趙旭陽，樊 帥，靳家鑫，張 帥，路聞龍，朱瀟靜，王 芮，張改平，孫愛軍，莊國慶

（河南農業(yè)大學動物醫(yī)學院 國家動物免疫學國際聯(lián)合研究中心，鄭州 450046）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染豬引起的非洲豬瘟（African swine fever, ASF），是一種急性、烈性、出血性、高度接觸性傳染病，急性感染常表現(xiàn)為高于41℃的發(fā)熱、厭食、精神沉郁等臨床癥狀，感染后4～15 d病死率接近100%，屬于世界動物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health, WOAH）規(guī)定必須上報的A類動物疫病。1921年，ASF首次報道于肯尼亞，傳入歐洲后在大部分國家均有發(fā)生、流行[1]。2018年8月，ASF疫情在我國首次報道并迅速蔓延，嚴重影響畜牧業(yè)健康發(fā)展。盡管目前已通過多項生物安全措施減少了ASF的發(fā)生，但仍缺少有效抑制或者阻斷病毒復制傳播的手段[2]。綜述ASFV主要編碼蛋白在其侵入和復制過程的作用和機理，并進一步討論其在ASF疫苗和藥物研發(fā)中的指導作用，對防控ASF發(fā)生發(fā)展，確保生豬產業(yè)健康發(fā)展有重要意義。

1 ASFV 病原學

ASFV是雙股線性DNA病毒，基因組大小為170～193 kb，由一個約125 kb的保守中心區(qū)和兩個可變末端組成，包含150～167個緊密排列的開放閱讀框（ open reading frames, ORFS），編碼超過150種結構和非結構蛋白。其中位于可變區(qū)的多基因家族（ multi gene f amilies, MGFS）基因決定了ASFV的基因多樣性，與ASFV的毒力強弱以及免疫逃逸密切相關[3]。ASFV的基因表達與復制協(xié)調運轉，保障病毒復制的順利進行。隨后，ASFV在核周微管組織中心（microtubule organizing center, MTOC）處稱為“病毒工廠”的區(qū)域進行組裝，經細胞質膜以“出芽”的方式釋放到細胞外[4]。

2 核質大DNA 病毒

核質大DN A病毒（Nucleocytoplasmic large DNA viruses, NCLDVs）是一類有相同遠古起源的DNA病毒，包括非洲豬瘟病毒科、痘病毒科、虹彩病毒科等在內的多個病毒家族。大部分NCLDVs由DNA及其結合蛋白構成核心，外包一層或多層脂質膜并具有二十面體衣殼，衣殼蛋白均存在類似雙層“果凍卷”（jelly-roll, JR）的折疊結構，與殼粒形成有關[5]；絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸-絲氨酸 蛋白磷酸酶在幾乎所有NCLDVs中都有同源性，可能在病毒顆粒裝配過程中起調節(jié)作用[6]；SMT4樣蛋 白酶通過類泛素化修飾（SUMOylation）在NCLDVs顆粒成熟中發(fā)揮作用[7]。NCLDVs在 DNA復制機制上也具有一定的相似性，所依賴的ATP酶在序列上高度保守[8]，其究竟由共同祖先進化還是在相同或相似宿主中復制導致，仍需進一步研究。

3 ASFV 的結構與組成

ASFV具有二十面體對稱結構，內部是含有DNA的類核（nucleoid）及蛋白質核心殼（core shell），向 外依次為脂質內膜（inner envelope）和蛋白質衣殼（capsid），成熟的ASFV還有脂質外囊膜（outer envelope）包裹，直徑為260～300 nm[9]（圖1）。ASFV基因組兩端的可變區(qū)域形成發(fā)卡結構，通過共價鍵將雙股DNA連接在一起。ASFV編碼的蛋白根據功能可分為參與病毒形態(tài)發(fā)生（24%）、參與病毒基因轉錄（19%）、維持基因組完整性（6%）、介導病毒入侵（4%）、逃避宿主免疫防御（3%）和功能未知蛋白（34%）[10]。

圖1 ASFV 的主要結構與已知功能蛋白Fig.1 ASFV major structure and functional proteins

3.1 類核 ASFV類 核主要包括蛋白結合的病毒基因組以及一些參與復制和轉錄的酶或相關因子，它們共同組成直徑約80 nm的電 子致密結構[4]。目前發(fā)現(xiàn)參與病毒類核結構的病毒蛋白主要有p10和A104R，均為DNA結合蛋白，與細菌擬核中含有的組蛋白功能相似[11]；參與病毒基因組復制和轉錄的酶或相關因子包括RNA聚合酶亞基（NP1450L、EP1242L、H359L、D205R、C147L、D339L）、加帽酶（NP868R）、polyA聚合酶（C475L）、甲基轉移酶（EP424R）和早期轉錄因子（D1133L、Q706L、G1340L、B962L）等[9]。

3.2 核心殼 ASFV核心殼是包裹在類核外部的一層蛋白質結構，厚約30 nm，主要源于病毒前體蛋 白pp220和pp62[4]。在病毒S273R蛋白酶作用下，pp220被水解為p150、p37、p34、p14和p5，pp62被水解為p35、p15和p8[12]，這些產物約占病毒總蛋白的32%，在核心殼組裝過程中起到重要作用。

3.3 內膜 ASFV內膜是一層類脂質膜結構，主要成分源自內質網（endoplasmic reticulum, ER）。參與構成內膜的病毒蛋白主要包括p54、p17、p12、E248R、E199L、p12、p22等[13]。p17和p54是一種定位于內膜上的跨膜蛋白，在ER上不斷積聚導致膜塌陷并轉入病毒工廠，在病毒內膜前體的形成中發(fā)揮重要作用[14]。

3.4 衣殼 ASFV衣殼直徑約260 nm，其二十面體對稱結構主要由12個五重對稱體（pentasymmetrons）和20個三重對稱體（trisymmetron），共計2760個偽六邊形殼粒（pseudo-hexagonal capsomers）和12個五鄰體蛋白（penton protein）組成，每個五重對稱體含30個殼粒和5個五鄰體蛋白，每個三重對稱體含120個殼粒，殼粒間距為7.4～8.1 nm[15]。晚期蛋白p72是殼粒的主要組成成分，約占病毒顆?？偟鞍椎?2%，在病毒識別、結合和進入宿主細胞過程中起重要作用。

3.5 外囊膜 ASFV顆粒以“出芽”的方式從宿主細胞排出，并獲得1層非二十面體對稱的外囊膜。有無外囊膜的ASF V均具有感染性，說明其在感染過程中是非必需的[15]。外囊膜上特征性蛋白CD2v（EP402R）是一種包含信號肽、免疫球蛋白樣結構域和跨膜區(qū)的糖蛋白，具有與T淋巴細胞表面受體CD2相似的序列特征，能夠使ASFV更容易吸附在被感染細胞表面[9]。

4 ASFV 的進入與復制

ASFV通過內體-溶酶體途徑（endosomelysosome pathway）進入宿主細胞，并在此過程中脫去衣殼，病毒內膜與晚期內體（late endosome）膜融合將病毒核心釋放到胞質；病毒核心通過微管轉至核周“病毒工廠”，利用自身編碼的酶和相關因子進行早期轉錄，表達病毒復制早期蛋白[16]；ASFV侵入宿主細胞4 h內，病毒基因組DNA復制在細胞核中啟動，侵入6 h后進入細胞質復制階段[17]；隨后，病毒核心在“病毒工廠”裝配形成，由二十面體衣殼包裹后通過微管轉運到細胞質膜出芽釋放[4]（圖2）。

圖2 ASFV 的進入和增殖Fig.2 ASFV entry and propagation

4.1 ASFV進入

4.1.1 ASFV進入過程 ASFV主要通過網格蛋白介導的受體依賴性內吞（clathrin-mediated receptordependent endocytosis）途徑進入宿主細胞，也可經由巨胞飲（macropinocytosis）進入，兩種方式并無明確界限，巨胞飲過程中肌動蛋白的重組和膜突起也能夠輔助網格蛋白介導的內吞作用[18]。有研究表明作為巨噬細胞成熟標志的CD163可能與ASFV侵入相關[19]，但Franzoni等[20]發(fā)現(xiàn)ASFV感染并未影響CD163表達，其是否作為受體介導ASFV感染仍需進一步論證。在適宜的溫度、pH和能量供應下，有無外囊膜的ASFV顆粒均可通過內吞進入細胞，并伴隨內體的酸化脫去衣殼。在膽固醇協(xié)助下病毒內膜與內體膜發(fā)生融合，病毒核心被釋放至胞漿并通過微管轉運至MTOC，啟動早期基因的表達和基因組復制[16]。另外，ASFV還能通過膜融合等非內體途徑進入細胞，但該途徑進入的病毒并不具備感染能力。

4.1.2 進入相關蛋白 ASFV編碼蛋白可能在病毒侵入、脫殼、轉運的過程中發(fā)揮作用。結構蛋白p54能夠與胞質動力蛋白LC8結合，介導病毒向核周區(qū)域運輸[9]。E248R是一種存在于成熟病毒顆粒內膜上的跨膜蛋白，在ASFV感染過程中參與內體膜融合及核衣殼遞送[21]。另外，針對ASFV結構蛋白p30、p54、p72的特異性抗體能在一定程度上抑制病毒的吸附[9]，表明這些病毒蛋白在病毒侵入過程中也發(fā)揮了作用。

4.2 ASFV復制

4.2.1 ASFV復制過程 ASFV核心通過微管轉運至細胞核周圍后，在自身編碼的酶和細胞因子作用下進行早期mRNA轉錄、翻譯，并利用DNA聚合酶polB、polX等進行基因組復制。在感染4 h內，病毒在宿主細胞核中啟動早期復制并形成小型復制中間體[22]；感染6 h后，復制中間體轉移到細胞質中組成大復制中間體，在細胞質的“病毒工廠”中進一步復制[17]。ASFV感染早期表達的蛋白會促進病毒基因組DNA復制，而當復制進入細胞質階段，病毒基因的轉錄模式也發(fā)生相應轉變，主要進行中、晚期蛋白的表達和修飾。目前，ASFV轉錄與復制不同階段的調控機制尚不明晰，其可能是未來開發(fā)阻斷ASFV復制藥物的關鍵。

4.2.2 復制相關蛋白 在ASFV感染早期，核心殼蛋白p37介導復制過程中的DNA核質轉運，其與病毒基因組一同進入宿主細胞核，完成DNA復制后再一同轉移至“病毒工廠”[23]。在細胞核復制階段，C962R基因編碼的DNA引物酶在基因組的一端或兩端引入單鏈間隙，暴露的3'-OH充當DNA聚合酶的引物啟動復制，其中新生鏈和模板鏈的末端自我互補產生“頭對頭連接體”并折疊成自啟動發(fā)夾結構[17]；在細胞質復制階段，ASFV使用自身編碼的一套DNA合成酶系統(tǒng)保證復制的順利進行：G1211R、E301R和F1055L基因分別編碼類DNA聚合酶、類增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）蛋白和螺旋酶參與病毒復制起始，其中G1211R將DNA聚合酶結合在DNA分子上[24]，E301R融合于DNA聚合酶催化區(qū)域，參與構成病毒DNA復制復合物的滑動結構[17,25]，F(xiàn)1055L可特異性識別病毒復制起點協(xié)助C962R啟動復制[26]。此外，F(xiàn)778R、F334L和A240L基因分別編碼核糖核苷酸還原酶的大、小亞基和胸苷激酶，為細胞質階段的復制提供原料[27-28]。在復制過程中，P1192R、EP364R、和D345L基因分別編碼DNA拓撲異構酶、類ERCC4核酸酶和類λ核酸外切酶，P1192R解析病毒基因組復制中間體并參與病毒核酸的結構修飾[10]，EP364R和D345L負責把聚合基因組中間體分解成單位長度[17]，共同促進大復制中間體形成成熟的交聯(lián)DNA。最后，組蛋白樣蛋白A104R與成熟的復制產物結合并一起組裝到子代病毒顆粒中，其與E199L合作保持DNA的超螺旋活性[29-30]。

堿基切除修復（base excision repair, BER）系統(tǒng)可修復因水解或活性氧氧化造成的DNA損傷而保證病毒基因組復制的準確性。NP419L基因編碼一種低保真度DNA連接酶，能高效封閉3'端錯配缺口（如C∶T缺口）導致的遺傳突變，也參與催化岡崎片段連接[6,31]。O174L基因編碼的pol X是目前已知最小、也是保真性最低的DNA聚合酶，可介導單堿基缺失修復，也能在小片段DNA損傷修復中發(fā)揮作用[17]；E296R基因編碼AP核酸內切酶，在BER機制中發(fā)揮3'→5'外切酶活性和3'雙酯酶活性，參與維持基因組的高保真性[27]。E165R基因編碼一種dUTP酶，能降低dUTP濃度以減小脫氧尿苷錯誤摻入病毒DNA的幾率，是ASFV正確復制所必需的[32]。此外，上述ERCC4樣核酸酶（EP364R）、類λ核酸外切酶（D345L）和PCNA樣蛋白（E301R）等也共同參與了ASFV的BER機制。ASFV通過復雜的DNA合成和修復機制抵御宿主細胞的免疫清除，保障自身的復制。深入解析其中各個編碼蛋白的作用原理，有助于闡明ASFV增殖和免疫逃逸機制，對于抗病毒藥物研發(fā)具有深遠意義。

4.3 ASFV裝配

4.3.1 ASFV裝配過程 ASFV的裝配從ER開始，在核周MTOC區(qū)域的“病毒工廠”中進行?！安《竟S”由ASFV誘導宿主細胞的波形蛋白纖維絲（vimentin filament）形成籠狀結構搭建而成，內部缺乏細胞器，周圍聚集著較多的線粒體和伴侶蛋白[33]。ASFV誘導伴侶鈣蛋白酶和鈣網蛋白的上調以增加ER的折疊能力，大量表達的早期病毒蛋白p54、p17等誘導ER膜塌陷成平行排列的小彎曲或開放結構，隨后轉入“病毒工廠”成為電子致密的病毒內膜前體[13]；p72蛋白以三聚體形式構成殼粒并在病毒內膜前體凸面處以六邊形排列，通過次要衣殼蛋白和p17等內膜蛋白的協(xié)助錨定在內膜，搭建出二十面體衣殼；與此同時，多聚蛋白pp220和pp62及其水解產物也以2個10 nm球狀亞基在內膜前體的凹面下規(guī)則排列形成核心殼，內膜的成熟與衣殼的正確裝配是核心殼組裝的關鍵[4,34]；在衣殼形成的同時，病毒基因組DNA和核蛋白體也被核心殼包裝、濃縮，形成中心電子致密的類核，從二十面體的1個頂點處裝配進入衣殼[35]。需要注意的是，二十面體的組裝與類核的包裝相互 獨立，裝配出現(xiàn)錯誤會導致“空”二十面體顆粒單獨釋放[36]。

4.3.2 裝配相關蛋白 裝配的初始階段，病毒內膜蛋白p54和p17誘導ER膜塌陷形成內膜前體，它們的缺失會顯著影響pp220和pp62的定位，進而阻礙病毒內膜前體的成熟及衣殼、核心殼的正確組裝[4]。結構蛋白p72在細胞質中聚集并組裝成殼粒，非結構蛋白B602L作為分子伴侶參與其折疊和多聚過程[37]；內膜前體上的p49結合并招募殼粒，在五鄰體蛋白H240R周圍聚集形成五鄰體核心，M1249L蛋白則與2個殼粒對結合以連接2個五鄰體核心，作為“骨架”搭建出二十面體框架，決定了衣殼的大小[15]；最后，三聚p72殼粒逐步填充框架，在p17等內膜蛋白的協(xié)助下錨定形成三重對稱體，完成衣殼組裝[4]。衣殼裝配的同時，SUMO樣半胱氨酸蛋白酶S273R水解 加工pp220和pp62并在病毒內膜前體的凹面處組裝成核心殼，抑制S273R的表達會形成非中心電子致密的類核和不規(guī)則厚度的衣殼，導致缺陷型二十面體顆粒的組裝[4,38]。另外，抑制病毒衣殼蛋白p72表達也影響前體蛋白pp220和pp62的翻譯后加工過程，未加工完成的前體蛋白組裝成“拉鏈狀”異常結構，使得病毒顆粒因缺乏核心殼而不具備感染性[12]。鑒于ASFV編碼蛋白p17、p49、p54、H240R、S273R等在病毒裝配過程中的關鍵作用，針對這些蛋白研發(fā)基因缺失或亞單位疫苗，篩選有效的中和抗體或將有助于控制ASF疫情。

4.4 ASFV釋放

4.4.1 ASFV釋放過程 ASFV裝配完成后，再次經由微管蛋白轉運到細胞膜，以“出芽”的方式釋放到細胞外[39]。在這一過程中，組裝成熟的病毒顆粒招募常規(guī)驅動蛋白（conventional kinesin）到“病毒工廠”，ASFV顆粒被識別為“貨物”從核周組裝區(qū)域順行運輸到細胞質膜[40]；隨后，病毒顆粒誘導肌動蛋白聚合，在質膜的內表面形成特征性的肌動蛋白尾部（actin tail）推動其離開宿主細胞表面[41]。病毒感染晚期引起的細胞溶解可能是病毒釋放的另一種機制，通過該途徑釋放的病毒顆粒沒有外囊膜包被[4]。微管在ASFV的侵入和釋放過程中都發(fā)揮了重要作用，而且ASFV感染能夠導致微管蛋白乙酰化提高其穩(wěn)定性。因此，微管解聚類藥物能在一定程度上控制ASFV感染，可作為抗ASFV藥物研發(fā)的方向之一。

4.4.2 釋放相關蛋白 ASFV顆粒的順行運輸由微管介導。在此過程中，衣殼蛋白E120R和p72相互作用招募大量驅動蛋白，E120R與驅動蛋白輕鏈C端的6個四肽重復序列（tetratricopeptide-repeat, TPR）結合從而驅動病毒顆粒向質膜轉運[40]。抑制E120R的表達會導致細胞內病毒顆粒保留在“病毒工廠”而無法向細胞外轉運，因此E120R是病毒釋放和傳播所必需的。CD2v（EP402R）蛋白位于胞外病毒顆粒的 外囊膜，在細胞內則主要以89 kDa糖基化形式的全長蛋白，以及63 kDa的N端糖基化片段和26 kDa的C端非糖基化片段出現(xiàn)[42]。C端非糖基化片段與全長蛋白更多存在于核周病毒工廠區(qū)域的膜成分中，具有富含脯氨酸的PPPKPC重復序列，能夠與肌動蛋白結合銜接蛋白SH3P7相互作用，參與囊泡運輸和信號轉導；而N端胞外區(qū)結構域的糖基化片段在細胞質中的分布更為分散，其依靠Ig-V結構域可與具有CD2配體的豬紅細胞相結合[43]。在感染后期，CD2v蛋白大量定位于高爾基復合體膜以及與高爾基體外側網絡相容的胞內囊泡上，可能通過與網格蛋白銜接蛋白AP-1結合來影響經高爾基體的細胞運輸，進而促進病毒的包裝和釋放[44]。

5 討論

ASF是全球備受關注的重大動物疫病，至今為止仍缺乏有效的防控手段。ASFV具有基因組大、編碼基因多、編碼蛋白多樣，免疫逃逸機制復雜等特點，但隨著病毒蛋白功能和形態(tài)形成機制的逐漸明晰，在ASF疫苗和新藥開發(fā)、疫病防控等方面也取得了一定進展。Quetglas等[45]發(fā)現(xiàn)，膽固醇在病毒內化過程中發(fā)揮重要作用，因此他汀類降膽固醇藥物可有效抑制ASFV的體內感染；絲氨酸蛋白酶可能在病毒組裝中發(fā)揮作用，Galindo等[46]發(fā)現(xiàn)其抑制劑也可用于對抗ASFV感染；驅動蛋白介導的微管轉運在病毒侵入和排出過程中均十分重要，Hernaez等[47]表明微管解聚藥物及動力蛋白抑制劑也能夠有效抑制ASFV感染?？梢灶A見的是，隨著對ASFV形態(tài)形成機制的進一步了解，將會有更多針對病毒-宿主互作的抗病毒藥物投入研發(fā)和生產實踐。

ASFV編碼蛋白眾多，大多數功能未知，嚴重阻礙了病毒感染和復制分子機制的解析。不過隨著冷凍電鏡等蛋白質結構生物學技術的成熟，目前已經解析了部分ASFV編碼的復制相關蛋白晶體結構信息：Liu等[48]通過測定apo-A104R和A104R-DNA復合物的結構，揭示了A104R-DNA相互作用的分子基礎，并發(fā)現(xiàn)二苯乙烯衍生物SD1和SD4可以破壞A104R-DNA結合從而抑制ASFV在豬巨噬細胞中的復制，這為ASFV治療藥物的研發(fā)提供了新思路；在另外一些研究中，Li等[49-51]解析了ASFV dUTPase E165R的結構信息，鑒定了其活性中心（Motif II、III）及關鍵作用位點（S72、D91、Q120、F154），并篩選出了能特異性抑制E165R的小分子藥物；在此基礎上，Zhang等[52]成功制備了E165R關鍵結構區(qū)域（Motif V）的單克隆抗體，為設計研發(fā)特異性靶向E165R的抗體藥物打下了良好基礎。

6 展望

目前，我國養(yǎng)豬業(yè)已進入“后ASF疫情時代”。隨著生物安全法的頒布實施，國內關于ASF防控的各項生物安全措施會更加嚴格，這有助于疫情的進一步控制。但與此同時，我國作為生豬養(yǎng)殖和消費大國，跨區(qū)域的生豬相關產業(yè)鏈的調配活動不可避免，仍存在ASF疫情擴散風險。因此，繼續(xù)加深對ASFV感染和增殖過程的認知，深入解析ASFV形態(tài)的形成機制十分必要。本文對ASFV編碼蛋白在其形態(tài)形成過程中的作用和機制進行全面闡述，希望有助于抑制或阻斷病毒復制的藥物研發(fā)和疫苗新靶點確認，為ASF防控提供幫助。