一旦GSDMD誘導(dǎo)的細(xì)胞穿孔無法正常形成，大多數(shù)活化的炎癥小體、Caspase 和生物分子信號將會被阻斷。因此，抑制GSDMD 誘發(fā)的細(xì)胞焦亡可間接抑制后續(xù)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，阻斷細(xì)胞焦亡所產(chǎn)生的一系列不良反應(yīng)。目前針對性抑制GSDMD 的藥物可分為兩類：①抑制促炎性Caspases-1 活化GSDMD；②阻斷GSDMD-NT 的寡聚化或細(xì)胞膜插入。雙硫侖是美國醫(yī)師最常使用的戒酒藥物，用于治療酒精依賴癥。研究發(fā)現(xiàn)，雙硫侖通過靶向GSDMD 上的Cys191結(jié)構(gòu)域，抑制GSDMD 誘導(dǎo)的細(xì)胞膜穿孔，從而抑制了細(xì)胞焦亡和IL-1β/18 的釋放[37]。進(jìn)一步研究表明，小分子化合物Necrosulfonamide 可與裂解的GSDMD 相互作用，阻斷p30-GSDMD 片段的寡聚化，并抑制細(xì)胞膜穿孔的形成。此外，Yang 等[38]揭示了GSDMD 與Caspase-1/4/5/11 相互作用的裂解位點(diǎn)，并合成了GSDMD 衍生抑制劑(Ac-FLTD-CMK)，而該抑制劑可以代替全長的GSDMD，并與上述Caspase 分子結(jié)合，從而阻斷GSDMD 的裂解活化。

4.細(xì)胞因子抑制劑

IL-1β 和IL-18 在細(xì)胞焦亡過程中具有重要作用，并參與NP 的發(fā)生發(fā)展，可能是NP 的另一個潛在治療靶點(diǎn)。盡管Canakinumab 通過抑制IL-1β和IL-18 信號已被證明對心血管疾病有治療作用，但針對這一信號的藥物在治療NP 方面仍需進(jìn)一步驗(yàn)證[39]。最初，研究者發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白是胃蛋白酶分解乳鐵蛋白時產(chǎn)生的一種抗菌肽。目前研究表明，乳鐵蛋白能明顯減少由分解代謝因子（IL-1β、IL-18 和IL-6）引起的氧化因子和炎癥因子的分泌[40]。然而，這些藥物在治療NP 方面的療效仍需進(jìn)一步探索。

五、總結(jié)與展望

NP 的發(fā)病機(jī)制涉及多因素、多環(huán)節(jié)交聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，本文綜述了細(xì)胞焦亡及其在NP 中的可能作用機(jī)制，并分別討論了引發(fā)細(xì)胞焦亡的多種因素，以及部分分子抑制劑應(yīng)用于NP 防治的細(xì)胞焦亡相關(guān)機(jī)制。細(xì)胞死亡方式（如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡、鐵死亡）的多樣性可能是NP 治療效果不令人滿意的原因之一。盡管許多研究已經(jīng)證實(shí)了細(xì)胞焦亡在NP 中的關(guān)鍵作用，但仍不能確定它是否是一個主要因素。目前關(guān)于細(xì)胞焦亡的相關(guān)機(jī)制尚不明確，特別是現(xiàn)已知信號通路的下游信號調(diào)控機(jī)制尚未闡明。并且對于藥物抑制劑在臨床試驗(yàn)中的有效性及安全性還有待證明。到目前為止，尚無一種細(xì)胞焦亡的抑制劑被批準(zhǔn)用于NP 的臨床應(yīng)用。因此，未來迫切需要更多的基礎(chǔ)研究深入地探索細(xì)胞焦亡在NP 中的作用機(jī)制，以及更多大型臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞焦亡相關(guān)分子抑制劑的有效性及安全性。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。