楊彩虹，張 萍，買買提艾力·艾合木提，黃巧玲，王 震，曹旭東

（1.武威市畜牧獸醫(yī)總站，武威 733000；2.新疆喀什地區(qū)結(jié)核病防治所，喀什 844000；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832002； 4.河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，張掖 734000）

結(jié)核病屬于人獸共患傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）估計(jì)，2019年全球結(jié)核病發(fā)病率約為130/10萬，新發(fā)結(jié)核病患者1000萬例，新發(fā)耐多藥結(jié)核病或耐利福平結(jié)核病患者約46.5萬例，死亡病例達(dá)到141萬[1]?？梢?，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis, MTB）或耐藥結(jié)核分枝桿菌的感染已經(jīng)對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，結(jié)核病的有效防控已成為全球關(guān)注的重點(diǎn)問題[2-3]。我國作為發(fā)展中大國，雖然持續(xù)實(shí)施著結(jié)核病的防治規(guī)劃，但該病的傳播和流行，尤其是耐藥結(jié)核病的盛行，沒有得到有效的遏制。據(jù)中國耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，肺結(jié)核患者中耐藥結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病的比例分別達(dá)到了38.25%、8.32%和0.68%。因此準(zhǔn)確掌握結(jié)核病患者的耐藥情況，合理調(diào)整患者治療方案，才能達(dá)到徹底治療疾病目標(biāo)。

目前，臨床上主要依靠藥敏試驗(yàn)對(duì)耐藥結(jié)核病進(jìn)行早期診斷，該方法因耗時(shí)長等諸多因素受限，導(dǎo)致患者無法得到及時(shí)診斷，延誤臨床治療最佳時(shí)機(jī)，加大了耐藥結(jié)核病的傳播風(fēng)險(xiǎn)。耐藥結(jié)核病的快速且精準(zhǔn)診斷，在臨床治療上顯得尤為重要。近年來隨著國內(nèi)外專家學(xué)者對(duì)MTB耐藥機(jī)制的研究，以檢測耐藥相關(guān)基因突變?yōu)橹鞯姆肿由飳W(xué)快速檢測方法日益受到重視[4]。熔解曲線分析是一種將擴(kuò)增與檢測融為一體通過實(shí)時(shí)PCR檢測突變的方法，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比該方法耗時(shí)較短，在耐藥結(jié)核病的快速檢測和診斷上有潛力成為一種分子輔助技術(shù)，但仍需大量臨床數(shù)據(jù)來驗(yàn)證其檢測的準(zhǔn)確性。

鏈霉素是臨床上治療結(jié)核病常用的一線藥物，主要通過與細(xì)菌30S亞基的結(jié)合來發(fā)揮殺菌作用[5-6]。因鏈霉素在臨床治療上使用的普遍性，使MTB對(duì)鏈霉素逐漸產(chǎn)生了耐藥性。大量研究表明，鏈霉素耐藥較大程度上是在耐藥相關(guān)的基因位點(diǎn)發(fā)生突變的情況下產(chǎn)生的，據(jù)報(bào)道相關(guān)基因主要有兩個(gè)，分別是負(fù)責(zé)編碼MTB 16S rRNA的rrs基因和核糖體蛋白S12的基因Rpsl[7]。研究表明在鏈霉素耐藥菌株的基因組DNA中70%～95%可見Rpsl基因和rrs基因位點(diǎn)發(fā)生突變，其中Rpsl基因突變占52%～59%，突變位點(diǎn)主要集中在第43位和第88位密碼子，尤其是第43密碼子突變占到所有鏈霉素耐藥株的70%以上[5]。以鏈霉素耐藥株分子突變特點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)，本研究采用高分辨率熔解曲線（highresolution melting curve，HRM）技術(shù)對(duì)臨床分離株進(jìn)行快速檢測，同時(shí)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，比較分析兩種檢測結(jié)果，評(píng)估HRM在鏈霉素耐藥性檢測中的效能，以期為后期在新疆維吾爾自治區(qū)全面開展結(jié)核桿菌耐藥的分子診斷工作及制定合理方案提供精準(zhǔn)化、個(gè)體化治療的技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA和84株結(jié)核分枝桿菌分離株基因組DNA及其耐藥信息均由新疆喀什地區(qū)結(jié)核病防治所提供；改良羅氏培養(yǎng)基、7H9保菌液購自青島海博生物技術(shù)有限公司；氯仿、PBS磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、DNAout試劑盒、HRM試劑盒均購自西安易飛生物科技有限公司；引物由上海祥音生物科技有限公司合成。

1.2 結(jié)核分枝桿菌藥物培養(yǎng)及鏈霉素敏感性測定（由新疆喀什地區(qū)結(jié)核病防治所完成）

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng) 將接種環(huán)、羅氏培養(yǎng)基提前放入超凈工作臺(tái)紫外燈照射15 min，從-80℃取出保存的菌液，室溫靜置至其完全融化。在超凈工作臺(tái)中，將菌液吹勻，吸取100 μL到羅氏培養(yǎng)基的斜面上，用接種環(huán)將其涂勻。37℃恒溫培養(yǎng)箱先培養(yǎng)1周，待第2周時(shí)再依次轉(zhuǎn)入鐵架豎放培養(yǎng)，每周觀察一次培養(yǎng)菌的生長情況，同時(shí)作好記錄。對(duì)于1個(gè)月還未見生長的菌株進(jìn)行重新培養(yǎng)，污染的菌株應(yīng)及時(shí)清理。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)（鏈霉素） 參照WHO標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)操作按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行[8]。

1.3 結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性HRM檢測

1.3.1 DNA的提取及檢測樣品的制備 按照DNAout試劑盒說明書提取基因組DNA，所得DNA溶液用分光光度計(jì)檢測濃度，將其稀釋為10 ng/μL，作為HRM檢測的模板。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)需求，以Rpsl基因和rrs基因?yàn)檠芯繉?duì)象，從NCBI中下載相關(guān)序列，Rpsl基因（Rv0682），Gene ID：888259，編碼核糖體蛋白S12；rrs基因（Rvnr01），Gene ID：2700429，編碼16S rRNA[9]。分別在Rpsl基因第43位密碼子，rrs基因第513位堿基，第904位堿基、第1400位堿基突變部位處設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增片段長度分別為306 bp（Rpsl基因），94、131、98 bp（rrs基因），具體引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 The primer DNA sequence of PCR

1.3.3 擴(kuò)增與熔解曲線分析 每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系為10 μL（HRM Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 1.8 μL，MgCl21.8 μL，模板1 μL）。首先將除模板以外的反應(yīng)體系液進(jìn)行混合，再將混合好的體系液分裝到8連管中，最后再將不同模板分裝到8連管中，陽性對(duì)照加H37Rv模板，陰性對(duì)照以ddH2O為模板，加樣完畢后各樣本分別做好標(biāo)識(shí)。離心數(shù)秒，依次將反應(yīng)管置于96孔板上，設(shè)置反應(yīng)條件見表2。

表2 反應(yīng)條件Table 2 Experiment conditions of each procedure

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用軟件SPSS17.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，比較傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與HRM檢測結(jié)果之間的符合率；用Kappa檢測分析兩種結(jié)果的一致性，判定標(biāo)準(zhǔn)：①1≥Kappa≥0.75時(shí)為高度一致性；②0.75≥Kappa≥0.4時(shí)為中度一致性；③Kappa＜0.4時(shí)為低度一致性。采用x2檢驗(yàn)分析HRM檢測法與藥敏法檢測耐藥性結(jié)果的差異性，P＞0.05時(shí)顯示檢測結(jié)果差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株培養(yǎng)與藥敏結(jié)果 通過保存菌液成功復(fù)蘇85株結(jié)核分枝桿菌（圖1A，圖1B）；嚴(yán)格遵循《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》規(guī)定進(jìn)行分離株藥敏試驗(yàn)操作（圖1C），結(jié)果顯示84株分離株中20株對(duì)鏈霉素耐藥，64株對(duì)鏈霉素敏感。

圖1 菌株培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Strain culture and drug sensitivity test results

2.2 HRM檢測結(jié)果 以提取的MTB基因組DNA為模板，針對(duì)Rpsl基因和rrs基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行HRM擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增曲線和熔解峰型不存在引物二聚體峰和雜峰，引物特異性較好（圖2，圖3）；以標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv檢測峰型為野生型敏感株對(duì)照，統(tǒng)計(jì)84株MTB分離株Rpsl基因和rrs基因的峰型分布情況，共有24株MTB峰型與對(duì)照不一致，判斷為鏈霉素耐藥株，其中Rpsl基因占比23/24（圖4），rrs基因占比1/24（圖5）；60株對(duì)鏈霉素敏感。

圖2 鏈霉素耐藥相關(guān)基因Rpsl HRM 擴(kuò)增曲線（A）和熔解曲線（B）Fig.2 Streptomycin resistance related gene Rpsl HRM amplif ication curve (A) and melting curve (B)

圖3 鏈霉素耐藥相關(guān)基因rrs HRM 擴(kuò)增曲線（A）和熔解曲線（B）Fig.3 Streptomycin resistance related gene rrs HRM amplif ication curve (A) and melting curve (B)

圖4 HRM 檢測鏈霉素耐藥相關(guān)基因RpslFig.4 HRM detection of streptomycin resistance related Rpsl gene

圖5 HRM 檢測鏈霉素耐藥相關(guān)基因rrsFig.5 HRM detection of streptomycin resistance related rrs gene

2.3 HRM檢測效能的評(píng)估 以藥敏檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，在20株鏈霉素耐藥株中，HRM檢測出15株；64株鏈霉素敏感株中，HRM檢測出55株。經(jīng)卡方檢測分析，兩種檢測方法P＜0.05，HRM檢測的陽性預(yù)測值為62.5%，陰性預(yù)測值為91.6%，敏感性為75%，特異性為85.9%。檢測的Kappa值為0.570，檢測結(jié)果具有中度一致性，具體數(shù)值見表3。

表3 HRM 檢測結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的效率Table 3 The efficiency of HRM in detecting streptomycin resistance of Mycobacterium tuberculosis

3 討論

結(jié)核病在臨床上主要以化學(xué)治療為主，用藥方案為一線抗癆藥+二線抗癆藥，鏈霉素、利福平、異煙肼等均是常用的一線抗癆藥，其優(yōu)點(diǎn)為療效顯著，不良反應(yīng)小。而耐藥結(jié)核病特別是耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）因其具有治療難度大、治愈率低、病死率高的特點(diǎn)，為結(jié)核病的防治帶來巨大挑戰(zhàn)，耐藥結(jié)核病的防治工作已成為我國結(jié)核病防治的重點(diǎn)[10]。究其產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理，大量研究歸于菌株的基因突變，例如常見的利福平的耐藥主要由rpoB基因突變引起，異煙肼的耐藥由KatG、inhA、kasA等基因突變導(dǎo)致，本文中探究的鏈霉素耐藥主要由rrs基因和Rpsl基因突變引起[11]。傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)（drug susceptibility testing, DST）是檢測細(xì)菌耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)隨著分子生物學(xué)的日新月異，基于檢測耐藥基因突變的基因診斷技術(shù)也越來越受到人們的重視。

本文以藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果為參照，采用高分辨率熔解曲線分析的方法，根據(jù)點(diǎn)突變序列熔點(diǎn)變化，實(shí)時(shí)檢測臨床分離株基因組DNA中部分耐藥基因突變位點(diǎn)。該方法在具有分離株或者分離株基因組DNA的前提下，獲得菌株的耐藥性信息時(shí)間為1～2 d，同時(shí)實(shí)現(xiàn)閉管操作，減少了誤差，能夠快速、準(zhǔn)確地掌握患者鏈霉素的耐藥情況[12-13]，進(jìn)而為臨床合理用藥及耐藥監(jiān)測提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HRM檢測結(jié)核分枝桿菌對(duì)鏈霉素耐藥性的敏感性、特異性、符合率分別為75%、85.9%、57.0%，呈中度一致性。王麗娜[14]曾報(bào)道，HRM在檢測鏈霉素等一線抗癆藥物的耐藥符合率多在80%以上，二線抗癆藥符合率可達(dá)89%以上[14]，本文研究結(jié)果與其不一致；大量研究表明，HRM在檢測MTB對(duì)利福平和異煙肼耐藥的靈敏度和符合率較高，有待后續(xù)驗(yàn)證[15]。

對(duì)影響檢測結(jié)果的原因進(jìn)行分析，可能是本方法的耐藥基因檢測不足或檢測的基因位點(diǎn)有限。本文中HRM檢測所用引物，覆蓋Rpsl基因第2位密碼子-第103位密碼子區(qū)域，rrs基因rrs513-517、rrs905-908和rrs1400三個(gè)區(qū)域，具有特異性，熔解曲線法只是檢測已知基因突變引起的耐藥，如果出現(xiàn)耐藥性不明確的現(xiàn)象，如存在基因突變外的耐藥機(jī)制或新增耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)，就會(huì)出現(xiàn)藥敏試驗(yàn)和HRM檢測結(jié)果不一致的現(xiàn)象。這提示我們需要對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥機(jī)制做進(jìn)一步研究。此外，為了提高檢測的敏感度，在檢測過程中不僅要注意對(duì)檢測方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化升級(jí)，還要控制合格的標(biāo)本源，要知道合格的標(biāo)本源在HRM反應(yīng)過程中尤為重要。

綜上所述，盡管高分辨率熔解曲線法因諸多因素還存在缺陷和不足，如果在耐藥結(jié)核病臨床診療中將其與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合應(yīng)用，便可發(fā)揮其快速、方便的作用。我們可以先根據(jù)熔解曲線法檢測結(jié)果第一時(shí)間對(duì)患者進(jìn)行用藥治療，結(jié)合后期藥物敏感性試驗(yàn)調(diào)整治療方案，達(dá)到治愈疾病的目的。因此HRM在耐藥結(jié)核病的早期輔助診斷方面具有重要的參考意義。