王同燕，仝曉丹，蘇曉蕊，宋歡歡，李偉國(guó)，劉武杰，譚菲菲，田克恭,3

（1.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng) 471003；2.普萊柯生物工程股份有限公司，洛陽(yáng) 471000；3.洛陽(yáng)普泰生物技術(shù)有限公司，洛陽(yáng) 471003）

豬瘟（Classical swine fever, CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever Virus, CSFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，給中國(guó)和其他國(guó)家養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重危害，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病之一[1]。雖然中國(guó)利用自行研制的豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行強(qiáng)制免疫接種，有效控制了豬瘟的大規(guī)模流行。但是活疫苗免疫抗體與野毒感染抗體無(wú)法利用血清學(xué)方法進(jìn)行鑒別，成為我國(guó)凈化CSF面臨的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題[2-3]。因此有必要研制安全、可靠、可區(qū)分野毒感染的新型標(biāo)記豬瘟疫苗。豬瘟E2蛋白位于病毒囊膜表面，參與病毒的感染過(guò)程，是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白之一，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[4]。

桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system, BEVS）是利用攜帶有外源目的基因的重組桿狀病毒作載體在昆蟲(chóng)體內(nèi)或細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)能對(duì)外源蛋白進(jìn)行磷酸化和糖基化等翻譯后修飾，使蛋白接近天然構(gòu)象，保持良好的生物活性和免疫原性，并且利于大量生產(chǎn)，因此桿狀病毒系統(tǒng)被廣泛用于亞單位疫苗的研發(fā)。但桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也存在兩個(gè)主要的缺陷：第一外源蛋白表達(dá)量較低，主要原因在于桿狀病毒本身攜帶多個(gè)蛋白酶基因，如幾丁質(zhì)酶（Chitinase,ChiA）和組織蛋白酶（viral cathepsin-like protein,V-cath），表達(dá)外源基因的同時(shí)這些蛋白酶也隨之表達(dá)，特別是在病毒感染細(xì)胞晚期，重組蛋白易受這些蛋白酶降解，使獲得的目的蛋白的量減少。另一個(gè)原因是p10和pH均屬于晚期強(qiáng)啟動(dòng)子，可以啟動(dòng)蛋白高效表達(dá)，但是目前常用的Bac-to-Bac系統(tǒng)中兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子在表達(dá)外源基因時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，最終影響外源蛋白的表達(dá)量。第二是桿狀病毒傳代效應(yīng)，即隨著桿狀病毒傳代，出現(xiàn)缺陷干擾顆粒（Defective Interfering particle, DIs），致使外源蛋白表達(dá)量下降。其中FP25K和DA26基因中有宿主轉(zhuǎn)座整合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座插入導(dǎo)致DIs產(chǎn)生，影響桿狀病毒基因組穩(wěn)定性和外源蛋白表達(dá)量[5-8]。

為了提高桿狀病毒表達(dá)量和解決桿狀病毒毒種代次窄的問(wèn)題，本研究首次同時(shí)敲除ChiA、V-cath、P10、FP25K和DA26等5個(gè)影響蛋白表達(dá)和基因組穩(wěn)定性的基因，從而獲得表達(dá)量提高和基因穩(wěn)定的桿狀病毒載體，豬瘟E2蛋白的表達(dá)水平提高約4倍，同時(shí)使重組桿狀病毒的種毒代次從7代延長(zhǎng)至20代左右，解決了桿狀病毒表達(dá)量和種子批代次范圍窄的問(wèn)題，為開(kāi)發(fā)豬瘟病毒亞單位疫苗提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 主要試驗(yàn)材料 pFastBac-Hr1-WPRE載體、pKD46質(zhì)粒、pCas質(zhì)粒、pTarget Dual質(zhì)粒、pPICZaA質(zhì)粒、pBeloBAC11質(zhì)粒、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞均由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心構(gòu)建和保存；Sf9細(xì)胞、ExpiSf9細(xì)胞、High Five（Hi5）細(xì)胞均有國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心傳代、保存；opti-MEM、ExpiSf CD Medium、Express Five SFM、Sf-900 II SFM培養(yǎng)基和ExpiFectamine Sf轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自Thermo公司；豬瘟陽(yáng)性血清由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存；兔抗豬IgG-HRP購(gòu)自Sigma公司；His抗體購(gòu)自MBL公司；His TrapTMHP預(yù)裝柱購(gòu)自GE公司；Viral Nucleic Acid Extraction Kit購(gòu)自Geneaid公司；BacPAKTMBaculovirus Rapid Titer Kit購(gòu)自Clontech公司。

1.2 引物及sgRNA 根據(jù)P10、ChiA和V-cath基因在病毒基因組的位置及基因序列，設(shè)計(jì)重組缺失引物，其中ChiA和V-cath（CC）基因位置相鄰?fù)瑫r(shí)缺失（表1）。同時(shí)根據(jù)Case9技術(shù)原理，設(shè)計(jì)DA26和FP25K缺失所需的sgRNA序列（表2）。

表1 P10 和CC 基因缺失引物Table 1 Deletion of primer for P10 and CC genes

表2 DA26、FP25K 基因缺失sgRNA 序列Table 2 Sequences of sgRNA for DA26 and FP25K genes deletion

1.3ChiA、V-cath、P10、FP25K和DA26五基因缺失菌株的構(gòu)建 首先利用Red重組技術(shù)[9]缺失ChiA、V-cath和P10基因。因ChiA基因和V-cath基因位置相鄰，故設(shè)計(jì)1對(duì)重組引物進(jìn)行兩個(gè)基因的同時(shí)刪除，根據(jù)ChiA左側(cè)序列和V-cath基因右側(cè)序列設(shè)計(jì)引物來(lái)擴(kuò)增含有同源臂的博萊霉素基因。將其電轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒基因組Bacmid和pKD46的DH10B感受態(tài)中，借助博萊霉素抗性進(jìn)行壓力篩選獲得缺失ChiA和V-cath（CC）基因的陽(yáng)性克隆。在缺失ChiA和V-cath基因的基礎(chǔ)上，按照同樣的方法利用氯霉素基因替換P10基因，獲得ChiA、V-cath基因和P10基因缺失的陽(yáng)性質(zhì)粒。

在缺失ChiA、V-cath和P10的基礎(chǔ)上，利用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/，設(shè)計(jì)FP25K基因和DA26基因的SgRNA序列，分別選取兩個(gè)基因評(píng)分比較高的1對(duì)sgRNA，委托生工生物工程（上海）股份有限公司優(yōu)化合成，構(gòu)建針對(duì)同一基因不同位點(diǎn)的雙sgRNA質(zhì)粒，將此sgRNA質(zhì)粒和含有Cas9的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至已缺失ChiA、V-cath基因和P10基因的DH10Bac感受態(tài)中，通過(guò)PCR篩選目的基因缺失的陽(yáng)性質(zhì)粒。

1.4 E2基因供體質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 在線預(yù)測(cè)CSFV E2蛋白的糖基化位點(diǎn)，同源建模分析CSFV E2蛋白的二聚體結(jié)構(gòu)，將可能影響E2蛋白同源二聚體形成的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變，即將E2基因的297位天冬酰胺（N）突變?yōu)楣劝滨０罚≦），并在N端添加GP67信號(hào)肽。將此E2基因序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司優(yōu)化合成。將優(yōu)化合成的E2基因通過(guò)BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)插入到pFastBac-Hr1-WPRE改造載體中[10]，酶切鑒定正確的供體質(zhì)粒送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 重組Bacmid的構(gòu)建及鑒定 將含有突變E2基因的供體質(zhì)粒和含有轉(zhuǎn)座酶的Helper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至含有五基因缺失桿狀病毒基因組的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，利用Bac-to-Bac系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座原件，實(shí)現(xiàn)E2基因轉(zhuǎn)座至桿狀病毒基因組中，通過(guò)兩輪藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落于含有卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的三抗液體LB中，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按照堿裂解和異丙醇沉淀核酸的方法抽提核酸，利用E2特異性引物E2-F：ATGCTACTAGTAAATCAG和E2-R：TCAGTGATGGTGATGGTGAT鑒定重組Bacmid。同時(shí)設(shè)置含有突變E2基因的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)作為對(duì)照。

1.6 重組桿狀病毒拯救 將鑒定正確的重組Bacmid按照傳統(tǒng)貼壁的方法[11]轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí)收獲上清液作為P1代重組桿狀病毒。同時(shí)將鑒定正確的重組Bacmid懸浮轉(zhuǎn)染ExpiSf9細(xì)胞。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ExpiSf9細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×106cells/mL，取120 μL ExpiFectamineTMSf Transfection Reagent加入1 mL opti-MEM中，顛倒混勻10次，室溫靜置5 min，加入50 μg重組Bacmid核酸，輕柔混勻10次，室溫孵育15 min后，將混合液加入到100 mL細(xì)胞密度為2.5×106cells/mL ExpiSf9細(xì)胞中，在27℃培養(yǎng)箱中120 r/min震蕩培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)70%～80%時(shí)收獲培養(yǎng)上清液，標(biāo)記為P1代重組桿狀病毒。參照Clontech公司的BacPAK?Baculovirus Rapid Titer Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組桿狀病毒滴度測(cè)定，比較兩種轉(zhuǎn)染方式獲得的P1代重組病毒的滴度。

1.7 重組桿狀病毒鑒定

1.7.1 目的基因鑒定 參照Genaid公司的Viral Nucleic Acid Extraction Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行P1代重組桿狀病毒基因組抽提，以抽提的核酸為PCR模板，利用E2特異性引物E2-F和E2-R進(jìn)行重組桿狀病毒的基因鑒定。

1.7.2E2基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá) 將收獲的P1代重組桿狀病毒按照MOI=1接種Hi5細(xì)胞，48～72 h收獲細(xì)胞離心取上清液進(jìn)行Western blot鑒定和E2蛋白的親和層析純化，Western blot分別利用HRP標(biāo)記-His單克隆抗體（1∶8000）和豬瘟陽(yáng)性血清（1∶500）進(jìn)行鑒定。E2蛋白親和純化條件為：20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑，pH7.5，洗滌雜蛋白，20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，300 mmol/L 咪唑，pH7.5，洗脫目的蛋白。收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，分別在還原和非還原條件下分析E2蛋白二聚體形成的情況，并參照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)洗脫的E2蛋白進(jìn)行定量。

1.7.3 重組桿狀病毒基因組穩(wěn)定性 將重組桿狀病毒按照MOI=0.01接種Sf9細(xì)胞，接種后72～96 h收獲病毒進(jìn)行繼續(xù)傳代；取P3、P5、P7、P10、P15、P20和P25代重組桿狀病毒按照MOI=1接種Hi5細(xì)胞，接種48～72 h收獲細(xì)胞上清液，Western blot鑒定E2蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 ChiA、V-cath、P10、FP25K和DA26五基因缺失菌株的構(gòu)建 五基因缺失質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖1，首先利用Red重組技術(shù)分別將Zeocin和CmR替換ChiA/V-cath基因和P10基因，分別在ChiA/V-cath基因外側(cè)和P10基因外側(cè)設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，通過(guò)PCR檢測(cè)重組陽(yáng)性質(zhì)粒；通過(guò)Cas9技術(shù)，雙切FP25K基因和DA26基因，在切口的外側(cè)設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，通過(guò)PCR檢測(cè)敲除FP25K和DA26的陽(yáng)性質(zhì)粒。將PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣品送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明五個(gè)基因均已成功缺失，獲得的五基因缺失陽(yáng)性菌株命名為rBacmid-5D。

圖1 ChiA、V-cath、P10、FP25K 和DA26 五基因缺失示意圖Fig.1 Schematic diagram of f ive deletions of ChiA、V-cath、P10、FP25K and DA26

2.2 表達(dá)E2蛋白的供體質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 利用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定構(gòu)建的供體質(zhì)粒，結(jié)果可見(jiàn)約1100 bp的目的條帶，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果和優(yōu)化合成的序列一致，酶切和測(cè)序均正確的質(zhì)粒命名為pFastBac-Hr1-WPRE-E2。

圖2 pFastBac-Hr1-WPRE-E2 酶切鑒定Fig.2 pFastBac-Hr1-WPRE-E2 digestion and identif ication

2.3 重組Bacmid的構(gòu)建及鑒定 將供體質(zhì)粒pFastBac-Hr1-WPRE-E2分別轉(zhuǎn)化DH10Bac和rBacmid-5D感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)獲得的重組Bacmid進(jìn)行PCR鑒定，可見(jiàn)1100 bp的目的條帶，陰性對(duì)照未見(jiàn)目的條帶（圖3）。鑒定正確的Bacmid分別命名為rBacmid-E2和rBacmid-5D-E2。

圖3 重組Bacmid 的PCR 鑒定Fig.3 PCR identif ication of recombinant Bacmid

2.4 重組桿狀病毒拯救及鑒定 將鑒定正確的rBacmid-E2和rBacmid-5D-E2分別貼壁轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞和懸浮轉(zhuǎn)染ExpiSf9細(xì)胞，收獲上清液即為P1代重組桿狀病毒，分別名字為rAc-E2和rAc-5D-E2。貼壁和懸浮轉(zhuǎn)染收獲的P1代rAc-E2的病毒滴度分別為1.08×107IFU/mL和7.35×108IFU/mL。貼壁和懸浮轉(zhuǎn)染收獲的P1代rAc-5D-E2的病毒滴度分別為1.12×107IFU/mL和8.01×108IFU/mL。

2.4.1 目的基因鑒定 抽提懸浮轉(zhuǎn)染獲得的重組桿狀病毒核酸進(jìn)行PCR鑒定，拯救的兩種重組桿狀病毒均能擴(kuò)增出約1100 bp特異條帶（圖4），測(cè)序結(jié)果表明插入的E2基因序列完全正確。

圖4 E2 基因鑒定Fig.4 E2 gene identif ication

2.4.2 E2基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá) 將懸浮轉(zhuǎn)染獲得的兩種重組桿狀病毒rAC-E2和rAC-5D-E2按照MOI=1接種Hi5細(xì)胞，接種48 h上清液中可檢測(cè)到和His抗體以及豬瘟陽(yáng)性血清均發(fā)生反應(yīng)的特異性條帶，條帶大小約50 kDa（圖5）。對(duì)收獲上清液進(jìn)行親和層析純化，純化獲得的E2蛋白純度均在95%以上，而且在非還原條件下分析E2蛋白95%以上為二聚體形式（圖6）。采用BCA的方法對(duì)rAC-E2和rAC-5D-E2表達(dá)E2蛋白進(jìn)行定量，分別為35 mg/L和138 mg/L。

圖5 Western blot 鑒定Fig. 5 Western blot identif ication

圖6 SDS-PAGE 鑒定Fig.6 SDS-PAGE identif ication

2.4.3 重組桿狀病毒基因組穩(wěn)定性 將重組桿狀病毒rAC-5D-E2和rAC-E2分別按照MOI=0.01接種Sf9細(xì)胞，接種后72～96 h收獲病毒，并繼續(xù)進(jìn)行傳代。取P3、P5、P7、P10、P15、P20和P25代重組桿狀病毒按照MOI=1接種Hi5細(xì)胞，接種48 h收獲細(xì)胞上清液，進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果rAC-5D-E2 P20代內(nèi)E2的蛋白量基本保持不變；而rAC-E2從P7代開(kāi)始表達(dá)量明顯降低（圖7）。

圖7 不同代次重組桿狀病毒表達(dá)E2 蛋白的Western blot 鑒定Fig.7 Western blot identif ication of E2 protein expressed by diff erent passages of recombinant baculovirus

3 討論

鑒于豬瘟對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的嚴(yán)重危害，開(kāi)發(fā)安全、可靠，同時(shí)又可鑒別野毒感染的亞單位疫苗尤為重要。研究報(bào)道E2亞單位疫苗具有安全性高、可進(jìn)行鑒別診斷等優(yōu)點(diǎn)，是新型疫苗的重點(diǎn)研究方向[12-14]，豬瘟E2蛋白位于病毒囊膜表面，參與病毒的感染過(guò)程，E2蛋白可以和E1蛋白形成異源二聚體，也可以自身形成同源二聚體，同源二聚體能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白。豬瘟病毒C株E2蛋白胞外區(qū)含有15個(gè)半胱氨酸，其中前14個(gè)形成分子內(nèi)二硫鍵，294位半胱氨酸參與分子間二硫鍵的形成；E2蛋白胞外域中存在7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，其中297位糖基化位點(diǎn)可能影響分子間二硫鍵的形成[15]，在優(yōu)化序列合成時(shí)對(duì)297位天冬酰胺（N）突變?yōu)楣劝滨０罚≦），表達(dá)的E2蛋白95%以二聚體形式存在。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有容量大、蛋白翻譯后修飾等諸多優(yōu)勢(shì)，已被成功應(yīng)用于亞單位開(kāi)發(fā)和蛋白結(jié)構(gòu)功能研究。但面對(duì)產(chǎn)業(yè)化，仍存在生產(chǎn)成本較為昂貴的缺點(diǎn)[16]；其次是桿狀病毒感染后蛋白表達(dá)處于晚期，此時(shí)細(xì)胞面臨崩解的狀態(tài)，致使靶蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和翻譯后修飾均未達(dá)到最佳狀態(tài)[17]；同時(shí)存在隨著重組桿狀病毒傳代，基因組不穩(wěn)定存在插入和丟失現(xiàn)象，外源基因也會(huì)發(fā)生丟失。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)存在的問(wèn)題，在一定程度限制了BEVS在產(chǎn)業(yè)化方面的應(yīng)用。為了克服BEVS存在的不足，Lee等[18]通過(guò)缺失幾丁質(zhì)酶和組織蛋白酶，使纖維素酶的表達(dá)量提高17%。Kim等[19]通過(guò)RNAi技術(shù)抑制組織蛋白酶的表達(dá)，提高GFP蛋白的表達(dá)量3倍以上。李國(guó)輝等[20]通過(guò)缺失幾丁質(zhì)酶和半胱氨酸蛋白酶基因，延長(zhǎng)病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞存活時(shí)間，抑制靶蛋白的降解，提高NS1的表達(dá)量達(dá)3倍。本研究通過(guò)Red重組技術(shù)和Cas9技術(shù)，針對(duì)影響桿狀病毒表達(dá)水平和基因穩(wěn)定的ChiA、V-cath、P10、FP25K和DA26基因同時(shí)缺失，利用五基因缺失后的桿狀病毒載體構(gòu)建的表達(dá)豬瘟E2蛋白重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平均有明顯提高。本文同時(shí)比較了用于拯救重組桿狀病毒的兩種不同的轉(zhuǎn)染方法，表明懸浮轉(zhuǎn)染不僅獲得足量的低代次病毒，而且病毒滴度是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法獲得病毒滴度的70倍左右。因?yàn)镻1代拯救重組桿狀病毒滴度較高，無(wú)需通過(guò)擴(kuò)繁病毒即可進(jìn)行蛋白表達(dá)，縮短了從構(gòu)建到獲得蛋白的時(shí)間。

綜上，本研究通過(guò)對(duì)重組桿狀病毒基因組進(jìn)行了獨(dú)創(chuàng)的五基因缺失，使桿狀病毒基因組更穩(wěn)定，同時(shí)采用懸浮轉(zhuǎn)染獲得了足量低代次高滴度的重組桿狀病毒，從而使得表達(dá)E2代的重組桿狀病毒毒種從P7代延長(zhǎng)至P20代，解決了產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中重組桿狀病毒種子批代次窄的問(wèn)題。本文通過(guò)對(duì)目的基因序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)、載體桿狀病毒基因組的改造以及懸浮轉(zhuǎn)染技術(shù)，有效地提高了目的蛋白的表達(dá)量，并提高了重組桿狀病毒的傳代穩(wěn)定性，為其他桿狀病毒源亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)提供了一條可行的技術(shù)路徑。