柳方遠(yuǎn)，李雙星，印春生，吉 婧,3，朱明哲,3，劉業(yè)兵

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京10081；2.張家港市畜牧獸醫(yī)站，張家港 215600；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109）

剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasmagondii）是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，對(duì)人、動(dòng)物健康帶來(lái)嚴(yán)重影響。全球約三分之一的人感染弓形蟲(chóng)，我國(guó)弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率約為8%[1]。健康人群感染弓形蟲(chóng)通常不會(huì)造成明顯的臨床癥狀，免疫缺陷者感染會(huì)造成嚴(yán)重的后果，甚至死亡，孕婦感染弓形蟲(chóng)會(huì)垂直傳播給下一代，甚至?xí)斐商毫鳟a(chǎn)、死胎[2-3]。弓形蟲(chóng)也廣泛感染動(dòng)物，其中豬的感染率為25.8%，山羊的感染率為3.9%～19.2%，牛的感染率為0.2%～43%，雞的感染率為15%～20%，犬的感染率為3.69%～43%，貓的感染率可高達(dá)70%[4-5]。對(duì)畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，犬貓等寵物感染還會(huì)給人類(lèi)公共健康造成隱患。

犬感染弓形蟲(chóng)病通常是由于吞食了含有弓形蟲(chóng)滋養(yǎng)體及包囊的肉、內(nèi)臟、排泄物等，此時(shí)犬體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生子孢子或滋養(yǎng)體，最終形成包囊并在機(jī)體組織中長(zhǎng)時(shí)間停留，成為弓形蟲(chóng)傳播的中間宿主[6]。大多數(shù)健康的成年犬感染弓形蟲(chóng)后為隱性感染，少部分犬癥狀類(lèi)似犬瘟熱和犬傳染性肝炎，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、精神萎靡、虛弱、呼吸困難，甚至出現(xiàn)劇烈的出血性腹瀉，嚴(yán)重會(huì)致死[7]。如果犬感染弓形蟲(chóng)沒(méi)有被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，會(huì)對(duì)人和動(dòng)物造成嚴(yán)重的健康威脅。ChineseⅠ蟲(chóng)株是我國(guó)人和動(dòng)物感染的主要基因型，關(guān)于該蟲(chóng)株的致病機(jī)理和入侵規(guī)律尚不清楚，我國(guó)關(guān)于犬弓形蟲(chóng)感染的相關(guān)研究較少，且尚未發(fā)現(xiàn)以犬為模型探索弓形蟲(chóng)速殖子在其體內(nèi)的分布規(guī)律的研究報(bào)道。因此，高效檢測(cè)犬的弓形蟲(chóng)感染、摸清弓形蟲(chóng)在犬體內(nèi)的組織分布對(duì)預(yù)防和控制弓形蟲(chóng)的傳播具有重要意義。本研究旨在建立一種適合犬弓形蟲(chóng)感染的組織檢測(cè)方法，以期為犬弓形蟲(chóng)病的致病機(jī)理和病理學(xué)診斷提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、蟲(chóng)株及試驗(yàn)動(dòng)物 弓形蟲(chóng)ChineseⅠ蟲(chóng)株、Vero細(xì)胞均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；牛巴貝斯蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、犬新孢子蟲(chóng)基因組由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)；比格犬在華派生物工程集團(tuán)有限公司動(dòng)物房飼養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑 Percol l純化液購(gòu)自索萊寶公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；ExTaq聚合酶、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；超微量分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Colibri公司；高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIORAD公司；梯度PCR儀購(gòu)自德國(guó)耶拿公司；核酸電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.3 弓形蟲(chóng)DNA的制備 使用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換一次液。待Vero細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%細(xì)胞瓶時(shí)，更換2%胎牛血清細(xì)胞維持培養(yǎng)基待用。復(fù)蘇凍存的弓形蟲(chóng)ChineseⅠ株，接種入Vero細(xì)胞中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周左右，待細(xì)胞基本脫落且蟲(chóng)體大量溢出時(shí)，收集弓形蟲(chóng)速殖子，并使用Percol l試劑純化。將純化后的弓形蟲(chóng)速殖子按血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因提取，經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織樣品的準(zhǔn)備 弓形蟲(chóng)感染比格犬：選擇日齡一致，體格相似的SPF比格犬6只，試驗(yàn)犬編號(hào)為2117、2118、2119、2120、2076，2123。將2×104個(gè)/mL弓形蟲(chóng)速殖子耳緣靜脈注射比格犬5只，每只注射0.5 mL，設(shè)置1只空白對(duì)照犬，攻蟲(chóng)42 d后解剖。犬的解剖和組織采樣：將攻蟲(chóng)犬和空白對(duì)照犬心臟采血后處死，使用解剖器具將犬進(jìn)行解剖，取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹膜肌、舌肌、淋巴結(jié)、睪丸。分別從組織四周及中央剪取5個(gè)點(diǎn)的病料組織塊，每點(diǎn)組織塊約1 cm×1 cm×1 cm大小。犬生殖器（睪丸或子宮）取整體的1/3，犬頸下淋巴結(jié)取全部。將每種組織病料置于研磨缽中剪碎，混合均勻，加入液氮輔助研磨成粉狀，裝入自封袋，做好標(biāo)記，使用試劑盒提取DNA。

1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank（登錄號(hào)：DQ779191.1）發(fā)表的弓形蟲(chóng)529 bp重復(fù)序列，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)巢式PCR引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 529 bp 重復(fù)序列基因引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers specif ic for 529 bp repetitive sequence gene

1.6 PCR擴(kuò)增 第1輪PCR反應(yīng)體系：2×ExTaq酶10 μL，Toxo-outF/R各1 μL，弓形蟲(chóng)DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；共95℃變性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。第2輪PCR反應(yīng)體系：2×ExTaq酶10 μL，Toxo-innerF/R各1 μL，第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，66℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.7 特異性試驗(yàn) 用建立的巢式PCR方法檢測(cè)弓形蟲(chóng)、牛巴貝斯蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、犬新孢子蟲(chóng)基因組，使用ddH2O作陰性對(duì)照，檢測(cè)巢式PCR方法特異性，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.8 靈敏度檢測(cè) 使用超微量分光光度計(jì)測(cè)出弓形蟲(chóng)DNA的濃度，然后使用ddH2O將其連續(xù)10倍比稀釋?zhuān)源俗鳛槟０?，使用?guó)標(biāo)PCR方法（GB/T 18448.2，2008）和所建立的巢式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)比較。統(tǒng)計(jì)可檢測(cè)出的弓形蟲(chóng)DNA的最低濃度。國(guó)標(biāo)PCR方法引物序列見(jiàn)表2，反應(yīng)體系為：2×ExTaq酶25 μL，引物各1 μL，樣品2 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸8 min。

表2 國(guó)標(biāo)PCR 引物序列Table 2 National standard PCR primer sequence

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 將弓形蟲(chóng)DNA作為模板，按照1.5 PCR擴(kuò)增的條件和方法做3組重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.10 臨床檢測(cè) 將研磨后的組織按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將提取的60份犬的組織DNA樣品稀釋成同濃度，作為模板，用建立的巢式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn) 利用本研究所建立的巢式PCR方法對(duì)牛巴貝斯蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、犬新孢子蟲(chóng)基因組和空白對(duì)照組進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)條帶出現(xiàn)，而對(duì)弓形蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照組的擴(kuò)增在529 bp處有明顯的條帶，與目的片段的大小一致（圖1），說(shuō)明該方法的特異性高。

圖1 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The result of specif icity test

2.2 靈敏度檢測(cè) 將10倍系列稀釋的基因組作為模板，分別采用建立的巢式PCR方法和國(guó)標(biāo)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。巢式PCR方法對(duì)弓形蟲(chóng)529 bp重復(fù)序列的最低檢測(cè)量是0.134 pg，國(guó)標(biāo)PCR方法最低檢測(cè)濃度為13.4 pg，說(shuō)明建立的PCR方法檢測(cè)靈敏度較高，比國(guó)標(biāo)PCR高100倍（圖2，圖3）。

圖2 國(guó)標(biāo)PCR 靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Result of national standard PCR

圖3 巢式PCR 靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Result of Nested PCR

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 使用巢式PCR做3組重復(fù)試驗(yàn)，加入模板的泳道均能擴(kuò)增出529 bp的條帶，且條帶清晰，易于觀察。說(shuō)明建立的巢式PCR方法重復(fù)性較好（圖4）。

圖4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Result of repeatability test

2.4 臨床檢測(cè)結(jié)果 使用巢式PCR檢測(cè)方法檢測(cè)感染犬組織DNA樣品，在攻蟲(chóng)犬2117的腦組織樣品，攻蟲(chóng)犬2118的舌肌、脾臟，攻蟲(chóng)犬2119的腎臟，攻蟲(chóng)犬2120的心臟、睪丸，攻蟲(chóng)犬2076的心臟、腹膜肌檢測(cè)出弓形蟲(chóng)529 bp基因，陰性對(duì)照犬2123無(wú)條帶出現(xiàn)，未檢測(cè)出弓形蟲(chóng)感染（圖5）。

圖5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Result of samples test

3 討論

用于弓形蟲(chóng)的檢測(cè)方法主要包括病原學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)等。病原學(xué)檢測(cè)應(yīng)用較少，免疫學(xué)檢測(cè)適用于弓形蟲(chóng)的血清學(xué)檢測(cè)，靈敏度和特異性較高，應(yīng)用廣泛；分子生物學(xué)檢測(cè)主要有核酸探針、PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)[8-9]。PCR技術(shù)在弓形蟲(chóng)檢測(cè)中可以在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)弓形蟲(chóng)基因組特定的片段進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)速度快、靈敏度高、結(jié)果可靠[10]。

目前弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法應(yīng)用較廣，常用的靶基因有B1、P30、529 bp重復(fù)序列等[11]，相對(duì)于其他基因，529 bp重復(fù)序列具備更高的拷貝數(shù)。本研究以重復(fù)序列529 bp基因?yàn)榘谢?，建立了犬弓形蟲(chóng)巢式PCR檢測(cè)方法[12]。結(jié)果顯示，最低檢出弓形蟲(chóng)DNA濃度為0.134 pg，比國(guó)標(biāo)普通PCR檢測(cè)方法的靈敏度高100倍，因此本方法靈敏度較高。利用巢式PCR方法對(duì)其他常見(jiàn)寄生蟲(chóng)的基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果無(wú)條帶，說(shuō)明該方法特異性強(qiáng)。重復(fù)性試驗(yàn)做了3次，表明該方法穩(wěn)定。對(duì)感染弓形蟲(chóng)的犬組織DNA樣品檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，能夠在心臟、大腦、舌肌、脾臟、腎臟、睪丸、腹膜肌中檢測(cè)出弓形蟲(chóng)DNA。以上數(shù)據(jù)表明本方法可用于臨床疑似弓形蟲(chóng)感染樣品的檢測(cè)，為后續(xù)弓形蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布研究奠定技術(shù)方法。

隨著寵物犬?dāng)?shù)量不斷增多，研究發(fā)現(xiàn)犬感染弓形蟲(chóng)的比例不斷增長(zhǎng)，犬弓形蟲(chóng)病對(duì)人和動(dòng)物造成的健康威脅日益增大。弓形蟲(chóng)進(jìn)入宿主體內(nèi)粘附、侵入和增殖的過(guò)程十分復(fù)雜，其在不同動(dòng)物不同組織中的分布規(guī)律存在差異，目前對(duì)于中國(guó)流行株弓形蟲(chóng)ChineseⅠ的致病性及組織分布研究較少。因此，探討弓形蟲(chóng)對(duì)犬組織嗜性研究，建立快速有效的檢測(cè)方法將有助于對(duì)弓形蟲(chóng)感染機(jī)制的理解，為弓形蟲(chóng)的檢測(cè)與診斷提供新的思路。