沈欣悅，劉 梅，李建梅，俞 燕，范建華，戴亞斌

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125）

新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）強(qiáng)毒株引起的一種高度接觸性禽類(lèi)烈性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health, WOAH）將該病列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病，并在《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020）》中明確為優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病。

長(zhǎng)期以來(lái)，N D 的防控主要依賴(lài)于疫苗免疫接種。疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗血凝素-神經(jīng)氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase, HN）和融合蛋白（fusion protein, F）抗體在中和NDV強(qiáng)毒株并阻止其感染中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[1]，與雞抗病毒侵襲能力密切相關(guān)。其中，抗HN抗體可阻斷病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合，而抗F蛋白抗體則可抑制病毒與宿主細(xì)胞融合。通常將雞血清中血凝抑制（hemagglutination inhibition, HI）抗體水平作為評(píng)判ND免疫效果的重要指標(biāo)。然而越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示，雖然免疫雞未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀和死亡，但即使在HI抗體水平較高的雞群中依然存在NDV強(qiáng)毒株感染與排毒現(xiàn)象[2-4]，成為疫病傳播與流行的隱患。

20世紀(jì)90年代中期以后的較長(zhǎng)一段時(shí)期內(nèi)，由于新出現(xiàn)的基因Ⅶ型NDV毒株與我國(guó)廣泛使用的基因Ⅱ型La Sota疫苗株之間存在明顯的遺傳差異和抗原差異，免疫雞群頻發(fā)非典型ND。至今基因Ⅶ型毒株在我國(guó)依然是優(yōu)勢(shì)流行株。2014年揚(yáng)州大學(xué)利用反向遺傳技術(shù)成功研制出與國(guó)內(nèi)主要流行的基因Ⅶ型NDV抗原性和基因型匹配性較好的國(guó)家一類(lèi)新獸藥—重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株），目前已在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。本研究采用該疫苗免疫雞進(jìn)行了攻毒保護(hù)試驗(yàn)，基于不同抗體水平雞攻毒后的臨床癥狀與排毒情況，探討了免疫抗體水平與免疫保護(hù)效果的相關(guān)性，為ND免疫無(wú)疫控制提 供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡地方特色蛋雞購(gòu)自揚(yáng)州翔龍禽業(yè)發(fā)展有限公司，購(gòu)入后按常規(guī)方法隔離飼養(yǎng)。SPF種蛋購(gòu)自浙江恒達(dá)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，自行孵化至10～11日胚齡。

1.2 毒株、疫苗、抗原和血清 標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E8株（基因Ⅸ型）和強(qiáng)毒株JSC0804株（基因Ⅶ型，GenBank登錄號(hào)：MT162178、MT162179）由本實(shí)驗(yàn)室保存，其中JSC0804株分離自發(fā)病雞群[5]。凍存的毒株經(jīng)10日胚齡SPF雞胚傳代2次復(fù)壯，將尿囊液分裝后，-80℃保存，同時(shí)測(cè)定病毒尿囊液ELD50以備用于攻毒試驗(yàn)?？筁a Sota株免疫血清源于自制的滅活疫苗免疫雞，-20℃保存。

重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株，基因Ⅶ型）（以下稱(chēng)“A-Ⅶ株疫苗”）購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司，雞新城疫HI試驗(yàn)抗原（La Sota株）及陽(yáng)性血清購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司；雞新城疫HI試驗(yàn)抗原（A-Ⅶ株）及陽(yáng)性血清購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司。

1.3 疫苗免疫 300只1日齡雛雞購(gòu)回后，定期抽取部分雞只采集血清，采用HI試驗(yàn)檢測(cè)NDV母源抗體水平[6]。待4周齡時(shí)雞母源抗體效價(jià)降至2log2以下后，用A-Ⅶ株疫苗頸部皮下注射進(jìn)行免疫，0.5 mL/只。為獲得足夠數(shù)量的高抗體效價(jià)的雞只，部分雞于初次免疫后3～4周再加強(qiáng)免疫1次。

1.4 A-Ⅶ株和La Sota株間血清學(xué)差異比較 擇部分A-Ⅶ株和La Sota株疫苗免疫雞的血清樣品，同時(shí)采用A-Ⅶ株和La Sota株檢測(cè)抗原進(jìn)行HI試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)。采用GraphPad Prism軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較不同抗原檢測(cè)結(jié)果，分析2個(gè)疫苗株間血清學(xué)差異。

1.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 對(duì)不同免疫抗體水平雞進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，根據(jù)雞攻毒后的臨床癥狀和排毒情況分析免疫抗體水平與攻毒保護(hù)效果的相關(guān)性。

1.5.1 分組與攻毒 雞用A-Ⅶ株疫苗免疫后，每隔4周逐只采血，采用A-Ⅶ株檢測(cè)抗原進(jìn)行HI抗體檢測(cè)，隨即按抗體效價(jià)進(jìn)行分組，每個(gè)抗體效價(jià)為一組，每組5～14只。另設(shè)2組未免疫雞作為無(wú)免疫抗體攻毒對(duì)照組，每組10只。不同抗體效價(jià)組和對(duì)照組雞經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻途徑分別接種0.2 mL經(jīng)稀釋的NDV F48E8株或JSC0804株病毒尿囊液，1×106ELD50/只。

1.5.2 臨床觀(guān)察 攻毒后，每日觀(guān)察和記錄各組雞發(fā)病和死亡情況，直至攻毒后15 d。其間，若發(fā)現(xiàn)死亡雞只，及時(shí)進(jìn)行剖檢。

1.5.3 排毒檢測(cè) 為了解雞攻毒后的排毒情況，自攻毒后第1 d開(kāi)始，隔天逐只分別采集口咽和泄殖腔拭子用于病毒分離，直至攻毒后15 d。采集的拭子樣品置于含有750 μL樣品保存液的Eppendorf管中，-80℃凍存待檢。病毒分離時(shí)，待凍存的拭子樣品充分融化后，將棉簽在管壁上反復(fù)擠壓干后棄去，加入適量青/鏈霉素溶液混勻后，10 000 ×g離心10 min，吸取0.2 mL上清液經(jīng)尿囊腔接種10～11日胚齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接胚2枚。雞胚接種后置37℃繼續(xù)孵化120 h，其間每日定時(shí)照胚。對(duì)于接種后24 h內(nèi)雞胚全部死亡的樣品，則再次接種。收集24～120 h間死亡雞胚以及120 h后存活雞胚尿囊液，采用血凝（HA）試驗(yàn)檢測(cè)其血凝性，若死亡雞胚尿囊液HA試驗(yàn)結(jié)果為陰性，則繼續(xù)傳代2次進(jìn)行確認(rèn)。

1.5.4 攻毒后抗體水平檢測(cè) 攻毒后15 d逐只采集存活雞血樣，采用A-Ⅶ株抗原進(jìn)行HI試驗(yàn)測(cè)定血清中抗體效價(jià)，比較攻毒前后抗體水平變化。

2 結(jié)果

2.1 A-Ⅶ株和La Sota株間血清學(xué)差異比較 A-Ⅶ株疫苗和La Sota株疫苗免疫雞血清樣品分別同時(shí)用A-Ⅶ株和La Sota株抗原進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，A-Ⅶ株疫苗免疫雞血清樣品用2種抗原測(cè)定的結(jié)果間差異極顯著（P＜0.01），A-Ⅶ株抗原測(cè)得的抗體平均效價(jià)較La Sota株抗原抗體平均效價(jià)高（1.51±0.35）log2；La Sota株疫苗免疫雞血清樣品用La Sota株抗原測(cè)得的抗體效價(jià)稍高于A-Ⅶ株抗原，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）（表1）。表明2種疫苗株間存在一定程度的血清學(xué)差異。

表1 兩種抗原測(cè)定的免疫雞血清HI 抗體效價(jià)比較Table 1 Comparison of serum HI antibody titers of the vaccinated chickens detected with two antigens

2.2 雞攻毒后的臨床癥狀 本研究中，免疫雞的抗體效價(jià)范圍為6log2～16log2，未檢測(cè)到抗體效價(jià)低于6log2的雞只。

在試驗(yàn)條件下，對(duì)照組雞大多于攻毒后3 d開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁、呼吸困難、飲食欲廢絕、排綠色稀糞等臨床癥狀，此后陸續(xù)死亡，其中F48E8株攻毒雞的發(fā)病率為100%，死亡率為40%；JSC0804株攻毒雞發(fā)病率與死亡率均達(dá)100%。死亡雞剖檢病變基本一致，主要表現(xiàn)為小腸嚴(yán)重出血，有出血點(diǎn)或出血斑，腦充血、出血，符合典型ND的病變特征。所有免疫雞攻毒后皆未表現(xiàn)明顯臨床癥狀，表明A-Ⅶ株疫苗免疫雞的抗體效價(jià)達(dá)到6log2即可對(duì)雞提供完全臨床保護(hù)。

2.3 不同抗體水平雞攻毒后的排毒情況 排毒檢測(cè)結(jié)果顯示，排毒率與抗體水平密切相關(guān)，不同抗體水平雞攻毒后的排毒率總體上隨抗體效價(jià)的升高呈逐漸下降的趨勢(shì)。采用F48E8株攻毒，免疫雞的抗體效價(jià)≤7log2時(shí)，排毒率達(dá)80%以上，直至抗體效價(jià)≥13log2時(shí)才未檢測(cè)到排毒（表2）；采用JSC0804株攻毒，免疫雞的抗體效價(jià)≤9log2時(shí)，排毒情況較為嚴(yán)重，排毒率達(dá)70%以上，當(dāng)抗體效價(jià)≥14log2時(shí)才無(wú)排毒現(xiàn)象（表3）。

表2 不同抗體水平免疫雞NDV F48E8 株攻毒后排毒檢測(cè)Table 2 Virus shedding detection in vaccinated chickens of diff erent antibody levels after challenge with NDV F48E8 strain

表3 不同抗體水平免疫雞NDV JSC0804 株攻毒后排毒檢測(cè)Table 3 Virus shedding detection in vaccinated chickens of diff erent antibody levels after challenge with NDV JSC0804 strain

免疫雞的排毒基本限于攻毒后5 d內(nèi)，少數(shù)抗體效價(jià)低的雞排毒可延續(xù)至攻毒后9 d或更長(zhǎng)時(shí)間，且前期主要為口咽排毒，后期則以泄殖腔排毒為主（表2，表3）。此外，所有對(duì)照組雞攻毒后均有排毒現(xiàn)象，且排毒期較長(zhǎng)。

2.4 雞攻毒后抗體水平變化 攻毒后15 d的抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，采用F48E8株攻毒，抗體效價(jià)為6log2～8log2組雞攻毒后平均抗體效價(jià)較攻毒前均有不同程度上升，上升幅度隨攻毒前抗體效價(jià)的增加逐漸降低；而抗體效價(jià)≥9log2組雞攻毒后平均抗體效價(jià)均稍低于攻毒前（圖1）。攻毒后，除7log2組（16.48%）與9log2組（18.94%）的抗體效價(jià)變異系數(shù)（coefficient of variation, CV）較高外，其余各組均低于15%。

圖1 免疫雞NDV F48E8 株與JSC0804 株攻毒后15 d 抗體水平變化Fig. 1 The changes of antibody levels of the vaccinated chickens 15 days post-challenge with NDV F48E8 strain and JSC0804 strain

采用JSC0804株攻毒，抗體效價(jià)為6log2～11log2組雞攻毒后的平均抗體效價(jià)較攻毒前有所上升，抗體效價(jià)≥12log2組雞攻毒前后的抗體水平基本無(wú)變化。6log2～8log2組攻毒后的CV值較高（＞15%）（圖1）。

3 討論

雖然所有NDV毒株同屬于一個(gè)血清型（血清1型），但在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，不同分離株間已發(fā)生了較大的遺傳變異。目前，根據(jù)親緣關(guān)系，NDV分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大類(lèi)，其中Class Ⅰ中的毒株只有1個(gè)基因型（基因1型），主要來(lái)自水禽，且除個(gè)別毒株外，其余的皆為弱毒株；ClassⅡ則分為21個(gè)基因型（基因Ⅰ～Ⅻ型），包 含強(qiáng)毒株和弱毒株[7]。臨床ND病例均是由ClassⅡ中的強(qiáng)毒株引起的。與此同時(shí)，不同基因型毒株間在抗原性上也存在一定的差異[8-10]。

在20世紀(jì)40年代以后的很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，由于疫苗的廣泛使用，ND的發(fā)病率和死亡率均得到了較好的控制，但隨著基因Ⅶ型毒株逐漸成為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)流行株，臨床上非典型ND病例十分普遍。在排除免疫程序不合理、免疫抑制病等因素外，疫苗株與流行株的基因型和抗原性不匹配可能是ND免疫失敗的主要原因之一。交叉中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，B1/46和Clone30疫苗株與基因Ⅶ型分離株間抗原性相關(guān)（relatedness, R）值為0.15～0.51[11]，La Sota株與重組基因Ⅶ型毒株aSG10間的R值為0.23[12]，表明常用的La Sota株等基因Ⅱ型疫苗株與基因型Ⅶ型毒株間在遺傳學(xué)和抗原性方面均有較大的的差異。盡管有一些研究者認(rèn)為，對(duì)于具有免疫活性的雞，疫苗株與流行株不匹配并不是ND免疫失敗的主要原因[13-15]，但眾多研究結(jié)果已證實(shí)，雖然常規(guī)疫苗和與流行株基因型匹配的疫苗對(duì)流行株均可提供良好的臨床保護(hù)效果，但后者可顯著降低感染雞的排毒量[16-20]。與常規(guī)La Sota株疫苗相比，A-Ⅶ株疫苗不僅能有效降低免疫雞攻毒后的排毒率，而且能顯著減少口咽和泄殖腔中的病毒載量，排毒高峰時(shí)的病毒量可降低10倍以上[20]。

本研究結(jié)果表明，A-Ⅶ株和La Sota株2個(gè)疫苗株間存在一定的血清學(xué)差異?？笰-Ⅶ株血清用A-Ⅶ株與La Sota株抗原測(cè)得的結(jié)果有極顯著的差異，同源抗原所測(cè)結(jié)果顯著高于異源抗原，平均相差1.51log2。而抗La Sota株血清采用同源和異源抗原測(cè)得的HI抗體效價(jià)差異則不顯著。這與Yang等[12,21-22]報(bào)道的結(jié)果基本一致，提示在臨床上應(yīng)采用與疫苗株同源的檢測(cè)抗原進(jìn)行抗體檢測(cè)，以免影響疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。

本研究模擬自然感染途徑，采用基因Ⅸ型標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E8和基因Ⅶ型分離株JSC0804對(duì)A-Ⅶ株疫苗免疫雞進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)免疫雞的抗體效價(jià)達(dá)到6log2即可對(duì)雞提供完全臨床保護(hù)，這與其他研究者的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。劉秀梵等[23]采用A-Ⅶ株疫苗免疫蛋雛雞，免疫6個(gè)月后雞的HI抗體效價(jià)仍可保持≥6.1log2，且抽樣攻毒后的保護(hù)率為100%。然而，本研究中雖然A-Ⅶ株疫苗可對(duì)雞提供良好的臨床保護(hù)效果，但免疫雞攻毒后表現(xiàn)不同程度的排毒現(xiàn)象，排毒率與HI抗體效價(jià)密切相關(guān)，總體上隨免疫抗體效價(jià)的升高而逐漸下降，抗體效價(jià)分別在≥13log2和≥14log2時(shí)才能完全阻止F48E8株和JSC0804株排毒。此外，免疫雞排毒一般僅限于攻毒后5 d內(nèi)，僅有個(gè)別抗體水平較低的雞可延續(xù)至攻毒后9 d或更長(zhǎng)時(shí)間。汪文斌等[24]報(bào)道La Sota株疫苗免疫抗體效價(jià)≥4log2時(shí)可對(duì)F48E9強(qiáng)毒株攻擊產(chǎn)生完全保護(hù)。徐江濤[25]報(bào)道La Sota株疫苗免疫抗體效價(jià)在6log2以上時(shí)對(duì)基因Ⅶ型流行株的保護(hù)率可達(dá)100%。Yang等[12]對(duì)La Sota株和重組基因Ⅶ型aSG10株疫苗免疫雞進(jìn)行了基因Ⅶ型強(qiáng)毒株SG10株攻毒保護(hù)試驗(yàn)，攻毒后5 d采集泄殖腔拭子進(jìn)行雞胚病毒分離作排毒檢測(cè)，結(jié)果表明，當(dāng)La Sota株疫苗免疫后HI抗體效價(jià)≥7log2（肌內(nèi)攻毒）或≥8log2（點(diǎn)眼滴鼻攻毒）時(shí)可完全抑制排毒，aSG10株疫苗免疫后則在抗體效價(jià)≥5log2或≥7log2時(shí)可完全抑制排毒。這與本研究結(jié)果有較大的差異，可能與疫苗株以及排毒檢測(cè)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)和采集拭子樣品種類(lèi)不盡一致等因素有關(guān)。雖然本研究未對(duì)排毒量進(jìn)行定量分析，但包括本研究在內(nèi)的上述研究結(jié)果可以證實(shí)其他一些研究者[13-15,23]的觀(guān)點(diǎn)，即無(wú)論疫苗株與流行株的基因型是否匹配，只要雞具有良好的免疫應(yīng)答均可提供有效的臨床保護(hù)，在HI抗體效價(jià)足夠高的情況下，也可阻止強(qiáng)毒株的感染和排毒。雖然本研究結(jié)果顯示完全抑制排毒所需的抗體效價(jià)較高，但A-Ⅶ株疫苗具有良好的免疫原性，誘導(dǎo)的抗體水平較La Sota株疫苗高[21]。我們另外的疫苗免疫試驗(yàn)結(jié)果（本文未列出）也顯示，采取同樣的免疫程序，A-Ⅶ株疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)在各時(shí)間點(diǎn)上較La Sota株疫苗高2.2log2～4.6log2，平均約高3.5log2，且高抗體水平維持時(shí)間也較長(zhǎng)。

臨床上有時(shí)會(huì)采用雙份血清（發(fā)病初期和恢復(fù)期）檢測(cè)的方法對(duì)ND進(jìn)行血清學(xué)診斷，若雞群恢復(fù)期血清抗體水平較發(fā)病初期顯著升高，且CV值增大時(shí)，可判定雞群有強(qiáng)毒株感染。文其乙等[26]對(duì)La Sota株弱毒活疫苗免疫雞進(jìn)行了強(qiáng)毒株攻毒試驗(yàn)，比較了平均HI抗體效價(jià)為5.63log2～6.30log2的雞攻毒前后抗體水平的變化，攻毒前免疫雞的抗體效價(jià)CV值均小于10%，攻毒后25 d各組CV值則增加到20%左右，這與本研究結(jié)果基本一致。然而，本研究中高抗體水平組的雞攻毒后即使有排毒現(xiàn)象，但抗體水平未見(jiàn)明顯升高，CV值也較低，表明它們雖可感染，但并未產(chǎn)生明顯的抗體反應(yīng)。因此，對(duì)于免疫抗體水平較高的雞群，雙份血清檢測(cè)方法不一定完全適用于NDV強(qiáng)毒株感染的診斷。

總之，在本實(shí)驗(yàn)條件下，A-Ⅶ株疫苗對(duì)同源和異源強(qiáng)毒株感染均可提供良好的臨床保護(hù)，在HI抗體水平足夠高的情況下，也完全可以阻止強(qiáng)毒株的感染和排毒。但在生產(chǎn)實(shí)際中，要在雞群整體水平上達(dá)到并長(zhǎng)期保持不感染強(qiáng)毒株或感染后不排毒的抗體水平很難實(shí)現(xiàn)。本研究采用連續(xù)免疫2次的方法也僅是獲得少量高抗體效價(jià)的雞只。因此，在ND防控中要正確認(rèn)識(shí)免疫的作用。免疫的目的主要有3個(gè)：一是減少或消除臨床病例；二是降低強(qiáng)毒株感染后排毒量；三是提高強(qiáng)毒株建立感染的劑量[27]。若要從根本上控制和消滅ND，除選擇適合的疫苗并采取合理的免疫程序以盡可能提高雞群抗體水平外，更主要的是應(yīng)加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)的生物安全管理，減少或消滅雞群中的強(qiáng)毒株，同時(shí)阻止外界強(qiáng)毒株進(jìn)入雞群，最終達(dá)到控制ND的目的。