程文杰，李紅霞，晏云濤，項(xiàng) 勛，董 路，楊建發(fā)，鄒豐才

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201）

日本血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害我國居民健康安危，阻礙疫區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大傳染病。釘螺是其唯一的中間宿主，防控和阻斷血吸蟲病傳播重要的舉措之一是控制和消滅釘螺。采用氯硝柳胺等化學(xué)藥物來滅螺是目前國內(nèi)外使用較多的控制釘螺的方法[1]，但化學(xué)滅螺藥物因?qū)Νh(huán)境的污染和對非靶生物的毒性等缺陷而限制了其使用，人們越來越意識到植物天然產(chǎn)物作為殺螺劑擁有巨大前景[2-3]。目前，對具有殺螺活性研究較多的植物包括大戟科、槚如數(shù)科、菊科、含羞草科、商陸科、瑞香科和茄科等[4]。紫莖澤蘭提取物作為殺蟲劑對農(nóng)業(yè)害蟲以及寄生蟲等具有良好的效果[5-6]，已有報(bào)道表明紫莖澤蘭具有殺滅釘螺的作用且葉提取物對釘螺的作用效果高于根、莖部位[7]。目前多以紫莖澤蘭粗提混合物為研究對象并對其發(fā)揮的作用進(jìn)行初步探討，而單體化學(xué)成分方面的研究則相對較少[6-8]。利用紫莖澤蘭可殺滅或抑制病蟲害這一特性，將其代替其他化學(xué)藥品作用于釘螺，具有重要的生態(tài)學(xué)意義。代謝組學(xué)技術(shù)主要包括質(zhì)譜、高分辨核磁共振和色譜[9]，目前常采取多種方法和技術(shù)聯(lián)合使用。代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、營養(yǎng)代謝、藥物成分分析、食品安全等方面。王京等[10]基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜建立了快速測定畜禽產(chǎn)品中多種抗組胺類藥物及代謝物殘留的方法。何則皓等[11]利用液體核磁共振氫譜發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺病患者?；撬岷凸劝彼岬仍谘褐械臐舛葧@著性升高。色譜和質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)是最常用的代謝組學(xué)技術(shù)，色譜可以很好的分離分析復(fù)雜生物體系的代謝物，質(zhì)譜能同時(shí)檢測多種化合物。吳志蕾等[12]通過氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選出日本血吸蟲陽性和陰性釘螺18種差異代謝物，這也表明代謝組學(xué)技術(shù)可用于探索釘螺在不同生理狀態(tài)下的代謝變化。為探究紫莖澤蘭對釘螺活性的影響，本研究采用代謝組學(xué)篩選紫莖澤蘭作用釘螺的差異關(guān)鍵代謝譜，以期為新型植物滅螺劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本分組 試驗(yàn)釘螺從云南大理州自然環(huán)境中采集飼養(yǎng)，選活成螺進(jìn)行試驗(yàn)，將體重大小均一的成年釘螺隨機(jī)地分為3組：紫莖澤蘭處理釘螺組M1、氯硝柳胺處理釘螺陽性對照組P1、空白對照B1，每組300只，每組6個(gè)平行。

1.2 紫莖澤蘭活性物質(zhì) 紫莖澤蘭葉提取物：采用甲醇熱回流提取法，經(jīng)正丁醇萃取，用ddH2O配制成1000 mg/L的藥液。

1.3 儀器 超高效液相色譜儀（1290 UHPLC，Agilent，USA），色譜柱（ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1*100mm，Waters，USA）高分辨質(zhì)譜儀（Triple TOF 6600，AB Sciex，USA），研磨儀（JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司）。

1.4 樣品處理 將釘螺分別在濃度為1000 mg/L的紫莖澤蘭和陽性及陰性對照組中浸泡24 h后取出（M1組及P1組所有釘螺均已死亡），每組至少1200 mg，用PBS緩沖溶液清洗3次。采用玻片重壓法，將各組的螺肉組織（200 mg）鏡檢看是否被日本血吸蟲尾蚴感染，確定無感染后分別裝入5 mL凍存管內(nèi)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 釘螺代謝物提取 稱取釘螺樣本50 mg于2 mL離心管中，加入1000 μL提取液（甲醇、乙腈、水體積比為2∶2∶1，內(nèi)標(biāo)5 μg/mL），渦旋混勻30 s。在離心管中加入瓷珠，45 Hz研磨儀處理4 min，冰浴超聲5 min，重復(fù)3遍。超聲結(jié)束將樣本于-20℃靜置1 h；再將樣本于4℃、12 000 ×g離心15 min；隨后取出825 μL釘螺樣本上清液于2 mL離心管中；在真空濃縮器中充分干燥后，向提取物中加入提取液（乙腈∶水=1∶1）100 μL復(fù)溶，接著渦旋30 s，冰浴條件超聲10 min；將復(fù)溶后的提取物置于4℃、12 000 ×g離心15 min；取出60 μL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶，每個(gè)釘螺樣本各取10 μL混合成QC樣本。

1.6 分析條件

1.6.1 色譜條件 UPLC BEH Amide色譜柱（1.7 μm*2.1*100 mm），流速0.5 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。流動相A為水（25 mmol/L醋酸銨及25 mmol/L氨水），B為乙腈。梯度洗脫程序?yàn)椋?～0.5 min，95%B；0.5～7.0 min，95%～65%B；7.0～8.0 min，65%～40%B；8.0～9.0 min，40%B；9.0～9.1 min，40%～95%B；9.1～12.0 min，95%B。

1.6.2 質(zhì)譜條件 采集模式：電噴霧電離離子源正/負(fù)離子模式；離子源溫度650℃；噴霧電壓5000/4000 V；霧化氣壓0.41 psi；輔助氣壓0.41 psi；氣簾氣壓0.21 psi；轟擊能量30 eV。

1.7 數(shù)據(jù)處理 利用UPLC-Q-TOF/MS自動進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，獲取原始數(shù)據(jù)后，基于XCMS的R編程軟件，將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。再使用SIMCA-P11.5軟件，采取偏最小二乘判別法（PLSDA）模式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)變量投影重要性（VIP）＞1.0和t檢驗(yàn)P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異代謝物，再去除同位素離子、加合離子與碎片離子，最終作為生物標(biāo)志物，供后續(xù)代謝通路分析。

1.8 差異代謝物的鑒定 根據(jù)正負(fù)離子模式下PLSDA分析后獲得的載荷圖、VIP值與T-test，篩選出潛在的差異代謝物信息。采用MASSHunter軟件查詢代謝物的高分辨MS譜，結(jié)合代謝物數(shù)據(jù)庫檢索：HMDB（http://www.hmdb.ca）、PubChem、KEGG（http://www.genome.jp/k:egg），來初步確定潛在差異代謝物，查詢精確MASS值與m/z值時(shí)所采用的質(zhì)譜誤差均為10 mDa，最終根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)中的精確MS質(zhì)譜圖來初步確定潛在差異代謝物。

1.9 代謝通路分析 正離子、負(fù)離子模式下，把釘螺組織中初步鑒定差異代謝物輸入到MetPA數(shù)據(jù)庫（http://metpa.metabolomics.ca）進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)穩(wěn)定性 正、負(fù)離子模式下，QC樣品不間斷連續(xù)進(jìn)樣10次的總離子流圖（total ion current,TIC），由圖可知離子流圖的起峰相對較少，儀器處于穩(wěn)定性狀態(tài)。說明本實(shí)驗(yàn)中建立的基于UPLC-Q/TOF-MS檢測的代謝組學(xué)方法重現(xiàn)性良好（圖1）。

圖1 質(zhì)控樣本正離子（A）與負(fù)離子（B）模式TIC 圖Fig.1 Total ion current (TIC) chromatograms of quality control (QC) samples

2.2 不同處理組及空白對照組釘螺代謝輪廓分析 采用UPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行釘螺組織樣本的分離和數(shù)據(jù)采集，圖2為正離子（A）、負(fù)離子（B）模式下各組總離子流色譜圖。由圖可見，紫莖澤蘭處理組（M1）、陽性對照組（P1）和空白對照組（B1）在作用24 h后組織代謝物的出峰時(shí)間和峰面積均有所不同，具有明顯的差異性。

圖2 紫莖澤蘭處理組（M1）、陽性對照組（P1）和空白對照組（B1）在正離子模式（A）和負(fù)離子模式（B）下的總離子流色譜圖（TIC）Fig.2 Eupatorium adenophorum administration group (M1), positive control group (P1) and blank control group (B1) total Ion f low chromatography (TIC) in positive ion mode (A) and negative ion mode (B)

2.3 各組主成分分析（principal component analysis,PCA） 將所得釘螺組織樣本數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后，進(jìn)行PCA分析。由圖3可以看出，在正、負(fù)離子模式下，空白組和不同處理組的樣本點(diǎn)相互分離，各樣本點(diǎn)在一定范圍內(nèi)聚集良好，所有釘螺樣本全部位于95%置信區(qū)間內(nèi)，提示在被紫莖澤蘭處理狀態(tài)下，釘螺機(jī)體的正常生理代謝被干擾。

圖3 全部樣本正離子（A）與負(fù)離子（B）模式得分散點(diǎn)圖Fig.3 Scattering Points of in positive ion (A) and negative ion (B) model for all samples

通過OPLS-DA分析，將釘螺代謝物中無關(guān)的正交變量篩除后，更加個(gè)性化地對非正交變量和正交變量進(jìn)行逐一分析，從而獲得相互之間獨(dú)立可靠的釘螺代謝物的組間差異信息。

使用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行LOG轉(zhuǎn)換加UV格式化處理，首先對第一主成分進(jìn)行OPLS-DA建模分析，模型的質(zhì)量用7折交叉驗(yàn)證（7-fold cross validation）進(jìn)行檢驗(yàn)；然后用交叉驗(yàn)證后得到的R2Y（模型對分類變量Y的可解釋性）和Q2（模型的可預(yù)測性）對模型有效性進(jìn)行評判。

紫莖澤蘭處理組、陽性對照組和空白對照組樣本能夠較好分離在t值兩側(cè)，說明兩者內(nèi)源性物質(zhì)狀態(tài)存在明顯差異，且樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)。

紫莖澤蘭處理組（M1）與空白組（B1）比較結(jié)果顯示，經(jīng)7折交叉驗(yàn)證得到的模型評價(jià)參數(shù)（R2Y、Q2）分別為0.989、0.922（正離子模式）和0.987、0.918（負(fù)離子模式），所有R2Y和Q2均不小于0.5，表明模型穩(wěn)定可靠（圖4）。

圖4 M1 組vs B1 組正離子（A）與負(fù)離子（B）模式的PCA 圖Fig.4 The PCA of the positive ion (A) and negative ion (B)modes of M1 vs B1

陽性對照組（P1）與空白組（B1）比較結(jié)果顯示，經(jīng)7折交叉驗(yàn)證得到的模型評價(jià)參數(shù)（R2Y、Q2）分別為0.995、0.957（正離子模式）和0.996、0.936（負(fù)離子模式），所有R2Y和Q2均不小于0.5，表明模型穩(wěn)定可靠（圖5）。

圖5 P1 組vs B1 組正離子（A）與負(fù)離子（B）模式的PCA 圖Fig.5 The PCA of the positive ion (A) and negative ion (B)modes of P1 vs B1

紫莖澤蘭處理組（M1）與陽性對照組（P1）結(jié)果顯示，經(jīng)7折交叉驗(yàn)證得到的模型評價(jià)參數(shù)（R2Y、Q2）分別為0.995、0.852（正離子模式）和0.994、0.902（負(fù)離子模式），所有R2Y和Q2均不小于0.5，表明模型穩(wěn)定可靠（圖6）。

圖6 M1 組vs P1 組正離子（A）與負(fù)離子（B）模式的PCA 圖Fig.6 The PCA of the positive ion (A) and negative ion (B)modes of M1 vs P1

2.4 單變量統(tǒng)計(jì)分析和差異代謝物的篩選 為尋找紫莖澤蘭處理后引起釘螺體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)波動的主要內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)將單變量統(tǒng)計(jì)分析方法中的t檢驗(yàn)（P＜0.05）與變量投影重要度VIP＞1相結(jié)合，在正、負(fù)離子模式下，從釘螺組織中初步鑒定了79個(gè)潛在的差異代謝物，其中表達(dá)含量水平上調(diào)的有31個(gè)，表達(dá)含量下調(diào)的有48個(gè)。紫莖澤蘭處理組與空白組差異代謝物篩選結(jié)果見表1與表2。

表1 表達(dá)含量水平上調(diào)的差異代謝物Table 1 Diff erential metabolites with up-regulated expression levels

表2 表達(dá)含量水平下調(diào)的差異代謝物Table 2 Diff erential metabolites with down-regulated expression levels

2.5 差異代謝物的KEGG注釋和代謝通路分析 通過差異代謝物對KEGG等權(quán)威代謝物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行映射，在取得差異代謝物的匹配信息后，對釘螺的通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索和代謝通路分析。將釘螺組織中初步鑒定的79種差異代謝物輸入MetPA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路的構(gòu)建和分析。代謝通路影響值高于0.10的被認(rèn)為是潛在的靶標(biāo)路徑，由紫莖澤蘭所導(dǎo)致的釘螺代謝紊亂相關(guān)途徑共18條，包括參與能量代謝的6條途徑：甘油脂質(zhì)代謝、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、磷酸戊糖途徑、?；撬岷痛闻；撬岽x、甲烷代謝、苯丙氨酸代謝；參與蛋白質(zhì)合成分解的11條途徑：組氨酸代謝、維生素B6代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、谷胱甘肽代謝、嘧啶代謝、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨酰生物合成；參與免疫系統(tǒng)調(diào)控代謝差異物有1種：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝。

氣泡圖系統(tǒng)直觀地反映了釘螺組織經(jīng)紫莖澤蘭作用后發(fā)揮關(guān)鍵作用的代謝物。每一條代謝通路的影響程度高低均反映在氣泡大小和顏色深淺上，氣泡越大顏色加深，說明影響因子和富集效果越顯著。綜合分析后組氨酸代謝為最凸顯的代謝通路（圖7）。

圖7 代謝通路圖Fig.7 Metabolic pathway diagram

3 討論

采用基于UPLC-Q-TOF/MS的代謝組學(xué)方法對紫莖澤蘭干預(yù)釘螺的差異代謝物進(jìn)行研究，從釘螺組織中篩選出79種差異代謝物，鑒定后共得到18條代謝通路，其中大多數(shù)與蛋白質(zhì)合成分解有關(guān)，其次是能量代謝，發(fā)現(xiàn)主要是組氨酸代謝途徑發(fā)揮作用。

與空白組釘螺相比，紫莖澤蘭調(diào)控了18條代謝通路，氯硝柳胺調(diào)控了19條代謝通路，紫莖澤蘭與氯硝柳胺共同調(diào)控的有14條，進(jìn)一步分析這些已鑒定的差異代謝物的相關(guān)代謝通路，發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭所特有的調(diào)控路徑包括：維生素B6代謝、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成、色氨酸代謝和氨酰生物合成，參與了釘螺的蛋白質(zhì)的代謝、糖代謝。紫莖澤蘭處理了釘螺后影響了釘螺蛋白質(zhì)與能量的代謝，嚴(yán)重干擾了釘螺正常的生理功能。

組氨酸是維持水產(chǎn)動物機(jī)體生命活動的必需氨基酸，組氨酸過量或不足可顯著降低動物的食物攝入量[13]，組氨酸與三羧酸循環(huán)有關(guān)，而在組氨酸脫羧酶的作用下，組氨酸脫羧形成組胺[14]。組胺在舒張血管的同時(shí)，還參與多種炎癥反應(yīng)。紫莖澤蘭導(dǎo)致釘螺組氨酸含量的下調(diào)影響了有關(guān)的能量代謝途徑。釘螺軟組織內(nèi)中蛋白質(zhì)的含量高達(dá)60%，而在17種氨基酸中谷氨酸含量最高，約為16%[15]，而在肝臟中谷氨酸的含量也較高。組氨酸在組氨酸酶的作用下分解轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?，這是組氨酸主要代謝途徑之一，谷氨酸在谷氨酰胺合成酶的作用下合成谷氨酰胺，谷氨酰胺在體內(nèi)多種臟器中發(fā)揮著抗氧化解毒、通過調(diào)節(jié)凋亡酶抵抗細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)腸道免疫功能的作用，其變化直接影響著生物機(jī)體總氨基酸的代謝。谷氨酰胺是肝糖原發(fā)生異生作用的重要底物，也是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在體內(nèi)多種代謝途徑中發(fā)揮重要作用，并對維持生物機(jī)體的酸堿平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用[16-17]。

紫莖澤蘭影響了釘螺組氨酸代謝途徑，使得組氨酸含量下調(diào)，引起谷氨酸、谷氨酰胺等含量的下調(diào)，最終導(dǎo)致釘螺糖代謝無法順利進(jìn)行，造成螺體代謝紊亂，生理功能失調(diào)，起到殺滅釘螺的作用。李晨光等[18]認(rèn)為苦楝葉使釘螺軟體組織糖原含量降低可能是其滅螺的關(guān)鍵因素；謝秋萍等[19]發(fā)現(xiàn)毛地黃甙可顯著降低釘螺體內(nèi)糖原含量，本研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭影響了釘螺的糖代謝，這與之前的研究結(jié)果相同，表明植物滅螺藥可能會抑制釘螺的糖代謝進(jìn)而起到殺滅釘螺的作用。

在調(diào)節(jié)雌性動物生殖功能和分娩中，前列腺素與特異的受體結(jié)合后發(fā)揮突出作用[20]，雌二醇是卵巢成熟濾泡分泌的一種自然雌激素，能增進(jìn)和調(diào)節(jié)雌性動物生殖器官及副性征的正常發(fā)育[21]。在代謝產(chǎn)物中前列腺素A2和雌二醇的含量顯著低于空白對照組（P＜0.05），提示紫莖澤蘭干擾了釘螺的生殖功能，因此紫莖澤蘭除對釘螺的直接殺滅作用外，也可能導(dǎo)致釘螺產(chǎn)卵量和孵化率等下降，對釘螺的分布密度產(chǎn)生影響。

因地理環(huán)境復(fù)雜、洪澇災(zāi)害等因素，我國釘螺控制形勢仍然嚴(yán)峻[22]。對紫莖澤蘭這種外來入侵物種加以開發(fā)利用，作為殺蟲劑具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究通過對相關(guān)代謝物及代謝通路進(jìn)行分析，為紫莖澤蘭成為新型滅螺劑的開發(fā)提供參考。