徐 毅，余良政，林 霜，任同偉，王 豪，曾 昊，郭嘉寧，郭金凡，黃崇強，歐陽康，黃偉堅，韋祖樟，陳 櫻

（廣西大學(xué)動物傳染病與分子免疫學(xué)實驗室 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004）

規(guī)?；B(yǎng)殖模式下，豬群間導(dǎo)致多種呼吸道疾病的病毒傳播能力顯著增強，混合感染的現(xiàn)象頻頻發(fā)生，豬流感病毒（Swine influenza virus, SIV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）混合感染的現(xiàn)象在全國范圍內(nèi)都非常普遍，對多地區(qū)豬群的調(diào)查顯示SIV和PRRSV之間以及不同亞型SIV和不同基因型PRRSV之間的混合感染情況日漸嚴(yán)峻。

PRRSV可引起豬繁殖和呼吸功能障礙的豬繁殖與呼吸綜合征，臨床癥狀多為母豬懷孕后期發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎，幼齡仔豬多因呼吸系統(tǒng)疾病而大量死亡[1]。我國于1996年首次分離到PRRSV美洲型的經(jīng)典株，2006年分離到PRRSV美洲型高致病性變異毒株，2011年分離并鑒定出致病性的PRRSV歐洲型毒株。在中國PPRSV流行毒株主要以美洲型的經(jīng)典株和高致病性變異株為主[2]，但是近些年，有報道證實我國部分省份的歐洲型PRRSV陽性檢出率開始呈現(xiàn)上升態(tài)勢[3]。豬只感染了PRRSV后免疫力下降，導(dǎo)致SIV的感染風(fēng)險大大增加。豬流感（swine influenza, SI）是一種急性、熱性、高度接觸性的呼吸道傳染病，通常在豬場內(nèi)呈現(xiàn)地方性的流行或者大規(guī)模的暴發(fā)，臨床癥狀以咳嗽、呼吸困難、蜷縮為主要特征。目前世界范圍內(nèi)流行的SIV主要為H1N1、H1N2和H3N2三種亞型。不同年齡、性別和品種的豬均能夠感染SIV，豬群感染率高達100%，由其引起的死亡率卻非常低[4]，但是由于與PRRSV等其他病原共感染，導(dǎo)致患病豬的嚴(yán)重程度增加，死亡率也會隨之增高。值得關(guān)注的是，作為不同宿主來源毒株間發(fā)生基因重組的“混合容器”，豬呼吸道上皮同時存在人流感病毒結(jié)合型（唾 液酸α-2,6-半乳糖苷，SAα-2,6-Gal）和禽流感病毒結(jié)合型（唾液酸α-2,3-半乳糖苷，SAα-2,3-Gal）兩類唾液酸受體，能夠重配出具有感染人風(fēng)險的新型流感病毒，對人類健康構(gòu)成了重大的威脅。

兩種病毒均能引起豬的呼吸道癥狀，感染初期難以鑒別診斷[5]。多重PCR方法（multiplex PCR,M-PCR）是基于普通PCR方法開發(fā)出來的一種更加高效的病原鑒定方法，多重PCR方法只需一次PCR反應(yīng)，便可以同時鑒別出多種病原體[6]。與電鏡觀察、病毒分離、免疫組織化學(xué)、ELISA血清學(xué)檢測、熒光抗體技術(shù)等常用的診斷手段相比，多重PCR檢測方法降低了操作難度，減少了操作時間、勞動力和成本，提高了檢測效率[7]。因此，H1-SIV、H3-SIV和歐洲型、美洲型PRRSV四重PCR檢測方法的建立將有助于科研工作者高效地開展分子流行病學(xué)調(diào)查工作，及時了解豬群中病毒流行趨勢，避免漏檢、誤診并針對病毒亞型及時采取應(yīng)對措施，防止混合感染進化出具有高致病力甚至感染人的新型SIV毒株及新的PRRSV變異株，進一步為豬群疫病凈化及免疫保護甚至是公共衛(wèi)生安全保障提供可靠的策略。

1 材料與方法

1.1 樣品與質(zhì)粒 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18T-CZ7HA（H1亞型）、pMD18T-JG13HA（H3亞型）、pMD18T-GX1396MN（NA型）、pMD18T-SHEMN（EU型）均由本實驗室構(gòu)建保存；非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）、豬偽狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus, PRV）、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus, PCV）、豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus, PRoV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）、豬星狀病毒（Porcine Astrovirus, PAstV）陽性病料均由本實驗室收集保存。H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV細胞培養(yǎng)物由本實驗室保存。CSFV活疫苗（細胞源）購自乾元浩生物股份有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 DNA聚合酶（DreamTaqHot Start Green PCR Master Mix）購自美國Thermo Scientific公司；反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase M-MLV）、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP Mixture）購自日本TaKaRa公司；RNA酶抑制劑（RNase Inhibitor）、3×32孔PCR熱循環(huán)儀（ProFlexTM）購自美國Applied Biosystems公司；病毒核酸提取試劑盒（AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit）購自美國Corning公司；DNA凝膠電泳常規(guī)瓊脂糖（Regular Agarose）購自西班牙Biowest公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的病毒全基因組序列，通過大量模板序列的對比，針對H1-SIV、H3-SIV的HA基因和NA-PRRSV、EU-PRRSV的N、M基因的保守區(qū)域，應(yīng)用Primer Premier 5.0分別設(shè)計了四對特異性擴增引物（見表1）。引物送至北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 多重PCR 引物序列Table 1 Sequences of primer for multiplex PCR

表2 應(yīng)用多重PCR 方法對臨床病料的檢測Table 2 Results of clinical samples detected by multiple PCR

1.4 病毒核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄

1.4.1 RNA或DNA的提取 病毒細胞培養(yǎng)物或者陽性臨床樣品于-80℃反復(fù)凍融3次后進行病毒核酸的提取。利用病毒核酸提取試劑盒AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit提取ASFV、PRV和PCV的DNA以及提取H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV、PRoV、PEDV、PAstV的RNA。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA RNA病毒在核酸提取之后，仍需進一步反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA樣本。于200 μL無菌EP管中依次加入總RNA模板8 μL，5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1 μL，反轉(zhuǎn)錄引物0.5 μL，Reverse Transcriptase M-MLV 0.25 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，總體積為12.5 μL，反應(yīng)條件為42℃反應(yīng)1 h，待反應(yīng)結(jié)束后，將所得的cDNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 以實驗室前期構(gòu)建的4種重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用設(shè)計的4對特異性引物在同一反應(yīng)體系中進行PCR擴增，建立總體積為25 μL的多重PCR反應(yīng)體系。此外，仍需對多重PCR的退火溫度（分別為47.5℃、49.5℃、51.5℃、53.5℃、55.5℃、57.5℃），上、下游引物的濃度（終濃度分別為0.125、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75 pmol/μL），循環(huán)數(shù)（分別為25、30、32、34、36、38、40、45個循環(huán)）等反應(yīng)條件進行優(yōu)化。

1.6 多重PCR的特異性、敏感性、重復(fù)性試驗 首先，以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18T-CZ7HA、pMD18TJG13HA、pMD18T-GX1396MN、pMD18T-SHEMN和PRoV、PEDV、PAstV、CSFV的cDNA以及ASFV、PRV、PCV的DNA作為模板，滅菌ddH2O作為陰性對照，對所建立的多重PCR進行特異性試驗。其次，將上述4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合后，10倍比稀釋成濃度為9.86×109～9.86×100copies/μL，對所建立的多重PCR進行敏感性試驗。最后，隨機選擇同一濃度的4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合成9.86×107copies/μL，對所建立的多重PCR進行重復(fù)性試驗。所有反應(yīng)結(jié)束之后，均吸取10 μL PCR終產(chǎn)物，點樣于1.5%的瓊脂凝膠電泳板孔中，140 V電壓，電泳約20 min，于凝膠成像儀紫外成像后分析判定。

1.7 多重PCR方法的臨床應(yīng)用 2020—2021年在廣西各地出現(xiàn)明顯呼吸道癥狀的豬群中，采集病死豬的肺臟組織共計155份，應(yīng)用所建立的多重PCR方法檢測H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR退火溫度的優(yōu)化 建立25 μL多重PCR反應(yīng)體系：DreamTaqHot Start Green PCR Master Mix 12.5 μL，4對特異性引物（25 pmol/μL）均為0.5 μL，4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合物2.5 μL，滅菌ddH2O 6 μL。擴增反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。其中，退火溫度分別設(shè)置為47.5℃、49.5℃、51.5℃、53.5℃、55.5℃和57.5℃。結(jié)果顯示在退火溫度為53.5℃時4條特異性條帶擴增效果均較好，所以最終選取53.5℃作為最適退火溫度（圖1）。

圖1 多重PCR 退火溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization for annealing temperatures of the multiplex PCR

2.2 引物濃度的優(yōu)化 在25 μL多重PCR反應(yīng)體系中，固定退火溫度為53.5℃，將4對特異性上、下游引物終濃度以0.125、0.25、0.375、0.50、0.625和0.75 pmol/μL為6組不同的引物濃度，進行排列組合，其他條件固定不變，進行多重PCR以選出最佳引物濃度。經(jīng)過優(yōu)化，H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV引物對的最佳終濃度為0.375 pmol/μL，EU-PRRSV引物對的最佳終濃度為0.50 pmol/μL（圖2）。

圖2 多重PCR 引物濃度的優(yōu)化Fig.2 Optimization for primer concentrations of the multiplex RT-PCR

2.3 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化 建立25 μL多重PCR反應(yīng)體系，固定最佳退火溫度和最佳引物濃度，保持其他條件不變，將循環(huán)數(shù)分別設(shè)置為25、30、32、34、36、38、40和45個循環(huán)，進行多重PCR。結(jié)果表明，當(dāng)循環(huán)數(shù)為30～40時，擴增條帶均能夠保證清晰明亮，最后選擇30作為最適循環(huán)數(shù)（圖3）。

圖3 多重PCR 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化Fig. 3 Optimization for cycles of the multiplex RT-PCR

2.4 多重PCR反應(yīng)條件的確定 通過摸索并優(yōu)化反應(yīng)條件，最終確定25 μL多重PCR反應(yīng)體系：DreamTaqHot Start Green PCR Master Mix 12.5 μL，H1-SIV、H3-SIV和NA-PRRSV上、下游引物（25 pmol/μL）各0.375 μL，EU-PRRSV上、下游引物（25 pmol/μL）0.5 μL，模板2.5 μL，滅菌ddH2O 6.75 μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，53.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

2.5 多重PCR特異性試驗 分別以H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV、PRoV、PEDV、PAstV、CSFV的cDNA以及ASFV、PRV、PCV的DNA作為模板，滅菌ddH2O作為陰性對照，進行多重PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，只有H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV擴增出與相應(yīng)目的片段大小符合的條帶，而PRoV、PEDV、PAstV、CSFV、ASFV、PRV、PCV均未出現(xiàn)擴增條帶，表明本試驗構(gòu)建的多重PCR檢測方法無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性（圖4）。

圖4 多重PCR 特異性試驗Fig.4 Specif icity test of the multiplex PCR

2.6 多重PCR敏感性試驗 本研究分別將pMD18TCZ7HA、pMD18T-JG13HA、pMD18T-GX1396MN和pMD18T-SHEMN重組質(zhì)粒等比例混合后，10倍系列稀釋，使得4種重組質(zhì)粒的終濃度均為9.86×109～9.86×100copies/μL，進行多重PCR。結(jié)果表明pMD18T-CZ7HA、pMD18T-JG13HA、pMD18T-GX1396MN和pMD18T-SHEMN的檢出下限均為9.86×100copies/μL（圖5）。

圖5 多重PCR 敏感性試驗Fig.5 Sensitivity test of the multiplex PCR

2.7 多重PCR重復(fù)性試驗 選擇4種重組質(zhì)?；旌衔锘蛘卟《炯毎囵B(yǎng)物作為模板，終濃度均為9.86×107copies/μL，其他條件固定不變，進行多重PCR。結(jié)果表明，無論模板是質(zhì)粒還是cDNA，均能夠使用本試驗構(gòu)建的多重PCR方法擴增出均勻一致的目的條帶，具有良好的重復(fù)性（圖6）。

圖6 多重PCR 重復(fù)性試驗Fig.6 Repeatability test of the multiplex PCR

2.8 應(yīng)用多重PCR對臨床樣品檢測 應(yīng)用所建立的多重PCR方法，對2020—2021年從廣西不同地區(qū)采集的1 5 5 份病死豬肺臟組織樣品進行檢測。結(jié)果顯示，SIV、PRRSV陽性分別為34份（21.94%）、27份（17.42%）；H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV陽性分別為24份（15.48%）、20份（12.90%）、27份（17.42%）、0份，其中H1-SIV單一陽性13份（8.39%），H3-SIV單一陽性11份（7.11%），NA-PRRSV單一陽性26份（16.77%），H1-SIV和H3-SIV混合陽性9份（5.81%），H1-SIV和NA-PRRSV混合陽性1份（0.65%）。進一步使用單重RT-PCR檢測方法對這些臨床樣品進行檢測，所得到的結(jié)果和本試驗建立的多重PCR方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率為100%。

3 討論

SIV和PRRSV同為“豬呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）”的原發(fā)性致病原之一[8]，可引發(fā)豬群免疫抑制性疾病，進而導(dǎo)致其他疫病并發(fā)或繼發(fā)感染，加劇患畜病情。近年來，PRRSV和SIV、PRV、PCV、CSFV、PCMV、Mhp等病原體混合感染現(xiàn)象屢見不鮮，其中PRRSV和SIV的共感染趨勢日漸嚴(yán)峻。覃紹敏等[9]對廣西SIV的混合感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)單純的SIV感染率不高，占26.7%，而SIV感染豬只混合感染其他病原現(xiàn)象非常嚴(yán)重，占73.7%，出現(xiàn)二重、三重甚至四重感染的現(xiàn)象，二重感染中SIV和PRRSV混合感染占6.67%。李吉達等[10]對廣西、上海、河南、江蘇、浙江、湖南、山東、河北、江西、福建收集的臨床樣品檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV陽性樣品存在混合感染情況，與SIV、PRV、CSFV、PCV、PCMV的混合感染中雙重感染率最高（62.5%），PRRSV和SIV的混合感染占53.1%，并存在三重、四重、五重、六重感染，而單純的PRRSV感染僅占2.27%。駱永泉[11]對廣西賀州PRRSV進行監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)變異株占多數(shù)，且混合感染現(xiàn)象非常嚴(yán)重，存在PRRSV和SIV二重感染，PRRSV和PCV2二重感染，PRRSV、SIV和PCV2三重感染現(xiàn)象，混合模式主要為二重感染，其中變異株占總的PRRSV陽性的66.7%，PRRSV和SIV混合感染占32.07%。不僅SIV和PRRSV混合感染現(xiàn)象普遍，也存在SIV不同亞型和PRRSV不同基因型之間的混合感染。李冰等[2]對183份樣品檢測發(fā)現(xiàn)存在美洲型經(jīng)典株2份，美洲型變異株31份，歐洲型毒株3份，美洲型變異株和歐洲型毒株混合感染1份。付新亮等[12]對廣西、廣東兩省豬群采集的3265份臨床樣品進行抗體檢測，發(fā)現(xiàn)了不同亞型SIV之間有較為嚴(yán)重的混合感染現(xiàn)象，其中EA H1N1和pdm09、EA H1N1和H3N2 SIV之間混合感染率較高，分別占11.3%（369份）、10.01%（327份），此外還有三種亞型之間的混合感染，占4.65%（152份）。近十多年來，全國范圍內(nèi)單一病毒感染現(xiàn)象逐漸被多重病毒混合感染替代，這提示我們使用單一PCR檢測方法可能存在漏檢，不能正確反應(yīng)病毒流行事實，多重感染已經(jīng)是豬場的常見發(fā)病模式，嚴(yán)重制約了生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

當(dāng)前，已有一些學(xué)者建立了不同類型的多重PCR鑒別檢測方法。韋冠東等[13]建立了檢測SIV、PRRSV、ASFV的三重PCR方法。王洪光等[14]建立了SIV和PRRSV的雙重檢測方法。楊煥良等[15]建立了檢測H1N1、H1N2、H3N2型SIV的多重PCR方法。李冰等[2]設(shè)計了兩對特異性引物，用來擴增美洲型經(jīng)典型毒株、變異型毒株以及歐洲型經(jīng)典毒株。史喜菊等[16]最新建立的SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV的多重?zé)晒釸T-PCR方法，未能鑒別SIV的毒株類型。由于不同基因型PRRSV和不同亞型SIV之間的混合感染越來越普遍，特別是人因流感結(jié)合型受體也能感染SIV，為了滿足豬場疫病防控及臨床診斷，維護公共衛(wèi)生安全的迫切需要，本試驗建立了同時針對H1和H3亞型SIV以及歐洲型和美洲型PRRSV鑒別的多重PCR方法，以篩查豬場中的SIV和PRRSV及混合感染情況，為早期診斷和鑒別提供有力工具。

應(yīng)用建立的多重PCR方法對廣西155份臨床樣品檢測，證實了存在二重混合感染（H1-SIV+H3-SIV）、（H1-SIV+NA-PRRSV），分別占5.81%、0.65%。檢測結(jié)果表明，H1-SIV和H3-SIV仍然廣泛存在于廣西地區(qū)，這與我們近些年的SIV分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)相一致，且兩種亞型SIV在豬只體內(nèi)混合感染。不同亞型病毒在感染豬體內(nèi)易基因重配，可能導(dǎo)致重組進化出具有大規(guī)模爆發(fā)的潛力的強致病力新型毒株，感染人的風(fēng)險隨之增加。單一NAPRRSV感染的檢出率為16.77%，檢出率最高，NAPRRSV在豬群中的潛在威脅相對較高，且已與SIV的共感染，由于突變和重組是PRRSV進化的重要策略[17]，這可能導(dǎo)致產(chǎn)生新的PRRSV變異株。未檢到EU-PRRSV，在一定程度上說明目前廣西地區(qū)廣泛流行的PRRSV是美洲型，與當(dāng)前全國范圍內(nèi)的流行趨勢相一致。以上結(jié)果表明，當(dāng)前廣西的混合感染嚴(yán)重程度較低，應(yīng)密切監(jiān)測病毒流行現(xiàn)狀和趨勢。在生產(chǎn)中，應(yīng)結(jié)合豬場實際情況，針對不同病毒亞型，主要免疫H1-SIV疫苗、H3-SIV疫苗和NAPRRSV疫苗，重點監(jiān)測EU-PRRSV，防止這些病毒流動傳播至廣西并大規(guī)模流行。病毒流動頻率和范圍增加使得混合類型多樣化，臨床區(qū)分困難，傳統(tǒng)或落后的診斷方法易造成誤診、濫用抗生素等藥物的現(xiàn)象，掩蓋并拖延病情使得大規(guī)模疫病暴發(fā)的風(fēng)險大大增加，使用建立的多重PCR方法對臨床分型極為便利，一次操作就能檢測出不同亞型病毒，無論在病毒混合模式的分子流行病學(xué)調(diào)查還是臨床診斷都有著巨大的優(yōu)勢。

本研究針對H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV基因序列，分別設(shè)計特異性引物，經(jīng)過對引物濃度、退火溫度、擴增循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件的優(yōu)化，成功建立了特異性強、敏感度高、重復(fù)性好的多重PCR檢測方法，拓寬了臨床檢測范圍，可一次性快速鑒別檢測出H1-SIV、H3-SIV、NAPRRSV、EU-PRRSV的感染，大大節(jié)約了時間，降低了試劑耗材成本，提高了檢測效率，可應(yīng)用于上述4種病毒的鑒別診斷及流行病學(xué)調(diào)查。