寧宇春，王圓赫，郭祥杰，朱宏陽，田萬年

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院，吉林 132101；2.圖們市涼水鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，圖們 133100）

羊泰勒蟲?。╫vine and caprine theileriosis）是一種經(jīng)蜱傳播的寄生于羊紅細胞內(nèi)血液原蟲病[1]。本病對羔羊和外地引進羊危害較嚴重，病羊多表現(xiàn)為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿，嚴重時可引起死亡，從而限制了地方性養(yǎng)羊的發(fā)展，給我國養(yǎng)羊業(yè)造成較大危害[2-3]。嗜吞噬細胞無漿體（A.phagocytophilum, AP）于1932年在蘇格蘭地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，引起羊不明發(fā)熱，是一類經(jīng)蜱傳播的寄生于紅細胞內(nèi)細菌性病原[5]。嗜吞噬細胞無漿體是一種人畜共患傳染病，屬于自然疫源性疾病，可引起宿主動物貧血，血小板減少，消瘦等臨床癥狀[6-7]。嗜吞噬細胞無漿體可誘導機體發(fā)生炎癥和免疫反應，同時能夠介導免疫活性細胞及炎性因子對宿主細胞的攻擊，最終導致機體出現(xiàn)免疫抑制。

以上兩種病原都由硬蜱傳播，主要發(fā)生于媒介硬蜱活動期間，易發(fā)生混合感染，且其臨床癥狀表現(xiàn)相似。因此，血液涂片檢測易出現(xiàn)漏診或誤診的弊端，采用PCR檢測具有更高的特異性和敏感性，從而使病原體的診斷更加可靠。目前尚未見羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體的雙重PCR檢測方法，本研究旨在通過建立更加快速、特異的雙重PCR檢測方法，為羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體的快速診斷和流行病學調(diào)查提供了適用先進技術。

1 材料與方法

1.1 病料來源 血液樣本于2020年5月，采自吉林省圖們市散養(yǎng)的綿羊60份，無菌采取抗凝血，同時制作血液涂片供鏡檢，-20℃保存?zhèn)溆?。弓形蟲、牛瑟氏泰勒蟲、無漿體和附紅細胞體標準基因組DNA由延邊大學農(nóng)學院薛書江博士惠贈。

1.2 主要試劑 DNA回收試劑盒、血液DNA試劑盒、DL2000 DNA marker均購自天根生化科技（北京）有限公司，TaqPreMix購自華美生物工程有限公司。

1.3 引物設計 根據(jù)NCBI已經(jīng)收錄羊泰勒蟲MPSP基因（G Q 2 8 1 0 4 4）和 無漿體1 6 S r R N A 基因（JN558815），設計了兩對引物。P1上游引物：5'-CACGCTATGTTGTCCAAGAG-3'，下游引物：5'-TGTGACACTCAATGCGCCTA-3'。擴增片段大小為875 bp，P2上游引物5'-TCGTGTCGTGAGATGT TGGTT-3'，下游引物：5'-TGGCTGCTTCCTT TCGGTTAG-3'，片段大小394 bp，以上引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.4 雙重PCR方法擴增 提取過程依據(jù)試劑盒操作手冊進行，獲取的DNA低溫保存。以提取的羊基因組DNA為模板，PCR體系（25 μL）為：ddH2O 9 μL，TaqPreMix 12.5 μL，羊基因組DNA 2.5 μL，MPSP和16S rRNA上、下游引物各0.5μL。反應程序：95℃預變性3 min；94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸30 s，共33個循環(huán)；72℃再延伸7 min。陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.5 退火溫度的篩選 在54℃～60℃范圍內(nèi)進行雙重PCR擴增，篩選出雙重PCR最佳的退火溫度。

1.6 特異性試驗 用優(yōu)化的雙重PCR分別以羊泰勒蟲、嗜吞噬細胞無漿體、附紅細胞體、弓形蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板進行擴增，分析該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 用紫外分光光度計測定已提取的羊基因組DNA的D260值，計算DNA含量，進行10倍稀釋后，分別進行PCR擴增。

1.8 臨床樣本的檢測 對臨床中60份綿羊抗凝血進行雙重PCR檢測和血涂片鏡檢，比較兩種方法的陽性檢出率和陽性符合率。

2 結果

2.1 血涂片鏡檢 羊血涂片經(jīng)吉姆薩染色后，經(jīng)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)紅細胞內(nèi)呈圓形、桿狀和梨籽形蟲體，初步診斷紅細胞內(nèi)含有羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體（圖1）。

圖1 血液涂片吉姆薩染色鏡檢結果（1000×）Fig.1 Microscopic examination of Giemsa stained blood smears (1000×)

2.2 雙重PCR方法擴增 用羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體引物分別對羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體的DNA和混合感染DNA進行PCR擴增，電泳結果顯示分別出現(xiàn)875 bp和394 bp特異性條帶，與預期結果一致（圖2）。

圖2 羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體PCR 擴增結果Fig.2 PCR amplication result of ovine and caprine theileriosis and AP

2.3 雙重PCR退火溫度的篩選 通過對不同退火溫度的篩選，結果顯示在56℃時，羊泰勒蟲PCR擴增產(chǎn)物和嗜吞噬細胞無漿體PCR擴增產(chǎn)物目的條帶均較亮（圖3），56℃為最佳退火溫度。

圖3 PCR 退火溫度的篩選試驗Fig.3 Screening test for annealing temperature

2.4 雙重PCR特異性試驗 將以羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體混合感染及單一感染的DNA、附紅細胞體、無漿體、弓形蟲和瑟氏泰勒蟲DNA為模板進行擴增。電泳結果顯示，羊泰勒蟲和無漿體混合感染和單一感染均可擴增出預期條帶，而作為對照樣本均無擴增條帶出現(xiàn)（圖4）。

圖4 特異性擴增試驗Fig.4 The result of specif ic test

2.5 雙重PCR敏感性試驗 將混合感染羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體的抗凝血提取DNA，分光光度法測定DNA濃度，依次做10倍梯度稀釋，分別進行雙重PCR擴增，反應結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖5）。檢測羊泰勒蟲DNA最低含量為16 fg/μL，嗜吞噬細胞無漿體的DNA最低含量為1 fg/μL。

圖5 敏感性試驗Fig.5 The result of sensitivity experiment

2.6 臨床樣本檢測 雙重PCR對60份羊血液樣本檢測顯示（表1），嗜吞噬細胞無漿體陽性率為13.33%（8/60），羊泰勒蟲陽性率46.67%，混合感染率為10%。血涂片鏡檢顯示，嗜吞噬細胞無漿體陽性率為6.67%，羊泰勒蟲陽性率15%，混合感染為5%，雙重PCR與血涂片鏡檢陽性符合率為100%。

表1 臨床樣品的檢測結果Table 1 Results of PCR assay for clinical samples

3 討論

目前，對羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體的病原檢測方法主要有血涂片方法和PCR方法[8-12]。血液涂片檢測很難與其他血液病原體區(qū)分診斷，且在感染早期，血液中的無漿體數(shù)量較少，不易通過血液涂片檢測到。血清學檢測對抗原和抗體要求較高，還需要篩選多種條件才能建立。分子生物學檢測中，熒光定量PCR雖然敏感性、特異性及準確性較高，可以進行定量分析，但存在試劑及實驗儀器昂貴的弊端，普通PCR方法因具有操作簡單、敏感性高、特異性強的優(yōu)點被廣泛應用于流行病學分析。目前，對某種病原的檢測多采用單PCR方法，但一般只能檢測一種病原，臨床中當多種病原發(fā)生混合感染時，應用普通PCR需要多次擴增篩選，費時費力，使檢測成本顯著增加。本試驗所建立的雙重PCR表明，該方法不但節(jié)約試劑、反應時間，而且還具有高效、經(jīng)濟的特點，更適合在基層獸醫(yī)部門應用。

羊泰勒蟲主要表面蛋白（major piroplasm surface proteins, MPSP）是泰勒蟲感染階段分泌的一種蛋白，是泰勒蟲特有的蛋白，具有較好的保守性[13]。嗜吞噬細胞無漿體選取了保守基因16S rRNA基因，這2種基因自身無特異性結合。試驗結果表明，無論是普通PCR還是雙重PCR擴增除目的條帶外均無非特異性擴增出現(xiàn)，不出現(xiàn)交叉反應。李宏旺等[14]對吉林省琿春牛嗜吞噬細胞無形體調(diào)查顯示，牛東方牛嗜吞噬細胞無形體陽性率為12.5%。應用本試驗建立的雙重PCR方法對吉林省圖們市臨床60份綿羊血樣本檢測，結果顯示，羊嗜吞噬細胞無漿體陽性率為13.33%。進一步證明嗜吞噬細胞無漿體在吉林省延邊地區(qū)流行，豐富了嗜吞噬細胞無漿體流行病學資料。綜上，本研究建立了一種可同時檢測羊泰勒蟲和嗜吞噬細胞無漿體的雙重PCR方法，特異性、重復性好，操作簡便，可用于兩種病原體感染的快速鑒別診斷和分子流行病學調(diào)查。