張媛婧 劉春華 胡慧敏 李 晨 趙浩成 張家禧 樊碧發(fā)

（1 北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029；2 中日友好醫(yī)院疼痛科，北京 100029）

國際疼痛學(xué)會(International Association for the Study of Pain, IASP)最新修訂的疼痛定義，疼痛被認(rèn)為是一種與實際或潛在的組織損傷相關(guān)的不愉快的感覺和情緒情感體驗，或與此相似的經(jīng)歷[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)于2018 年重新修訂了國際疾病分類(International Classification of Diseases, ICD-11)，慢性疼痛首次作為獨立的疾病被列入分類目錄，其中就包括慢性神經(jīng)病理性疼痛。IASP 將神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)定義為由軀體感覺系統(tǒng)的損傷或者疾病而導(dǎo)致的疼痛[2]。這種神經(jīng)病理性疼痛通常是慢性的，表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作[2]。慢性疼痛造成巨大的個人和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，有研究表明，其影響了全球30%以上的人[3]。而慢性NP 更是造成全球疾病負(fù)擔(dān)的主要因素[4]，其患病率在一般人群的6.9%～10%之間[5]。NP 被認(rèn)為是最難治療的疼痛狀況之一[6]，與之發(fā)展相關(guān)的心理因素包括抑郁、焦慮、創(chuàng)傷后壓力、應(yīng)對能力差和災(zāi)難化思維等。目前臨床上常用的西藥治療有抗抑郁藥、抗驚厥藥、鈣離子通道調(diào)節(jié)劑、鈉離子通道阻滯劑、阿片類藥物等，但與西藥治療伴隨而來的如頭暈、嗜睡、惡心、嘔吐等藥物不良反應(yīng)使病人依從性變差，以及長期服用易產(chǎn)生病人對藥物的依賴性，停藥后疼痛癥狀易復(fù)發(fā)，藥物的安全性存在爭議[7]。因此，尋找更易被病人接受且能夠降低NP 復(fù)發(fā)率的高效、安全治療方案尤為重要。隨著中醫(yī)臨床研究的進展，具有多成分、多靶點優(yōu)勢的中藥天然產(chǎn)物及其化合物為治療NP 提供了研究方向[8]。

身痛逐瘀湯出自清代醫(yī)學(xué)大家王清任的《醫(yī)林改錯》，為“五逐瘀湯”之一，為治療血瘀證的代表方劑之一。全方具有活血祛瘀，祛風(fēng)除濕，蠲痹止痛之功，用于治療瘀血痹阻經(jīng)絡(luò)所致的肢體痹痛或周身疼痛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該方具有活血化瘀、鎮(zhèn)痛、抗炎作用[9]，但其具體作用機制仍不清楚。因此, 本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對身痛逐瘀湯治療NP 的有效成分及靶點進行預(yù)測，探討其產(chǎn)生作用的信號通路，為身痛逐瘀湯治療NP 的作用機制研究提供新思路。

方 法

1.身痛逐瘀湯靶點收集及篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http://tcmspw.com)對各中藥的活性成分進行搜索，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、類藥性(drug likeness, DL)≥0.18 為篩選條件，對于TCMSP 數(shù)據(jù)庫未收錄的藥物，選用HERB 數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)進行檢索，獲取化合物SMILE 式，上傳至Swiss ADME 平臺(http://www.swissadme.ch/index.php)篩選（化合物保留標(biāo)準(zhǔn)：GI absorption = yes, Druglikeness 中yes 數(shù)≥3），對篩選后的化合物上傳至Swiss Target Prediction 平臺預(yù)測靶點（靶點保留標(biāo)準(zhǔn)：Probability > 0）。檢索出秦艽、川芎、桃仁、紅花、甘草、羌活、沒藥、當(dāng)歸、靈脂、香附、牛膝、地龍等藥物的活性成分和對應(yīng)靶點。使用Perl 計算機程序語言編寫的腳本對活性成分和靶點進行對應(yīng)篩選并去重，顯示出藥物靶標(biāo)的名稱和序號；在此基礎(chǔ)上把藥物成分名稱通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org) 轉(zhuǎn)化成基因標(biāo)簽。

2.疾病相關(guān)基因的篩選

使用生物信息綜合數(shù)據(jù)庫(GeneCard, https://www.genecards.org/)、人類在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM 數(shù)據(jù)庫，https://www.omim.org/）對疾病靶點進行搜索并下載數(shù)據(jù)，進行整理和匯總，檢索關(guān)鍵詞為：Neuropathic Pain。

3.藥物-疾病靶點的篩選

從藥物靶點文件中將標(biāo)簽信息分離出來備用，從GeneCard、OMIM 數(shù)據(jù)中將疾病對應(yīng)的標(biāo)簽信息分離出來備用；使用R 語言VennDiagram 程序包對數(shù)據(jù)進行處理并作出Venn 圖，得到藥物-疾病對應(yīng)的數(shù)據(jù)。

4.“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的繪制

將中藥、活性成分、交集靶點信息整理至Excel表格，利用Cytoscape 3.8.0 軟件繪制“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，使用其內(nèi)置工具Network Analyzer 計算度值(degree)，篩選主要活性化合物。

5.數(shù)據(jù)可視化及PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在String PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI) 分析數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入疾病-藥物互作蛋白，選擇人類數(shù)據(jù)庫，通過調(diào)整，設(shè)置評分值（置信度）> 0.9 后，隱藏游離節(jié)點，生成PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)節(jié)點圖。隨后將靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 進行可視化，利用Analyze Network 插件計算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)，并以此篩選網(wǎng)絡(luò)中的重要化合物及方劑的主要作用靶點。

6.功能富集分析

使用R 語言BiocManager 數(shù)據(jù)包對疾病藥物靶點的數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化，展示出其基因ID，便于后期數(shù)據(jù)富集分析；對治療靶點進行基因本體論(gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，限定P< 0.05，物種為人類。

7.分子對接

將“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中度值最高的10 個活性成分與PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值最高的 10 個核心蛋白進行分子對接。蛋白質(zhì)獲取使用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(RCSB Protein Data Bank, RCSB PDB, https://www.rcsb.org)，蛋白受體預(yù)處理通過AutoDockTools 1.5.6，小分子獲取使用有機小分子生物活性數(shù)據(jù)(PubChem, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，小分子能量最小化通過OpenBabel 2.4.1（MMFF94 力場），小分子配體處理使用OpenBabel 2.4.1。通過軟件Autodock Vina 1.1.2 進行分子對接，設(shè)置對接構(gòu)象為10 個，通過分子對接結(jié)果分析各小分子配體與受體蛋白的結(jié)合能力強弱。

結(jié) 果

1.身痛逐瘀湯靶點整合

通過TCMSP 以O(shè)B ≥30%、DL ≥0.18 為篩選條件，對于TCMSP 未收錄的藥物（靈脂、地龍）選用HERB 進行檢索，共收集到活性成分199 個，其中秦艽2 個、川芎6 個、桃仁18 個、紅花16 個、甘草88 個、羌活13 個、沒藥31 個、當(dāng)歸2 個、靈脂16 個、香附16 個、牛膝16 個、地龍1 個，刪除重復(fù)項，最終共收集到靶點494 個。利用 Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點進行基因名稱轉(zhuǎn)化，共獲得478 個藥物靶點基因。

2.神經(jīng)病理性疼痛靶點整合

以“Neuropathic Pain” 為檢索詞進行檢索，收集NP 相關(guān)靶點，將2 個疾病數(shù)據(jù)庫結(jié)果進行歸納，其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫1758 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫391個，刪除重復(fù)基因，得到1902 個疾病基因（見圖1）。將疾病靶點與活性成分靶點取交集，得到交集靶點122 個（見圖2）。

圖1 不同疾病數(shù)據(jù)庫疾病靶點Venn 圖Fig.1 Venn diagram of disease targets in different disease databases

圖2 藥物-疾病交集靶點Venn 圖Fig.2 Venn diagram of drug-disease intersection targets

3.“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 對122 個交集靶點進行“中藥-活性成分-靶點調(diào)控”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制（見圖3）。Network Analyzer 計算分析得到333 個節(jié)點，1261條邊，平均度值為7.57，對節(jié)點拓?fù)鋮?shù)進行分析以篩選網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的節(jié)點，前10 的化合物節(jié)點拓?fù)鋮?shù)見表1，前10 的基因靶點節(jié)點拓?fù)鋮?shù)見表2。由表1 可知，排名前10 的化合物槲皮素、4'-二氫基漢黃芩素、五靈脂酸、7-羥基-5-甲氧基香豆素、委陵菜酸、三羥基基異甾族膽烯酸、熊果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素的度值均顯著大于7.57，表明其能對多個靶點具有作用，可能是身痛逐瘀湯治療NP 的關(guān)鍵化合物。由表2 可知，靶點信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)、白細胞介素6 (interleukin-6,IL-6)、絲裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase, MAPK1)、MAPK3、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、RelA 原癌基因 (RelA proto-oncogene, RELA)、干擾素-γ (interferon-γ, IFNG)、IL-1β、Raf-1 原癌基因(Raf-1 proto-oncogene, RAF1)、c-Fos 原癌基因(Fos proto-oncogene, FOS)的度值均顯著大于7.57，表示其能被多種化合物進行調(diào)節(jié)，可能是治療NP 的主要靶點。

表1 身痛逐瘀湯活性成分節(jié)點拓?fù)鋮?shù)Table 1 Topological parameters of Shentong Zhuyu decoction active ingredient nodes

表2 治療靶點節(jié)點拓?fù)鋮?shù)Table 2 Therapeutic target node topology parameters

圖3 “中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The "TCM-Active Ingredients-Target" network

4.PPI 網(wǎng)絡(luò)

將在STRING 構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape進行可視化（見圖4）。圖中122 個治療靶點存在374 條蛋白相互作用連線。Network Analyzer 計算分析得到82 個節(jié)點，374 條邊，平均度值9.12，其中STAT3、IL-6、MAPK1、MAPK3、TNF、RELA、IFNG、IL-1β、RAF1、FOS（排名前10）度值均大于9.12（見表2），說明與其他蛋白互作力強。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點越大，顏色越接近紅色，節(jié)點度值越高Fig.4 PPI network The larger the node, the closer the color is to red and the higher the node degree value.

5.GO 富集分析

由GO 富集分析結(jié)果可知(P< 0.05)，身痛逐瘀湯干預(yù)NP 的作用靶點涉及的生物過程有2100 條，主要為對脂多糖的反應(yīng)、信號釋放、對細菌源分子的反應(yīng)、對肽激素的反應(yīng)、對外來刺激的反應(yīng)等；涉及的細胞組分有98 條，主要為膜筏、膜微區(qū)、神經(jīng)元胞體、突觸前膜、突觸后膜等；涉及的分子功能有152 條，主要為碳酸鹽脫水酶活性、水解酶活性、碳氧裂解酶活性、裂合酶活性、兒茶酚胺整合等（見圖5）。

圖5 GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis

6.KEGG 通路富集分析

為了明確身痛逐瘀湯干預(yù)NP 主要涉及的信號通路對治療靶點進行KEGG 通路富集，最終共得到176 條信號通路，以P值為標(biāo)準(zhǔn)選取與疼痛密切相關(guān)的20 條信號通路進行可視化分析（見圖6），主要包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、MAPK 信號通路、cAMP 信號通路、IL-17 信號通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、TNF 信號通路、Th17 細胞分化、T 細胞受體信號通路、toll 樣受體信號通路、胰島素抵抗、破骨細胞分化、TRP 通道的炎癥調(diào)節(jié)介質(zhì)、cGMP-PKG 信號通路、GnRH 信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、Th1 和Th2 細胞分化、氮代謝、VEGF 信號通路、細胞凋亡、ErbB信號通路等。

圖6 KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis

7.分子對接驗證

將關(guān)鍵化合物槲皮素、4'-二氫基漢黃芩素、五靈脂酸、7-羥基-5-甲氧基香豆素、委陵菜酸、三羥基基異甾族膽烯酸、熊果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素與核心靶點STAT3、IL-6、MAPK1、MAPK3、TNF、RELA、IFNG、IL-1β、RAF1、FOS 進行分子對接（見圖7）。結(jié)果表明10 個化合物與10 個核心靶點均具有較好的結(jié)合力，其中對接最穩(wěn)定的是4'-二氫基漢黃芩素、委陵菜酸與MAPK3 的結(jié)合(-9.4 kcal·mol-1)。取結(jié)合能較強的結(jié)果（排名前6）進行可視化，分別為委陵菜酸與MAPK3 (-9.4 kcal·mol-1)、4'-二氫基漢黃芩素與MAPK3 (-9.4 kcal·mol-1)、委陵菜酸和IFNG(-9.4 kcal·mol-1)、木犀草素與MAPK3 (-9.3 kcal·mol-1)、槲皮素與MAPK3 (-9.3 kcal·mol-1)、委陵菜酸與FOS(-9.3 kcal·mol-1)，見圖8。

圖7 關(guān)鍵成分與作用靶點分子對接信息Fig.7 Molecular docking information of key components and targets

討 論

NP 基于損傷或者疾病的解剖位置可分為周圍NP 和中樞NP，多種累及外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病都有可能誘發(fā)NP，其所覆蓋疾病范圍甚廣，包括三叉神經(jīng)痛、痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、化療誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變、術(shù)后慢性疼痛（截肢、開胸術(shù)和冠狀動脈旁路術(shù)、腰椎內(nèi)固定術(shù)后等）等周圍神經(jīng)病變以及脊髓損傷、腦損傷、慢性卒中、多發(fā)性硬化等中樞神經(jīng)病變。NP 一旦出現(xiàn)，通常會給病人帶來極大痛苦并造成功能障礙。NP 在中醫(yī)學(xué)并無其病名，而是根據(jù)其癥狀，將其歸屬于“痛證”“痹癥”等范疇。身痛逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》卷下，源于《丹溪心法》的趁痛散，全方由秦艽、川芎、桃仁、紅花、甘草、羌活、沒藥、當(dāng)歸、靈脂、香附、牛膝、地龍組成。全方以桃仁、紅花作為君藥，活血化瘀，暢通氣血；當(dāng)歸、川芎、五靈脂、牛膝、沒藥、香附、地龍為臣，行氣活血、舒絡(luò)通痹止痛；秦艽、羌活為佐藥，祛風(fēng)除濕；甘草為使藥，調(diào)和諸藥。諸藥相合共奏活血祛瘀、祛風(fēng)除濕、蠲痹鎮(zhèn)痛之功，用于治療瘀血痹阻經(jīng)絡(luò)所致的肢體痹痛或周身疼痛?，F(xiàn)代臨床研究已證實身痛逐瘀湯治療NP 的有效性及安全性[10～12]。

本研究從身痛逐瘀湯中篩選出槲皮素、4'-二氫基漢黃芩素、五靈脂酸、7-羥基-5-甲氧基香豆素、委陵菜酸、三羥基基異甾族膽烯酸、熊果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素等關(guān)鍵活性成分，其靶點主要影響STAT3、IL-6、MAPK1、MAPK3、TNF、RELA、IFNG、IL-1β、RAF1、FOS 等與疼痛相關(guān)靶點，主要涉及對脂多糖、細菌源分子、肽激素、外來刺激的反應(yīng)、信號釋放等生物過程；涉及膜筏、膜微區(qū)、神經(jīng)元胞體、突觸前膜、突觸后膜等細胞組分；包括碳酸鹽脫水酶活性、水解酶活性、碳氧裂解酶活性、裂合酶活性、兒茶酚胺整合等分子功能。與疼痛密切相關(guān)的20 條信號通路主要包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、MAPK 信號通路、環(huán)磷酸腺苷信號通路(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、IL-17 信號通路等。分子對接發(fā)現(xiàn)以槲皮素、4'-二氫基漢黃芩素、委陵菜酸等為配體小分子與MAPK1、MAPK3、MAPK8、IFNG、FOS 等受體蛋白進行分子對接的氫鍵、碳氫鍵、烷基、π-π相互作用、π-烷基、π-σ 等結(jié)合能穩(wěn)定，初步驗證了身痛逐瘀湯治療NP 可能的分子機制。

大量的研究表明，槲皮素可以通過減少氧化應(yīng)激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和下調(diào)活性氧介導(dǎo)的下游信號通路等方式，發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌和保護心血管等藥理作用，尤其抗炎是槲皮素最核心最顯著的作用之一[13]。4'-二氫基漢黃芩素、木犀草素等黃酮類化合物具有抗炎抗菌、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫調(diào)節(jié)等作用，通過對STAT3、核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，改變炎癥中涉及的各種信號通路來產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用[14]。7-羥基-5-甲氧基香豆素屬于香豆素類化合物，具有抗病毒、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用[15]。委陵菜酸具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用，通過抑制NF-κB 活化而產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用[16]。熊果酸具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降脂、降糖、保肝等作用，可通過激活核因子-紅細胞2 相關(guān)因子2 信號通路改善腦缺血中的炎癥反應(yīng)[17]。β-谷甾醇具有抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)的作用，可激活過氧化物酶體增殖物激活受體α (recombinant peroxisome proliferator activated receptor alpha, PPARα)通路產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用[18]?；钚猿煞志兄寡鬃饔?，提示上述活性成分可能通過抗炎等作用產(chǎn)生鎮(zhèn)痛，參與NP 的發(fā)展。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析可知，身痛逐瘀湯治療NP 的主要靶點有STAT3、IL-6、MAPK1、MAPK3、TNF、RELA、IFNG、IL-1β、RAF1、FOS 等。IL-6、IL-1β、TNF、IFNG 均為促炎細胞因子，大量研究表明[19～21]，IL-6 參與了坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI)和部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型(partial sciatic nerve ligation, PSNL)神經(jīng)性疼痛的機制，在這兩種模型中，機械痛敏與損傷部位IL-6 免疫反應(yīng)性升高之間存在相關(guān)性；IL-1β 亦在NP 中起作用，在CCI 模型小鼠中，針對IL-1 型受體的中和抗體減少了小鼠的疼痛相關(guān)行為；TNF 啟動了幾種細胞因子和生長因子的級聯(lián)激活，被證明直接參與幾種神經(jīng)損傷模型的疼痛產(chǎn)生，在神經(jīng)痛模型小鼠中觀察到損傷誘導(dǎo)的TNF-α mRNA 和蛋白表達的增加與痛覺超敏/痛覺過敏的發(fā)展相關(guān)；IFN-γ 與NP 的病因有關(guān)，在正常條件下刺激脊髓小膠質(zhì)細胞中的IFN-γ 受體可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的激活和持久的異常性疼痛。STAT3 為轉(zhuǎn)錄因子，可作為刺激免疫反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子，通過響應(yīng)各種細胞因子和生長因子的磷酸化而被激活介導(dǎo)多種基因的表達，研究發(fā)現(xiàn)STAT3 的激活在慢性疼痛發(fā)展中起重要作用[22]。MAPK1、MAPK3 均屬于MAPK 家族，其中MAPK3 即ERK1，MAPK1 即ERK2，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的激酶之一，參與維持中樞敏化。大量研究表明，ERK 被選擇性磷酸化并根據(jù)有害刺激的強度表達直接抑制磷酸化ERK (p-ERK) 表達可減輕NP[23]。ERK 激活的主要途徑是Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路，它是MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)通路的原型，Raf1 是該途徑中的關(guān)鍵分子，研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射Raf1 siRNA 可有效抑制Raf1 表達，緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的大鼠機械痛敏和冷痛敏，降低p-ERK 表達[24]。RELA 即NF-κB p65，在細胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起著關(guān)鍵性作用，NF-κB 在神經(jīng)性疼痛的進展中起著至關(guān)重要的作用，可通過抑制NF-κB 的表達緩解NP[25]。Fos作為最常見的原癌基因之一，參與多個基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，能夠調(diào)控細胞的生長、分化及傳遞細胞內(nèi)信號，在多種生物活動中發(fā)揮重要作用，有研究表明直接抑制c-Fos 在NP 的早期和維持階段均有效[26]。以上均表明上述靶點蛋白參與NP 的發(fā)生，在NP中有著重要作用。

根據(jù) KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn) MAPK 信號通路、cAMP 信號通路、IL-17 信號通路等為與疼痛相關(guān)的主要通路。MAPK 通路是信號從細胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細胞核內(nèi)部的重要路徑，是一種三級級聯(lián)傳遞信號通路，是一個級聯(lián)磷酸化的過程，核心成員包括MAPK 激酶激酶(MAP kinase kinase kinase, MKKK)、MAPK 激酶(MAP kinase kinase, MKK)和 MAPK 這3種激酶。MAPK 屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，包括ERK1/2、p38、c-Jun 氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK)和ERK5。ERK、p38 和JNK 代表3 種不同的信號級聯(lián)，它們通過轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)將廣泛的細胞外刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)為不同的細胞內(nèi)反應(yīng)。ERK 在成人的神經(jīng)元可塑性中起著重要作用；p38 和JNK被促炎細胞因子和細胞應(yīng)激激活，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)變性和細胞死亡中起重要作用；MAPK 通路參與促炎細胞因子和NP 的上調(diào)。已有大量的研究表明在炎癥和神經(jīng)性疼痛模型中，MAPK 抑制劑已被證明可以緩解痛覺過敏和痛覺超敏，這表明MAPK在組織和神經(jīng)損傷后疼痛超敏反應(yīng)的發(fā)展中具有特定作用。同時鞘內(nèi)注射MAPK 途徑的選擇性抑制劑可在炎癥、神經(jīng)性疼痛和癌痛的嚙齒動物模型中產(chǎn)生鎮(zhèn)痛活性[23,24,27]。cAMP 信號通路又稱PKA 系統(tǒng)(protein kinase A system, PKA)，是細胞外信號與相應(yīng)受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)第二信使cAMP 的水平而引起反應(yīng)的信號通路。cAMP-PKA 通路的持續(xù)激活可以維持感覺神經(jīng)元過度興奮和行為痛覺過敏。cAMP-PKA 通路的作用已在其他幾種疼痛模型中進行了研究，包括PSNL、糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain, DNP)、脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)、炎性痛等，研究表明cAMPPKA 的激活參與了NP 相關(guān)的幾種上游或下游途徑。在上游信號傳導(dǎo)中，背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)中的前列腺素E2 (prostaglandin E2,PGE2)以cAMP-PKA 依賴性方式促進傷害性介質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和IL-6 的表達和釋放，G 蛋白偶聯(lián)受體3 (G protein-coupled receptor 3, GPR3)、大麻素受體(human cannabinoid receptor, CB)、甲狀旁腺激素2 (parathyroidhormone 2, PTH2) 受體也通過cAMP-PKA 信號通路參與NP 的發(fā)展。在下游信號傳導(dǎo)中，cAMP 敏感的內(nèi)向電流I (h) 和cAMP 相關(guān)動作電位的激活對超極化激活環(huán)核苷酸(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide, HCN)調(diào)節(jié)離子通道介導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛至關(guān)重要[28]。IL-17 由輔助性T 淋巴細胞亞型17 (T helper 17, Th17)和其他先天免疫細胞產(chǎn)生，誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α，趨化因子CXCL1 和CCL20 和轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor-β, TGF-β)。在多種神經(jīng)性疼痛模型中，IL-17 受體 (IL-17R)在DRG切片的大多數(shù)神經(jīng)元以及培養(yǎng)的DRG 神經(jīng)元中檢測到，且IL-17 均有高表達，提示其主要在神經(jīng)損傷的后期起重要作用，并參與NP的炎癥反應(yīng)和發(fā)展[29]。有研究表明，IL-17/IL-17R 信號傳導(dǎo)可以通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元-膠質(zhì)相互作用促進中樞敏化和外周敏化[30]。

一般認(rèn)為，結(jié)合能絕對值越高，結(jié)合親和力越高。對接親和力-4.6 kcal·moL-1左右表明能基本結(jié)合，小于-5 kcal·moL-1表明配體和所選蛋白受體具有良好的結(jié)合效果，小于-7 kcal·moL-1表明結(jié)合很好[31]。本研究通過分子對接可以看到配體和受體的平均結(jié)合能為-7.1 kcal·mol-1，結(jié)合位點均有穩(wěn)定的氫鍵、π-π相互作用等，對接最穩(wěn)定的是4'-二氫基漢黃芩素、委陵菜酸與MAPK3 的結(jié)合 (-9.4 kcal·mol-1)。本研究分子對接結(jié)果表明身痛逐瘀湯活性成分與受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合，可能起到治療NP 的作用。

綜上所述，身痛逐瘀湯通過12 味藥物中的槲皮素、4'-二氫基漢黃芩素、委陵菜酸等活性成分，在MAPK、cAMP、IL-17 等通路下，作用于MAPK1、MAPK3、STAT3、IFNG、FOS 等主要靶點蛋白，通過多靶點、多途徑、多通道可能對NP產(chǎn)生治療作用，這些發(fā)現(xiàn)有望指導(dǎo)身痛逐瘀湯在NP 治療中的應(yīng)用和進一步發(fā)展，為后續(xù)實驗研究提供指導(dǎo)意義。由于本研究未進行動物實驗驗證，存在一定的局限性，因此下一步需進行動物實驗驗證，進一步闡述身痛逐瘀湯治療NP 的作用機制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。