楊挺懿，楊 婧，黃欣梅，韓凱凱，趙冬敏，章麗嬌，劉宇卓，李 銀，張小飛，劉青濤

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京 210014）

鴨源鵝細(xì)小病毒（Duck-origin goose parvovirus,D-GPV）是細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒亞科依賴病毒屬的單鏈DNA病毒[1]，它的典型臨床癥狀是短喙，脛骨短，生長(zhǎng)遲滯[2]，有學(xué)者指出，此病毒可能是通過影響腸道菌群從而導(dǎo)致發(fā)病[3]。該病首次報(bào)道是在1971年的法國(guó)西南地區(qū)，在我國(guó)最早出現(xiàn)在臺(tái)灣[4]，而后分別于1995年和2000年在波蘭和匈牙利暴發(fā)[5]。2014年以后我國(guó)許多地區(qū)如福建、山東、河北、河南、安徽、江西等地暴發(fā)該病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[6]。

自D-GPV暴發(fā)以來(lái)，許多學(xué)者紛紛建立各種檢測(cè)方法，王劭等[7]建立了PCR-RFLP技術(shù)，有效杜絕了假陽(yáng)性，但是檢測(cè)敏感性較低；劉銘[8]通過重組VP2建立了D-GPV ELISA檢測(cè)方法；Liu等[9]將重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification,RPA）技術(shù)與垂直流（vertical flow, VF）可視化試紙相結(jié)合，該方法特異性好和敏感性高，但是由于還沒有用于RPA檢測(cè)的引物設(shè)計(jì)軟件，因此方法的普及受到限制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）技術(shù)，通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)過程中熒光信號(hào)的累計(jì)強(qiáng)度，從而達(dá)到對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量的目的，省去了普通PCR需要借助核酸電泳進(jìn)行分析的步驟，結(jié)果一目了然，減少了檢測(cè)時(shí)間，大大增加了檢測(cè)效率，具有快速、簡(jiǎn)便、特異性好、敏感性高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，自問世以來(lái)就受到廣泛的青睞[10]。

1 材料和方法

1.1 病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 鴨源鵝細(xì)小病毒（Duckorigin goose parvovirus, D-GPV）、番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）、鴨瘟病毒（Duck plague virus, DPV）、鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus, DuCV）、禽腺病毒血清4型（Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4）、H9亞型禽流感病毒（H9N2 subtype of avian influenza virus, H9N2 AIV）、鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）、坦布蘇病毒（Tembusu virus, TMUV）、鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus, DRV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離并保存。鴨購(gòu)自江蘇麗佳禽業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 RNA/DNA、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自康寧公司；Thermal Cycter Dice Real Time System購(gòu)自TaKaRa公司；T5 Direct PCR Kit (Animal Tissue) 和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京擎科生物公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank的D-GPV全基因序列，用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析，選出高度保守并且特異的核苷酸區(qū)域，用Primer Express軟件設(shè)計(jì)一對(duì)克隆引物，其序列為NS1-F：5'-GGTCGAATTCATGGCACTTTCTAGG-3'和NS1-R：5'-TGAACTCGAGTTATTGTTCA TTTTCAGC-3'，將NS1基因連接到PMD18-T載體中；同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物NS1-911F：5'-ACTGTGGCACCGCTTATTTC-3'和NS1-911R：5'-ATTTCAGCACGGGCATTCTC-3'，擴(kuò)增片段為191 bp。

1.4 病毒DNA的提取 按照試劑盒說明書進(jìn)行提取DNA。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 將含有病毒的尿囊液旋渦振蕩混勻，離心后直接吸取上清液進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為：2× T5 Direct PCR Mix（Animal）20 μL，ddH2O 17.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，上清液1 μL。反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性8 min；98℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定后進(jìn)行膠回收，連接到PMD18-T中，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析，篩選出陽(yáng)性克隆。將質(zhì)粒用EcoRⅠ單酶切進(jìn)行線性化，膠回收后測(cè)定產(chǎn)物濃度，以此來(lái)計(jì)算拷貝數(shù)，-70℃凍存。拷貝數(shù)公式為：6.02×1023（copies/moL）×質(zhì)粒的質(zhì)量濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量（g/moL）。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋（100～107copies/μL）作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。擴(kuò)增體系為：2× ChanQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，引物各1 μL，ddH2O 7 μL，模板1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

1.7.1 敏感性試驗(yàn) 以10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)即為該方法的靈敏度。

1.7.2 特異性試驗(yàn) 用PCR方法，使用上文設(shè)計(jì)的檢測(cè)引物分別對(duì)MDPV、DVE、DuCV、FAdV-4、H9N2 AIV、DHAV、TMUV、DRV、NDV、AIBV進(jìn)行檢測(cè)，以D-GPV作為陽(yáng)性對(duì)照，評(píng)價(jià)該引物的特異性。

1.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 用建立的方法同時(shí)對(duì)1×102、1×104、1×106copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，同一次試驗(yàn)每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分3個(gè)時(shí)間進(jìn)行。根據(jù)Ct值計(jì)算批間和批內(nèi)的變異系數(shù)，檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性。

1.7.4 泄殖腔與咽喉拭子樣品的檢測(cè) 對(duì)4只2日齡雛鴨進(jìn)行口服攻毒，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，攻毒后第1、3、7、14、21、28、35、42 d分別采集泄殖腔和咽拭子，反復(fù)凍融3次后提取DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用微量核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒的濃度，得出結(jié)果為54.900 ng/μL，按照公式計(jì)算得出拷貝數(shù)為：1.09×1010copies/μL，分裝后-70℃凍存。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 對(duì)10倍梯度稀釋（100～107copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)品在濃度為100～107copies/μL時(shí)具有良好的線性關(guān)系（圖1），其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率為99.1%。并且擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線顯示無(wú)非特異性產(chǎn)物，均為單一峰（圖2）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard Curve

圖2 溶解曲線Fig.2 Melt Curve

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)品（100～107copies/μL）的檢測(cè)結(jié)果顯示，在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為101copies/μL時(shí)仍有穩(wěn)定的陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，該實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)最低拷貝數(shù)為10拷貝（圖3）。說明該方法可以對(duì)拷貝數(shù)大于等于10的樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。

圖3 擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplif ication plot

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 用本文所設(shè)計(jì)的熒光定量PCR檢測(cè)引物對(duì)D-GPV和其他10種病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示D-GPV樣品可以擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，而其他病毒均為陰性，這說明本文所設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性（圖4）。

圖4 特異性試驗(yàn)Fig.4 Specif icity Test

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)不同標(biāo)準(zhǔn)品的3次批內(nèi)重復(fù)和3次批間重復(fù)測(cè)定結(jié)果顯示，各標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)變異系數(shù)為0.17%～0.4%，批間變異系數(shù)為0.35%～0.88%，表明該方法重復(fù)性良好（表1）。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)Table1 Repeatability test

2.6 D-GPV攻毒樣品的檢測(cè) 由D-GPV攻毒鴨泄殖腔和咽拭子檢測(cè)結(jié)果顯示，鴨在攻毒后第1 d即可以通過口腔和泄殖腔向外排毒，排毒量在第3 d達(dá)到高峰，并且泄殖腔的排毒量明顯高于口腔。另外，鴨在攻毒后42 d仍然可以通過口腔和泄殖腔向外排毒（表2），這說明鴨在感染D-GPV后可以長(zhǎng)期帶毒、排毒。

表2 D-GPV 在人工感染雛鴨后咽拭子和泄殖腔拭子的qPCR 檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of D-GPV in cloacal and oropharyngeal swabs of artif icially infected ducks by qPCR

3 討論

自2014年我國(guó)暴發(fā)D-GPV以來(lái)，多地養(yǎng)鴨業(yè)受到嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。雖然該病致死率不高，但是一旦發(fā)病，僵鴨淘汰率可高達(dá)80%[11]，將嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。因此，為準(zhǔn)確診斷病原，減少養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，預(yù)防該病毒的大面積傳播，快速、靈敏且準(zhǔn)確的檢測(cè)方法必不可少。

本研究根據(jù)D-GPV的基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性的引物，建立了針對(duì)D-GPV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，本研究建立的qPCR方法敏感性高，最低可檢測(cè)10個(gè)拷貝；特異性很好，溶解曲線均為單一峰，檢測(cè)MDPV、DPV、DuCV、FAdV-4、H9N2 AIV、DHAV、TMUV、DRV、NDV、IBV等病毒均顯示陰性；重復(fù)性好，批間和批內(nèi)的變異系數(shù)較??；在對(duì)攻毒樣品的檢測(cè)中，該方法的檢出陽(yáng)性率為100%。因此，本研究所建立的qPCR方法具有快速、靈敏、穩(wěn)定等特點(diǎn)，適合用于臨床樣品的D-GPV快速檢測(cè)。此外，該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率為99.1%，可以用于病毒的定量檢測(cè)。

用該方法對(duì)D-GPV感染鴨的泄殖腔和咽喉拭子樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，雛鴨感染D-GPV后第1 d即可在咽拭子和泄殖腔拭子中檢測(cè)到病毒，病毒載量在感染后第3 d達(dá)到峰值，隨后逐漸減少，但在感染后第42 d仍可檢測(cè)到病毒；同時(shí)通過觀察臨床癥狀發(fā)現(xiàn)攻毒組中4只鴨均出現(xiàn)體重減輕現(xiàn)象，但僅有2只出現(xiàn)明顯短喙癥狀。表明一旦感染該病毒，宿主可能不表現(xiàn)明顯的典型癥狀但可以長(zhǎng)期通過唾液和糞便排毒，在養(yǎng)殖過程中不斷水平傳播造成大面積感染，從而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)以上結(jié)果，養(yǎng)殖過程中應(yīng)盡可能減少病毒水平傳播的可能，做好水槽、食槽等器材的消毒工作并對(duì)排泄物進(jìn)行無(wú)害化處理。