孫艷永，田趙勇，徐 瑞，陳 寧，文世富

（勃林格殷格翰動(dòng)物保?。ㄖ袊┯邢薰荆┲?225300）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是廣泛存在于反芻動(dòng)物中的一種病毒，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。BVDV屬黃病毒科瘟病毒屬成員，BVDV對任何年齡牛均易感，可導(dǎo)致呼吸道疾病、生殖系統(tǒng)疾病、腸道疾病和免疫功能障礙等疾病[2-3]。BVDV感染的主要經(jīng)濟(jì)影響是經(jīng)子宮或胎盤感染導(dǎo)致母畜流產(chǎn)、胎兒先天畸形或牛出生后持續(xù)感染（PI）[2-3]。胎牛可經(jīng)兩種方式獲得持續(xù)性感染。一是在妊娠早期（30～125 d）母牛感染BVDV非致細(xì)胞病變生物亞型（noncytopathic,NCP）后，BVDV通過胎盤傳播給胎牛，胎牛出生后100%為持續(xù)性感染[2-6]，這一時(shí)期也被認(rèn)為是造成PI牛的高峰期[7]。二是PI母牛懷孕后將BVDV傳染胎牛[8]。PI牛可終生帶毒，且連續(xù)不斷的將病毒排到周圍環(huán)境中，被認(rèn)為是BVDV傳播的主要源頭[9]。妊娠期125～150 d后的胎牛有一定程度的免疫能力，此時(shí)感染BVDV可導(dǎo)致先天性感染，造成流產(chǎn)、死胎、先天性缺陷或產(chǎn)出看起來正常的有BVDV抗體的犢牛[3,10]。為母牛注射BVDV疫苗被認(rèn)為是可以控制PI牛出現(xiàn)的最重要措施。目前，多種疫苗都有能力保護(hù)胎牛不受BVDV感染[11-13]。

本研究所用牛病毒性腹瀉病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹瀉病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗均是通過定點(diǎn)突變的方法缺失了整個(gè)Npro蛋白的編碼區(qū)（N端4個(gè)密碼子除外）和位于Erns的RNA酶活性中心編碼區(qū)中第349位組氨酸[14-15]。BVDV通過上述雙缺失大大降低了病毒的致病性，疫苗毒不能穿越胎盤屏障，對胎牛是安全的[14,16]。本研究根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法》評價(jià)牛病毒性腹瀉病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹瀉病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗對懷孕母牛的安全性，因妊娠前期母牛對BVDV最易感，因此本研究選擇孕期在60～90 d的母牛進(jìn)行試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 中國荷斯坦奶牛16頭，孕齡60～90 d，購自東營神州澳亞現(xiàn)代牧場有限公司新戶分公司。試驗(yàn)開展前在勃林格殷格翰動(dòng)物保?。ㄖ袊┯邢薰緦?shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會（IACUC）審核、批準(zhǔn)（AUP#：AUP-18-01）和監(jiān)督下完成。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn) 本次試驗(yàn)在山東省東營市河口區(qū)新戶鎮(zhèn)東興村東營神州澳亞現(xiàn)代牧場有限公司新戶分公司進(jìn)行。本試驗(yàn)根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法》等相關(guān)法規(guī)開展，中國人民共和國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全審批書編號為農(nóng)基安審字（2018）第062號和農(nóng)基安審字（2018）第063號。

1.3 疫苗和疫苗稀釋液 牛病毒性腹瀉病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗，批號：24100BPDI-1，病毒滴度≥104.0TCID50/mL，有效期至2020年10月19日，以下簡稱BVDV-1基因缺失疫苗；牛病毒性腹瀉病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗，批號：241-030117BPS-2C，病毒滴度≥104.0TCID50/頭份，每頭份2 mL，有效期至：2019年3月17日，以下簡稱BVDV-2基因缺失疫苗；疫苗由勃林格殷格翰動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)。疫苗稀釋液（磷酸鹽緩沖液，WPBS），批號：8090103A、8090049A，由勃林格殷格翰動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將16頭試驗(yàn)用牛隨機(jī)分成2組，每組8頭。第1組6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹瀉病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗；另外2頭牛不做任何接種作為哨兵牛同群飼養(yǎng)。第2組6母牛肌肉注射2.0 mL牛病毒性腹瀉病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗；另外2頭牛不做任何接種作為哨兵牛同群飼養(yǎng)。

疫苗免疫后連續(xù)觀察56 d，每天觀察動(dòng)物是否有流產(chǎn)情況，如果出現(xiàn)流產(chǎn)則將流產(chǎn)胎牛進(jìn)行剖檢，采集胎牛的腦、胸腺、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟及該流產(chǎn)母牛的血液用于病毒分離，若病毒分離結(jié)果為陽性則對該病毒進(jìn)行基因測序以確認(rèn)該病毒是否為疫苗毒。在免疫當(dāng)天（免疫前）和免疫后第56 d時(shí)，采集所有懷孕母牛的血清樣本用于抗體檢測，以檢測是否有BVDV血清轉(zhuǎn)陽。在免疫后第56 d將6頭免疫牛進(jìn)行安樂死并采集其胎牛的腦、胸腺、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟組織，通過病毒分離的方法進(jìn)行BVDV檢測，若病毒分離結(jié)果為陽性則對該病毒進(jìn)行基因測序以確認(rèn)該病毒是否為疫苗毒。

1.5 抗原檢測 用熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（以下簡稱：qRT-PCR）方法對免疫前試驗(yàn)用牛進(jìn)行牛病毒性腹瀉病毒抗原的檢測。

RNA提?。菏褂貌《竞怂崽崛≡噭┖校≦IAGEN，Cat：52904）提取血清中牛病毒性腹瀉病毒RNA，方法如下：每個(gè)1.5 mL無RNase無菌EP管中加入560 μL裂解液AVL（包含5.6 μL Carrier RNA）；加入140 μL待檢血清；渦旋振蕩混勻15 s；室溫放置10 min；每管加入560 μL無水乙醇后渦旋15 s；將630 μL上述混合物轉(zhuǎn)移至一個(gè)吸附柱，如果總體積超過630 μL，可分兩次將溶液加入同一個(gè)吸附柱中；6010 ×g離心1 min，倒掉收集管中的廢液；加入500 μL AW1漂洗液，6010 ×g離心1 min，棄廢液；加入500 mL AW2漂洗液，12 000 ×g離心3 min，棄廢液；將吸附柱放回空收集管中，13 523 ×g離心1 min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)；取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5 mL離心管中，在吸附膜的中間部位加50 μL洗脫緩沖液，室溫放置1 min，13 523×g離心1 min。洗脫的RNA用qRT-PCR檢測。

qRT-PCR：使用商品化的牛病毒性腹瀉病毒qRT-PCR檢測試劑盒（QIAGEN，Cat：280375）進(jìn)行檢測，方法如下：根據(jù)樣品數(shù)量計(jì)算PCR Mix（19.75 μL/個(gè)樣品）和Enzyme Mix（0.25 μL/個(gè)樣品）需要的總量，將PCR Mix和Enzyme Mix加入同一個(gè)無菌管中混勻；將上述混合液分裝至96孔熒光定量反應(yīng)板中，每個(gè)孔20 μL；加入5 μL待檢樣品RNA或陰性、陽性對照；使用封板膜封住反應(yīng)板；將反應(yīng)板放入熒光定量PCR儀；按照以下條件進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增：50℃ 20 min；95℃預(yù)變性15 min；95℃變性30 s，57℃退火45 s，68℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)成立的標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照的FAM和HEX檢測通道的Ct值小于36，陰性對照的FAM檢測通道無信號但在HEX檢測通道的Ct值小于36。結(jié)果判定：若待檢樣品在FAM和HEX檢測通道產(chǎn)生信號則判定為陽性；若待檢樣品在HEX檢測通道產(chǎn)生信號但在FAM檢測通道無信號則判定為陰性；若待檢樣品在FAM和HEX檢測通道均無信號則檢測為不確定結(jié)果。

1.6 抗體檢測 使用牛病毒性腹瀉病毒p80蛋白抗體檢測試劑盒（IDEXX，Cat：P00645-5）檢測血清中牛病毒性腹瀉病毒抗體，方法如下：包被板每孔加入50 μL樣品稀釋液N.9。隨后加入50 μL被檢樣品，并設(shè)立陰性和陽性對照，待檢樣品及陽性對照不作重復(fù)孔，陰性對照作重復(fù)孔。18℃～26℃孵育1 h后用300 μL洗滌液洗滌板子3～5次。每個(gè)孔加入100 μL酶標(biāo)抗體，室溫孵育30 min后用300 μL洗滌液洗滌板子3～5次；每個(gè)孔加入100 μL TMB底物，室溫避光孵育20 min。再向每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)。在450 nm波長測定各樣品的吸光值。結(jié)果判定：計(jì)算S/N%值，S/N%=100×樣品A450/陰性對照平均值。S/N%值大于或等于50%判定為陰性，小于或等于40%為陽性，大于40%但小于50%為可疑。

1.7 病毒分離 使用無菌剪刀剪取1～5 g的組織，剪碎后轉(zhuǎn)移至組織碾磨管中，按照1∶1體積/重量比加入培養(yǎng)基，使用組織碾磨儀進(jìn)行碾磨。將上述組織勻漿經(jīng)3次反復(fù)凍融后2000 ×g離心20 min取上清液，接種細(xì)胞前使用細(xì)胞培養(yǎng)基將上清液作1∶10稀釋并用0.22 μm濾器過濾。將犢牛鼻甲骨細(xì)胞（BT）培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至30%～40%后，將上述樣品接種于BT細(xì)胞，每個(gè)樣品作4個(gè)重復(fù)，每孔250 μL，37℃培養(yǎng)5 d。收獲培養(yǎng)板后反復(fù)凍融兩次，在BT細(xì)胞上再傳代1次，每孔接種250 μL第1代凍融的樣品，37℃培養(yǎng)5 d。收獲培養(yǎng)板后反復(fù)凍融兩次，將第2代凍融的樣品接種于牛腎細(xì)胞（MDBK），于37℃培養(yǎng)4 d后進(jìn)行間接免疫熒光染色。間接免疫熒光試驗(yàn)步驟如下：棄去上清培養(yǎng)液，使用50%甲醇/丙酮固定液進(jìn)行細(xì)胞固定；每孔加入85 μL牛病毒性腹瀉病毒特異性單克隆抗體，37℃孵育50 min；每孔加入200 μL洗滌液洗細(xì)胞3次；每孔加入75 μL的驢抗鼠IgG綠色熒光二抗（Life technologies，REF:A21202），37℃孵育50 min；每孔加入200 μL洗滌液洗細(xì)胞3次；在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)成立須滿足下列所有條件：免疫前所有動(dòng)物健康狀態(tài)良好；免疫前所有動(dòng)物的血清牛病毒性腹瀉病毒抗原和抗體檢測結(jié)果為陰性；試驗(yàn)期內(nèi)所有哨兵牛牛病毒性腹瀉病毒抗原/抗體檢測結(jié)果均為陰性；試驗(yàn)期內(nèi)，哨兵牛不出現(xiàn)與牛病毒性腹瀉病毒感染相關(guān)臨床癥狀，如發(fā)熱、流產(chǎn)等。

1.9 試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn) 用于試驗(yàn)結(jié)果判定的指標(biāo)包括有無疫苗株免疫而引起的流產(chǎn)以及胎牛組織中有無疫苗毒的存在。

2 結(jié)果

免疫前所有試驗(yàn)牛健康狀態(tài)均良好，牛病毒性腹瀉病毒抗原和抗體檢測結(jié)果為陰性。哨兵牛在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)牛病毒性腹瀉病毒抗原和抗體檢測結(jié)果均保持陰性，且健康狀態(tài)良好，試驗(yàn)成立。

2.1 免疫后流產(chǎn)觀察 所有免疫牛在整個(gè)試驗(yàn)期間食欲旺盛、軀體勻稱、體態(tài)豐滿、被毛光亮，未觀察到任何臨床癥狀和流產(chǎn)情況。結(jié)果表明，免疫BVDV-1基因缺失疫苗和BVDV-2基因缺失疫苗對懷孕母牛是安全的。

2.2 抗體反應(yīng) 所有懷孕母牛在免疫當(dāng)日為BVDV抗體陰性，免疫后血清抗體轉(zhuǎn)陽，抗體明顯升高，而同居飼養(yǎng)的哨兵牛BVDV血清抗體一直保持陰性，具體檢測結(jié)果見圖1。該結(jié)果表明，免疫BVDV-1基因缺失疫苗和BVDV-2基因缺失疫苗可以導(dǎo)致BVDV抗體轉(zhuǎn)陽，但疫苗毒不會通過免疫牛水平傳播給未免疫牛。

圖1 免疫后BVDV 抗體反應(yīng)Fig.1 BVDV seroconversion after vaccination

2.3 疫苗毒在胎牛體內(nèi)的分布情況 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)胎牛發(fā)育良好，對所有采集的胎牛組織進(jìn)行病毒分離均未檢測出BVDV，檢測結(jié)果見表1。該結(jié)果表明，試驗(yàn)用牛在免疫該弱毒疫苗后，疫苗毒不能穿過胎盤感染胎牛，無垂直傳播。

表1 胎牛組織樣本病毒分離結(jié)果Table 1 Virus isolation results of fetuses' tissue

3 討論

疫苗免疫接種可以激發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫力，可以使易感動(dòng)物轉(zhuǎn)化為非易感動(dòng)物，是預(yù)防和控制動(dòng)物傳染病的重要措施。在過去的一段時(shí)間里，減毒活疫苗和滅活疫苗（傳統(tǒng)疫苗）在動(dòng)物傳染病防控過程中起到了至關(guān)重要的作用，目前廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，其中具有代表性的疫苗如口蹄疫滅活疫苗和豬瘟C株弱毒疫苗等[17-21]。但是隨著養(yǎng)殖模式和生物安全方式的轉(zhuǎn)變，傳統(tǒng)疫苗也存在諸多不足，如滅活苗不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，需要加強(qiáng)免疫；高致病性病原滅活疫苗生產(chǎn)需要高等級生物安全實(shí)驗(yàn)室；致弱不完全的弱毒疫苗會毒力返強(qiáng)等。因此，近些年來，獸醫(yī)行業(yè)都在大力研發(fā)新型疫苗，包括基因工程亞單位疫苗、基因重組活載體疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗和核酸疫苗等[22]。相比傳統(tǒng)疫苗，新型疫苗可通過除去病原體的無效和致病成分，只保留能引起免疫保護(hù)作用的成分提供更安全的防護(hù)；可制成多價(jià)聯(lián)合疫苗，做到一針多防；可以區(qū)分免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物，服務(wù)于疫病凈化等[23]。

目前，瘟病毒主要新型疫苗有豬瘟病毒E2亞單位疫苗[24]、以BVDV毒株CP7為骨架病毒，將其E2基因替換為豬瘟病毒E2基因的重組嵌合瘟病毒活疫苗[25]和利用人5型復(fù)制缺陷性腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)豬瘟病毒E2基因的重組腺病毒rAdV-E2疫苗[26]等。上述疫苗廣泛應(yīng)用于臨床，在疾病預(yù)防控制工作中起到了非常重要的作用。本研究牛病毒性腹瀉病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹瀉病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗的設(shè)計(jì)理論是基于BVDV主要保護(hù)性抗原E2蛋白、和兩個(gè)抑制宿主先天免疫功能的病毒蛋白Npro和Erns的功能與特性研制的，通過定點(diǎn)突變的方法缺失了BVDV整個(gè)Npro蛋白的編碼區(qū)（N端4個(gè)密碼子除外）和位于Erns的RNA酶活性中心編碼區(qū)中第349位組氨酸，進(jìn)而獲得了安全性和免疫原性良好的BVDV疫苗。該疫苗在研發(fā)期間，已有超過3000頭牛進(jìn)行了疫苗接種，包括犢牛和懷孕母牛，安全性良好，無水平傳播、無垂直傳播，也無毒力返強(qiáng)。歐洲田間試驗(yàn)中，有近300萬頭牛接種了該疫苗，包括犢牛和懷孕母牛。2014年在歐盟國家注冊后，至今已在30個(gè)國家廣泛使用，且已有大約570萬頭牛接種了該疫苗，其安全性已經(jīng)得到充分證實(shí)（內(nèi)部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，未發(fā)表）。本研究結(jié)果再次證實(shí)，懷孕母牛免疫牛病毒性腹瀉病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹瀉病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗后，母牛無臨床癥狀及流產(chǎn)情況，且胎牛組織中不存在BVDV，即疫苗無垂直傳播，對母牛和胎牛均具有良好的安全性。