鄭 松,儲超群,岳 琳,黃申卓凡,溫家根

阿米卡星(amikacin,AKN)是第三代氨基糖苷類抗生素,可用于敏感細(xì)菌感染的治療,其對革蘭陰性菌效果較好。此外,AKN對耐藥結(jié)核桿菌具有較好的殺傷作用,但是其在臨床應(yīng)用時會導(dǎo)致明顯的腎毒性和耳毒性。有研究[1]顯示AKN可以通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)引起腎臟損傷。AKN在腎組織中積累顯著,并可以與線粒體發(fā)生作用,促使線粒體發(fā)生功能障礙,同時增加腎臟組織中氧自由基的產(chǎn)生,使得細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)氧化性損傷[1],并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及炎癥性死亡[2]。因此,抗氧化藥物的應(yīng)用可以減輕AKN等氨基糖苷類藥物的腎毒性,如鞣花酸、西洛他唑、β-石竹烯[2-3]等。本課題組前期研究[4-5]建立了慶大霉素的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型,研究了綠茶多酚對慶大霉素腎毒性的保護作用,發(fā)現(xiàn)綠茶多酚可以通過激動Keap1-Nrf2信號發(fā)揮抗氧化作用,減輕慶大霉素腎毒性導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和鐵死亡。然而,關(guān)于AKN的體外腎損傷模型研究較少,故本研究建立了AKN體外腎小管細(xì)胞損傷模型,探討黃酮苷類化合物王不留行黃酮苷(vaccarin,VA)對腎小管細(xì)胞損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器HK-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。VA購自美國MedChemExpress有限公司;AKN購自河南輔仁懷慶堂制藥有限公司;慶大霉素購自瑞陽制藥有限公司;抗溶質(zhì)載體蛋白家族47成員11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)抗體、抗谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)抗體和抗β-actin抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國GE醫(yī)療科技有限公司Hyclone實驗室;TRIzol和2×SYBR Green Pro Taq HS Premix試劑購自湖南艾科瑞生物科技有限公司;HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;二氫乙錠(dihydroethidium, DHE)探針購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。SpectraMaxi 3x多功能酶標(biāo)儀購自美國美谷分子儀器公司;CFX Connect實時熒光定量PCR儀和ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像儀購自美國伯樂公司;DMi8倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司。Nanodrop 2000超微量分光光度計購自美國賽默飛世爾科技公司

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HK-2細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養(yǎng),在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿,胰酶消化制成細(xì)胞懸液,接種于96孔板或6孔板,過夜培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到80%,加入含藥物的培養(yǎng)基進行孵育。MTT實驗使用96孔板進行,在藥物孵育達(dá)到預(yù)定時間進行,每孔中加入MMT試劑(與培養(yǎng)基的比例1 ∶10),繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h,最后棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μmol/L DMSO,37 ℃搖床中孵育30 min,酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度值。

1.3 細(xì)胞內(nèi)MDA和GSH水平檢測HK-2細(xì)胞接種于6孔板,加藥刺激結(jié)束后,PBS洗滌2次,使用細(xì)胞刮刀刮取各組細(xì)胞,超聲破碎儀制備細(xì)胞裂解液。按試劑盒說明分別檢測細(xì)胞內(nèi)GSH和MDA含量。

1.4 RT-qPCR檢測KIM-1和NGAL的mRNA水平采用TRIzol提取HK2細(xì)胞的總RNA,測定RNA濃度,使用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將1 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在反應(yīng)體系中分別加入:1 μl上、下游引物(表1),5 μl 2×SYBR Green Pro Taq HS Premix和3 μl cDNA模板。采用實時熒光定量PCR儀對KIM-1、NGAL和β-actin的mRNA水平進行定量。熱循環(huán)(40個循環(huán))條件為:95 °C變性20 s, 58 ℃退火20 s, 72 ℃延伸20 s。β-actin用于KIM-1、NGAL的mRNA相對比值的歸一化。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測HK-2細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平使用含有PMSF(1 ∶100)的RIPA緩沖液從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)樣品,用10%或12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。隨后,將轉(zhuǎn)印后的膜與5%的脫脂牛奶(TBS配制)孵育1 h,孵育結(jié)束后分別與抗SLC7A11抗體(1 ∶1 000)、抗GPX4抗體(1 ∶1 000)、抗β-actin抗體(1 ∶5 000)4 ℃過夜孵育。次日棄去一抗,使用TBST洗滌,再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。最后,在膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑使用化學(xué)發(fā)光成像儀進行顯影,Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.6 DHE熒光探針分析HK-2細(xì)胞接種于6孔板,加藥處理后,PBS洗滌2次,使用含有2 μmol/L的DHE探針的培養(yǎng)基和細(xì)胞37 ℃孵育30 min進行熒光探針裝載,隨后PBS洗滌2次后加入不含藥物的培養(yǎng)基,熒光倒置顯微鏡檢測各視野中細(xì)胞紅色熒光的強度,Image J軟件分析熒光強度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism 5軟件(GraphPad, La Jolla, CA, USA)進行繪圖。所有計量資料以平均值±SEM表示。多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及兩兩比較的Tukey檢驗,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立HK-2細(xì)胞體外損傷模型采用不同濃度的AKN(1、2、4、8、16、32 mmol/L)體外刺激HK-2細(xì)胞24 h,MTT檢測結(jié)果見圖1A,各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=127.5),AKN對HK-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)為(5.74 ± 0.47) mmol/L,低于1 mmol/L的濃度對細(xì)胞活力影響較小(圖1A),后續(xù)選擇4 mmol/L AKN進行藥物刺激。此外,與對照組相比,100 μmol/L及以下濃度的VA使得HK-2的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.001,F=38.75),見圖1B。當(dāng)VA與AKN(4 mmol/L)同時處理時,25～100 μmol/L的VA和AKN共處理組細(xì)胞活力顯著高于AKN組(P<0.05,F=22.07),見圖1C;且25～100 μmol/L的VA與AKN(3 mmol/L)同時處理后,HK-2的細(xì)胞活力也顯著高于AKN(3 mmol/L)單獨處理組(P<0.01,F=31.94),見圖1D。AKN(4 mmol/L)處理后KIM-1的mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,F=30.95),VA(50 μmol/L)與AKN共處理組(VA+AKN)的KIM-1顯著低于AKN組(P<0.01,F=30.95),見圖1E。AKN(4 mmol/L)處理后NGAL的mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,F=21.43),VA+AKN組的NGAL顯著低于AKN組(P<0.05,F=21.43),見圖1F。

圖1 VA減輕氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞的損傷

此外,以4 mmol/L的AKN分別處理0、3、6、12、24 h,檢查細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,3 h DHE染色強度開始升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,6 h DHE染色強度顯著大于0 h組(P<0.01,F=25.83),12 h染色強度達(dá)到最大(P<0.001,F=25.83),見圖2A。此外,與0 h組相比,3、6、12、24 h組MDA水平顯著上升(P<0.05,F=61.14),見圖2B;與0 h組相比,3、6、12、24 h組GSH水平顯著下降(P<0.001,F=72.49),見圖2C。

圖2 AKN導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的變化

2.2 AKN導(dǎo)致HK-2細(xì)胞發(fā)生鐵死亡采用4 mmol/L AKN刺激HK-2細(xì)胞,與0 h組相比,6、12、24 h組鐵死亡相關(guān)蛋白SLC7A11(F=125.35)和GPX4(F=92.71)均明顯下降(P<0.001),3 h組與0 h組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,12 h組與24 h組差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

圖3 AKN導(dǎo)致SLC7A11和GPX4蛋白水平的變化

2.3 VA改善HK-2細(xì)胞的死亡及氧化應(yīng)激根據(jù)細(xì)胞活力檢測結(jié)果,選擇50 μmol/L濃度VA進行后續(xù)實驗。通過顯微鏡觀察,VA處理可以提高視野中細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞的完整性,見圖4A。AKN處理可以使得細(xì)胞DHE染色熒光升高,見圖4B;MDA水平從(3.57±0.36) nmol/mg protein(NC組)升高至(13.37±0.63) nmol/mg protein(AKN組),見圖4C;GSH水平從(42.27±1.76) nmol/mg protein(NC組)下降至(15.30±1.31) nmol/mg protein(AKN組),見圖4D。VA+AKN組DHE熒光強度顯著低于AKN組(P<0.001,F=150.0);VA+AKN組MDA[(6.40±0.67) nmol/mg protein]顯著低于AKN組(P<0.001,F=72.343);VA+AKN組GSH[(33.76±2.53) nmol/mg protein]顯著高于AKN組(P<0.01,F=32.925)。

圖4 VA對HK-2的保護作用

2.4 VA可以改善AKN導(dǎo)致的鐵死亡VA作用24 h后,通過檢測SLC7A11和GPX4的蛋白水平,發(fā)現(xiàn)其可以恢復(fù)AKN導(dǎo)致的SLC7A11和GPX4降低,SLC7A11(F=63.41)和GPX4(F=65.73)蛋白水平在AKN與VA+AKN組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖5。

圖5 Western blot檢測VA對HK-2的SLC7A11和GPX4的蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

氨基糖苷類抗生素是一類臨床常用的抗菌藥物。近年來,由于結(jié)核桿菌耐藥性的發(fā)展,AKN也已用于結(jié)核復(fù)治及耐藥結(jié)核的治療。與鏈霉素相比,AKN毒性較低,然而其腎毒性仍然明顯。據(jù)統(tǒng)計,在兒童人群中,有20%～33%接受氨基糖苷類藥物治療的患者會發(fā)生腎損傷[6]。

AKN等氨基糖苷類抗生素引起的腎損傷以近端腎小管為主。在AKN腎損傷大鼠模型中,Rajab et al[2]采用AKN 500 mg/(kg·d)的劑量給雄性的Wistar大鼠連續(xù)腹腔注射14 d,可以導(dǎo)致明顯的腎小管的損傷及血清肌酐的升高,Dogan et al[7]采用AKN 1.2 mg/kg單次腹腔注射Wistar大鼠,同樣14 d后觀察到腎小管區(qū)域出現(xiàn)明顯損傷。本課題組前期研究[5]已發(fā)現(xiàn)慶大霉素對HK-2和NRK-52E兩種細(xì)胞的IC50達(dá)到3 mmol/L左右,在本研究中,AKN對HK-2細(xì)胞的IC50為5.74 mmol/L。由于藥物極性較大,AKN等氨基糖苷類抗生素體外造模所需濃度較大。在體內(nèi),氨基糖苷類藥物在腎小管管腔側(cè)megalin等蛋白的作用下,重吸收進入腎小管細(xì)胞內(nèi)[8-10]。所以,AKN等氨基糖苷類藥物在體內(nèi)外模型中存在較大的動力學(xué)特征差異。早期研究[11]發(fā)現(xiàn)凋亡是該類藥物導(dǎo)致腎小管細(xì)胞損傷或死亡的主要形式,本課題組在慶大霉素腎損傷過程發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)了程序性壞死及鐵死亡[4-5],最近Ding et al[12]也證實炎癥性死亡(焦亡)是慶大霉素腎損傷的病理機制。此外,腎臟細(xì)胞的損傷還會引起炎癥效應(yīng),導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙及炎癥細(xì)胞的浸潤和激活,進一步加劇腎小管細(xì)胞的損傷[13]。然而,關(guān)于AKN腎損傷的病理機制仍不明確,本研究在建立的體外細(xì)胞模型上首次證實了鐵死亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的變化。

近年來,相關(guān)研究[14]還發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素影響線粒體氧化呼吸鏈,導(dǎo)致多種活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生,并消耗影響抗氧化系統(tǒng),導(dǎo)致腎臟細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激。腎小管細(xì)胞線粒體非常豐富,更容易引起氧化應(yīng)激。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn),慶大霉素處理1.5 h后即可以明顯導(dǎo)致氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。本研究同樣發(fā)現(xiàn),AKN處理早期便使得細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激。過載ROS可以進一步攻擊膜磷脂,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,引發(fā)鐵死亡。脂質(zhì)過氧化物的大量積累是鐵死亡的關(guān)鍵特征,GPX4具有強抗氧化作用,其以GSH為輔因子可催化去除過氧化脂質(zhì)。而SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)的重要組成部分,負(fù)責(zé)谷胱甘肽合成前體胱氨酸的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。在本研究中,相關(guān)蛋白指標(biāo)GPX4和SLC7A11在AKN刺激6 h即顯著降低,而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA在AKN刺激3 h升高,GSH在3 h便開始下降,提示鐵死亡在AKN刺激的早期即開始出現(xiàn)。GPX4在發(fā)揮抗脂質(zhì)氧化的同時本身會被消耗,故在刺激之后蛋白水平會顯著下降。另外,ROS可導(dǎo)致DNA損傷從而激活P53,通過轉(zhuǎn)錄信號調(diào)節(jié)抑制SLC7A11的表達(dá)[15-16],細(xì)胞內(nèi)GSH合成的水平會因此而降低,再加上胞內(nèi)GSH的大量消耗,GPX4的蛋白水平降低更加明顯。

VA是中藥王不留行的有效物質(zhì),屬于類黃酮苷類化合物。近年來,研究顯示VA可以通過促進血管生成來加速傷口愈合[17],VA還可通過激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和肌球蛋白輕鏈激酶促進了2型糖尿病小鼠腸道屏障的完整性[18]。此外,VA通過減少ROS保護內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、炎癥和凋亡。其他類黃酮苷類物質(zhì)如橙皮苷、柚皮苷、黃芩苷等化合物均具有較好的抗氧化作用。本研究結(jié)果也顯示VA具有較好的抗氧化作用,可以對抗AKN引起的腎小管細(xì)胞的氧化應(yīng)激。因VA化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有多個羥基、酚羥基及酮基,所以該化合物具有還原性,可以發(fā)揮抗氧化作用。此外,本課題組還發(fā)現(xiàn)VA可能靶向還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4),從而降低氧自由基的形成[19]。所以,在VA作用下,損傷細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)均顯著降低。VA對細(xì)胞鐵死亡的抵抗效果可能依賴于其抗氧化的作用。此外,在正常培養(yǎng)的細(xì)胞中,治療濃度下的VA并不能顯著影響細(xì)胞MDA、GSH和ROS的水平,也不改變SLC7A11和GPX4的蛋白水平,故對細(xì)胞正常的氧化還原穩(wěn)態(tài)不會產(chǎn)生影響。VA的抗氧化作用機制未進行深入探索,其抑制AKN導(dǎo)致的腎小管細(xì)胞的鐵死亡是否完全依賴于抗氧化的作用仍需要明確。

本研究成功建立了AKN腎小管上皮細(xì)胞體外損傷模型,并發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和鐵死亡均是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要原因。VA可能通過抑制過氧化應(yīng)激相關(guān)的鐵死亡途徑減輕AKN腎小管上皮細(xì)胞的損傷。