孫 彤，孫竹筠，劉靜宜，王培培，蘇 萇，陳鴻軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 獸藥評(píng)價(jià)中心，上海 200241）

尼帕病毒（Nipah virus, NiV）為副粘病毒科，亨尼病毒屬，具有宿主范圍廣、致死率高的特點(diǎn)，尼帕病毒?。∟ipah virus disease, NVD）為人畜共患的自然疫源性疾病，于1998年首次在馬來(lái)西亞被發(fā)現(xiàn)，隨后在新加坡、馬來(lái)西亞、印度等國(guó)家暴發(fā)[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，為公共衛(wèi)生帶來(lái)巨大威脅。2018年世界衛(wèi)生組織將NVD列為對(duì)公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅的有限疾病名單[2]。目前全球暴發(fā)的NiV感染來(lái)源于同一病毒株，該毒株在傳播過(guò)程中由于遺傳變異進(jìn)化出馬來(lái)西亞株（NiV-M）和孟加拉株（NiV-BD）[3]。人感染NiV可發(fā)生嚴(yán)重神經(jīng)性腦炎或呼吸系統(tǒng)疾病，死亡率高達(dá)到40%～70%。豬感染NiV后表現(xiàn)為呼吸急促，發(fā)展為呼吸困難并伴隨非自主性咳嗽[4]，死亡率在5%左右[5]。

研究表明，NiV的傳播能跨越物種障礙，可通過(guò)病毒溢出的方式感染人和其他哺乳動(dòng)物。果蝠（Fruit bats）為NiV的天然宿主，是引起人和豬NiV感染的主要媒介生物[6]。曾在馬來(lái)西亞、新加坡暴發(fā)的NiV感染，主要為豬場(chǎng)工作人員和屠宰場(chǎng)工人，因此豬是該病毒傳播途徑中重要的中間宿主：豬撿食果蝠吃剩的帶毒果實(shí)感染，人接觸豬后感染NiV患病，另外豬場(chǎng)建在果蝠棲息地邊緣也可直接導(dǎo)致病毒傳入豬群[7]。除此之外，野生動(dòng)物也可通過(guò)某種途徑將NiV直接傳染給人[8]。目前中國(guó)還未發(fā)現(xiàn)NiV感染和流行的相關(guān)報(bào)道，但果蝠在云南地區(qū)活動(dòng)頻繁，攜帶大量病毒，其中包括2018年在廣東暴發(fā)的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒，該病毒與NiV的傳播途徑具有相似性[3]。中國(guó)作為養(yǎng)豬大國(guó)，工作人員極易通過(guò)密切接觸NVD病豬引起感染，但目前仍沒(méi)有針對(duì)NiV的有效預(yù)防和治療措施，因此，需建立完善的NiV監(jiān)控及檢測(cè)手段，防范NiV的感染和傳播。

NiV與豬流感、豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬偽狂犬等病毒引起的癥狀相似，臨床上難以區(qū)分，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是最有效的監(jiān)控方法[10]。NiV屬于第一類病原微生物，需在生物安全四級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-4）進(jìn)行分離培養(yǎng)，一般實(shí)驗(yàn)室不具備處理?xiàng)l件。qPCR無(wú)需活病毒樣本，可在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，不易發(fā)生生物安全事故，且準(zhǔn)確度、敏感性、特異性高，耗時(shí)短，適用于樣本中NiV的快速檢測(cè)及鑒定。本研究建立了針對(duì)NiVN基因的TaqMan qPCR檢測(cè)技術(shù)，特異性敏感性高，穩(wěn)定性好，能為NiV的臨床診斷提供快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法，有效監(jiān)控豬群，防止感染的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 核酸、病毒和質(zhì)粒 非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）基因組DNA、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、豬瘟病毒（Swine fever virus,CSFV）、豬偽狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus, PRV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存；含N基因序列（GenBank登錄號(hào)為：AJ627196.1）的重組質(zhì)粒pUC57-NiVN（4299 bp），由生工生物工程（上海）有限公司合成；AceQ U+Probe Master Mi、DL2000 Marker、T7 High Yield RNA Transcription Kit、Hiscript Ⅱ U+One Step qRTPCR kit購(gòu)自南京諾唯贊公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 引物及探針 根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針；擴(kuò)增的目的片段為132 bp；探針5'端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1淬滅基團(tuán)；含T7啟動(dòng)子的引物，目的片段為784 bp。引物和探針由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

表1 引物和探針序列Table 1 Sequence of primers and probe

1.5 反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 采用AceQ U+Probe Master Mix說(shuō)明書(shū)推薦的20 μL體系：10 μmol/L qF/R 0.4 μL，10 μmol/L Probe 0.2 μL，模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件：37℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)建立初步反應(yīng)體系，在52℃～64℃范圍內(nèi)篩選最佳退火溫度，矩陣法篩選最優(yōu)引物和探針濃度，優(yōu)化qPCR的反應(yīng)體系。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將NiV 質(zhì)粒10 倍系列濃度梯度（1.48×109～1.48×100copies/μL）稀釋，以稀釋后的各濃度質(zhì)粒為模板，按照優(yōu)化后的體系進(jìn)行qPCR試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，以起始模板濃度的對(duì)數(shù)及Ct值為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 重復(fù)性、敏感性、特異性試驗(yàn) 根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算變異系數(shù)（coefficient of variation, CV）評(píng)估方法的重復(fù)性，確定檢出限，并與常規(guī)PCR對(duì)比以評(píng)估敏感性；以常見(jiàn)豬傳染病病毒ASFV的基因組DNA、PRRSV、CSFV、PRV、PEDV的cDNA及健康豬血清為陰性對(duì)照，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以評(píng)價(jià)方法的特異性。

1.8 模擬臨床樣本檢測(cè) 用健康豬血清10倍系列梯度稀釋初始濃度為1.48×109copies/μL的NiV質(zhì)粒，摸擬不同濃度臨床樣本。取梯度稀釋后的模擬樣本200 μL，提取DNA后取100 ng左右為模板進(jìn)行qPCR試驗(yàn)。

1.9 體外轉(zhuǎn)錄制備假病毒檢測(cè) 以NiV質(zhì)粒為模板，用含T7啟動(dòng)子的引物進(jìn)行PCR后得到體外轉(zhuǎn)錄模板，T7 High Yield RNA Transcription Kit將擴(kuò)增產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄為RNA，即為NiV假病毒核酸，將制備的NiV假病毒核酸按10倍梯度稀釋成10個(gè)濃度作為模板（100～10-9），按優(yōu)化后的引物濃度及退火溫度進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的建立與優(yōu)化 反應(yīng)體系經(jīng)優(yōu)化后的最佳退火溫度為64℃，最佳上、下游引物濃度為0.8 μmol/L；探針濃度為0.5 μmol/L（Ct值=20.33±0.13）（表2）。

表2 不同探針和引物濃度下的Ct 值Table 2 Ct values at diff erent concentrations of probe and primers

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得NiV重組質(zhì)粒濃度為7 ng/μL；根據(jù)公式y(tǒng)（copies/μL）=[x(g/μL)/（堿基數(shù)×660）]×6.02×1023，換算為1.48×109copies/μL，用ddH2O 10倍梯度稀釋至1.48×101copies/μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y = -3.27×X+38.673，擴(kuò)增效率（eff%）為102%，表明擴(kuò)增效率高，R2=0.996表明不同濃度梯度模板量的對(duì)數(shù)值與Ct值之間呈現(xiàn)良好的相關(guān)性（圖1）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

2.3 敏感性與重復(fù)性 將1.48×109～1.48×100copies/ μL的NiV重組質(zhì)粒重復(fù)測(cè)定（n=3），測(cè)試該方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示CV＜2%；可檢測(cè)到的最低拷貝數(shù)為14.8 copies/ μL（表3），表明方法重復(fù)性良好，結(jié)果穩(wěn)定（圖2），敏感性高于常規(guī)PCR（圖3）。

圖2 NiV qPCR 擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplif ication curve of NiV qPCR

圖3 NiV 常規(guī)PCR 結(jié)果Fig.3 Conventional PCR results for NiV

表3 敏感性和重復(fù)性Table 3 Accuracy and repeatability

2.4 qPCR的特異性 用該方法檢測(cè)ASFV、PRRSV、CSFV、PRV、PEDV均為陰性，僅NiV出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表明該方法具有高特異性（圖4）。

圖4 NiV qPCR 特異性Fig.4 Specif icity of NiV qPCR

2.5 模擬臨床樣本檢測(cè) 將拷貝數(shù)為1.48×109copies/μL的NiV質(zhì)粒以健康的豬血清為基質(zhì)進(jìn)行10倍梯度稀釋，設(shè)置7個(gè)濃度梯度，模擬不同濃度帶毒血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示可檢測(cè)到稀釋度為1×10-5的樣本，此時(shí)重復(fù)性降低，Ct值為37.8，但仍有明顯擴(kuò)增曲線（圖5）。

圖5 模擬樣本中NiV qPCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplif ication of qPCR results for NiV

2.6 體外轉(zhuǎn)錄制備雙鏈RNA檢測(cè) 設(shè)計(jì)含T7啟動(dòng)子的引物，以NiV病毒質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR后得到的擴(kuò)增產(chǎn)物作為體外轉(zhuǎn)錄的模板，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化后得到的RNA為核酸，測(cè)得濃度為578 ng/μL，純度OD260/OD280=1.8，梯度稀釋后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，當(dāng)RNA模板稀釋度為1×10-7時(shí)，該方法仍表現(xiàn)出良好重復(fù)性，稀釋度為1×10-9時(shí)仍可出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但此時(shí)重復(fù)性差，易出現(xiàn)陰性結(jié)果（圖6）。

圖6 NiV qRT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Results of qRT-PCR amplif ication for NiV

3 討論

NiV基因組由6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位和3'端的非翻譯區(qū)組成，6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位為N、P、M、F、G、L，分別翻譯為核衣殼蛋白、磷蛋白、膜蛋白、融合蛋白、糖蛋白、大蛋白[1]。NiV的N蛋白和P蛋白可同源結(jié)合，也可異源結(jié)合形成N-P復(fù)合物[11]。副粘病毒的N蛋白為典型的螺旋或人字形結(jié)構(gòu)，通常用于識(shí)別該家族的病毒[13]，大多數(shù)副粘病毒N蛋白攜帶所謂的“不變”序列F-X4-Y-P-X3-S-Y-A-M-G，該序列同樣存在于NiV N蛋白中[14]，N蛋白在NiV中含量豐富，與副粘病毒亞科中其他病毒的N蛋白僅20%～30%同源性[12]。已有研究使用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了NiV的N蛋白，且能在Western blot反應(yīng)中與陽(yáng)性血清反應(yīng)，說(shuō)明以原核表達(dá)的重組N蛋白作為檢測(cè)抗原可行[15]，因此N蛋白的氨基酸和基因序列在NiV的實(shí)驗(yàn)室診斷研究中具有重要意義。

隨著國(guó)際貿(mào)易發(fā)展，NiV對(duì)中國(guó)邊境的威脅日益顯露，但由于其生物等級(jí)較高，分子生物診斷方法以敏感性高，易進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)成為NiV風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的重要方式。本研究根據(jù)NiVN基因中有兩個(gè)ORF，能高效表達(dá)且具有高度保守性的特性，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針，通過(guò)優(yōu)化體系，建立的qPCR方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，敏感性高，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1.48×109～1.48×101copies/μL，Ct值＜35，盡管模板為1.48×101copies/μL時(shí)，Ct值＞35，但此時(shí)仍有典型擴(kuò)增曲線且重復(fù)性良好，且該方法敏感性高于普通PCR；特異性強(qiáng)，不能擴(kuò)增出除NiV外其他常見(jiàn)豬病毒核酸。用該方法對(duì)質(zhì)?；旌辖】地i血清，及體外轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)到1×10-5稀釋度的模擬樣本中NiV，及1×10-9稀釋度的NiV RNA。該方法能夠滿足未知樣本中NiV的定性及定量檢測(cè)要求，且制備的體外轉(zhuǎn)錄雙鏈RNA，濃度高，純度好，無(wú)生物感染性，可作為NiV檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照。