李 梅，楊 源，王 軍，陳 靜，楊 鵬，成虹松，岳 筠，張雙翔,程振濤

（1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽 550025；3.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴陽 550008）

Toll樣受體（toll-like receptors, TLRs）是一大類模式識別受體，可特異性地識別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs），在病原體識別和促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子的快速表達(dá)中起著關(guān)鍵作用[1-2]。TLRs家族是一個高度重合的同源家族，其構(gòu)成包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三個部分，胞外區(qū)主要功能為識別相應(yīng)的配體并傳遞信息，胞內(nèi)區(qū)的關(guān)鍵點在于髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88），MyD88是細(xì)胞內(nèi)傳遞信號的關(guān)鍵銜接蛋白，可介導(dǎo)多種Toll樣受體（Toll-like receptors TLR）、白細(xì)胞介素1受體（interleukin-1 receptor, IL-1R）及白細(xì)胞介素-18受體（IL-18R）的信號傳遞，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮顯著作用[3]。在MyD88信號通路中，MyD88、腫瘤壞死因子相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6, TRAF6）、NF-κB、AP-1（JUN、FOS）等分子在信號傳導(dǎo)過程中起到了關(guān)鍵作用，是重要的炎癥通路接頭分子[4]。

近年來，多數(shù)研究表明MyD88信號通路在炎癥反應(yīng)及多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮重要作用，是一個潛在的臨床疾病的治療靶點。Jagadeesh等[5]研究發(fā)現(xiàn)頭孢曲霉菌凝集素可通過MyD88/NF-κB信號通路途徑誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而引起霉菌性角膜炎。徐化雪等[6]研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可能通過阻礙TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善原位肝癌切除術(shù)大鼠術(shù)后炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫功能抑制。王成等[7]研究發(fā)現(xiàn)通過沉默MyD88通路，抑制NF-κB p65的活化可減輕TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。本研究以貴州省內(nèi)5個主要品種羊為研究對象，應(yīng)用Mo進(jìn)行人工感染，對不同品種羊感染后血液、肺臟中TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平差異進(jìn)行分析，為探討TLRs MyD88信號通路參與Mo誘導(dǎo)不同品種羊炎癥反應(yīng)相關(guān)機(jī)理研究提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 菌株與試驗動物 綿羊肺炎支原體貴州分離株由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室分離保存。選擇未接種過任何疫苗3月齡Mo陰性健康貴州白山羊、貴州黑山羊、黔北麻羊、波爾山羊和湖羊各5頭，設(shè)置兩個組別（感染組：3只/組；對照組：2只/組）。感染組每只羊氣管注射4 mL（1×108CCU/mL）Mo菌液進(jìn)行感染，對照組注射同等劑量的Mo培養(yǎng)基。兩組羊在統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的飼養(yǎng)條件進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑 組織基因組DNA提取試劑盒、RNAprep Prue血液總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；RNAiso Plus組織總RNA提取試劑盒、Premix ExTaq? (Probe qPCR)、PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 樣本采集 采集各試驗組存活羊感染Mo后0、48、96 h抗凝血液樣本，實驗羊感染死亡或人工處死，采集肺臟樣本。

1.4 試驗羊Mo感染檢測 參考GenBank中公布的Mo Hsp70基因（GenBank登錄號：KC693974），設(shè)計1對特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。無菌取感染死亡或人工處死的試驗羊肺臟樣本，接種于改良Hayflick’s培養(yǎng)基中，以分離菌液體培養(yǎng)物DNA為模板，按試劑盒提取樣本DNA；構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52.5℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并分析試驗羊Mo感染情況。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.5 不同品種山羊TLRs基因轉(zhuǎn)錄水平檢測

1.5.1 引物設(shè)計與合成 針對GenBank中已公布羊的Toll樣受體MyD88信號通路中重要的接頭分子MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS和JUN基因序列信息，設(shè)計特異性引物和探針（5'端加入6-FAM發(fā)光基團(tuán)，3'端加入BHQ1淬滅基團(tuán)），送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列信息見表2。

表2 qPCR 引物序列信息Table 2 qPCR primer sequences

1.5.2 Mo感染羊TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平定量檢測 使用RNA提取試劑盒對提取試驗羊采集樣本總RNA，并將提取的RNA樣本（1 μg）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以試驗羊cDNA為模板構(gòu)建20 μL qPCR反應(yīng)體系：Probe Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，Probe 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.6 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，58退火20 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參基因，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對目的基因mRNA的相對表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)以3次獨立重復(fù)試驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；應(yīng)用SPSS26.0軟件分析同一品種山羊肺臟和血液樣本中MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS和JUN基因mRNA表達(dá)量的組間差異和不同品種山羊感染后肺臟、血液樣本中MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS、JUN基因的mRNA表達(dá)量的差異。P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義；P＜0.01表示差異極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mo感染羊樣本采集結(jié)果 貴州白山羊在感染Mo后96 h時已全部死亡，貴州黑山羊在感染Mo后144 h時已全部死亡，黔北麻羊在感染Mo后144 h時死亡2只，在感染后528 h統(tǒng)一處死剩余試驗羊（1只感染組黔北麻羊、2只對照組黔北麻羊，3只感染組波爾山羊、2只對照組波爾山羊、3只感染組湖羊、2只對照組湖羊）。采集0、48、96 h各試驗羊抗凝血液樣本5 mL，采集死亡或處死羊的肺臟樣本25份。

2.2 試驗羊大體病變觀察 對Mo感染羊只進(jìn)行解剖及大體病變觀察，不同品種實驗羊感染組大體病變結(jié)果統(tǒng)計見表3，5個不同品種羊均出現(xiàn)不同程度病理變化，提示Mo可感染以下5個不同品種羊。

表3 不同品種實驗羊感染組大體病變Table 3 Gross pathological changes in infected sheep of diff erent breeds

2.3 試驗羊Mo感染檢測 以5個品種試驗羊肺臟樣本的分離菌液體培養(yǎng)物DNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測試驗羊Mo感染情況。結(jié)果顯示，各品種羊感染組肺臟樣本的分離菌液體培養(yǎng)物均檢測出一條與預(yù)期544 bp大小相符的特異性條帶（圖1）；提示Mo成功感染試驗羊。

圖1 試驗羊肺臟樣本分離菌液體培養(yǎng)物PCR 檢測結(jié)果Fig.1 The results of the PCR test on the lung samples of the experimental sheep

2.4 同種羊不同TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平差異性分析結(jié)果 應(yīng)用楊源[8]建立的TaqMan RTqPCR方法檢測5個品種試驗羊肺臟和血液中感染組和對照組TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，貴州黑山羊肺臟中感染組的TRAF6、NF-κB、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組，MyD88、FOS基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組（圖2A）；血液中MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS和JUN基因轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于對照組（圖2B）。貴州白山羊肺臟中感染組的MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS和JUN基因轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于對照組（圖2C）；血液中TRAF6、NF-κB、FOS和JUN基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組，MyD88基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組（圖2D）。黔北麻羊肺臟中感染組的MyD88、TRAF6、NF-κB和JUN基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組，F(xiàn)OS基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組（圖2E）；血液中NF-κB和JUN基因轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于對照組，MyD88、TRAF6、FOS基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但不存在顯著差異（圖2F）。波爾山羊肺臟中感染組的MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS和JUN基因轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于對照組（圖2G）；血液中FOS、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于對照組，NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組，MyD88、TRAF6基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但不存在顯著差異（圖2H）。湖羊肺臟中感染組的MyD88、TRAF6、NF-κB、FOS和JUN基因轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于對照組（圖2I）；血液中FOS、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平均極顯著高于對照組，MyD88、TRAF6、NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平高于對照組但不存在顯著差異（圖2J）。通過分析發(fā)現(xiàn)，同一品種羊在感染Mo后肺臟樣本和血液樣本中TLRs MyD88通路因子基因mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的上升，提示TLRs MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與Mo感染不同品種羊的過程。

圖2 不同品種羊肺臟和血液樣本中TLRs MyD88 通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.2 Analysis of transcript levels of TLRs MyD88 pathway factor genes in lung and blood samples from diff erent breeds of sheep

2.5 不同種羊肺臟樣本中TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平差異性分析結(jié)果 應(yīng)用TaqMan RT-qPCR方法對5個品種試驗羊肺臟樣本進(jìn)行TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平檢測后，計算每個羊品種不同TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)，并對種間表達(dá)差異進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果顯示，Mo感染后貴州白山羊肺臟MyD88基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)倍數(shù)極顯著高于黔北麻羊、波爾山羊和湖羊；感染后5種羊肺臟TRAF6基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)存在明顯差異，呈現(xiàn)為貴州白山羊＞貴州黑山羊＞波爾山羊＞湖羊＞黔北麻羊；感染后貴州黑山羊肺臟NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)顯著高于其他4種羊，其余各組間并無顯著性差異；貴州黑山羊肺臟FOS基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)極顯著高于其余品種羊，其余4種羊間以貴州白山羊差異倍數(shù)最高；感染后貴州白山羊肺臟JUN基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于其余4種羊，其余4種羊間以波爾山羊差異倍數(shù)最低（圖3）。本研究發(fā)現(xiàn)試驗羊感染Mo后5個不同品種羊間肺臟樣本中TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)存在差異，肺臟樣本中MyD88、TRAF6、FOS基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)與試驗羊臨床死亡率呈正相關(guān)，提示TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平差異與不同品種羊Mo感染肺組織早期炎癥水平存在相關(guān)關(guān)系。

圖3 不同品種羊肺臟樣本中TLRs MyD88 通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平種間差異分析Fig.3 Interspecies variation in transcript levels of TLRs MyD88 pathway factors in lung samples from diff erent breeds of sheep

2.6 不同種羊血液樣本中TLRs MyD88通路因子轉(zhuǎn)錄水平差異性分析結(jié)果 應(yīng)用TaqMan RT-qPCR方法對試驗羊感染Mo后0、48、96 h血液樣本進(jìn)行TLRs MyD88通路因子轉(zhuǎn)錄水平定量檢測后，計算每個品種羊不同TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)，并對種間表達(dá)差異進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果顯示，感染后各品種山羊0 h血液中TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)均不存在顯著差異；感染后48 h貴州黑山羊和貴州白山羊血液中MyD88基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于其余3個品種羊，感染后96 h貴州白山羊血液MyD88基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于其余4個品種羊（圖4A）；感染后48 h貴州黑山羊血液TRAF6基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)顯著高于其余4種羊（圖4B）；感染后48 h、96 h波爾山羊血液NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊、黔北麻羊、貴州白山羊和湖羊（圖4C）；感染后48 h、96 h貴州白山羊血液FOS基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高 于貴州黑山羊、貴州白山羊、黔北麻羊和波爾山羊（圖4D）；感染后48 h貴州白山羊血液JUN基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于貴州黑山羊、黔北麻羊、波爾山羊和湖羊，黔北麻羊血液JUN基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著低于其余4個品種，貴州黑山羊、波爾山羊和湖羊無顯著差異，感染后96 h貴州白山羊血液JUN基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著高于其余品種，黔北麻羊和湖羊血液JUN基因轉(zhuǎn)錄水平差異倍數(shù)極顯著低于其余3個品種（圖4E）。分析發(fā)現(xiàn)不同品種羊之間血液樣本中TLRs MyD88通路因子的表達(dá)量存在差異，血液中MyD88、TRAF6、FOS、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)在感染死亡羊與感染未死亡羊間呈現(xiàn)出明顯的差異，且MyD88、FOS、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)與試驗羊臨床死亡呈正相關(guān)，NF-κB呈負(fù)相關(guān)；因此分析認(rèn)為TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平可能與不同品種羊?qū)o感染后全身性炎癥水平和易感性差異有關(guān)聯(lián)。

圖4 不同品種羊血液樣本中TLRs MyD88 通路因子轉(zhuǎn)錄水平種間差異比較結(jié)果Fig.4 Comparative results of interspecies diff erences in transcript levels of TLRs MyD88 pathway factors in blood samples from diff erent breeds of sheep

3 討論

貴州黑山羊、貴州白山羊、黔北麻羊是貴州省地方三大優(yōu)良山羊品種，具有體質(zhì)健壯、耐粗糧、肉質(zhì)鮮美、適應(yīng)山地環(huán)境等特點，波爾山羊和湖羊是近年來大力引進(jìn)的品種，具有繁殖能力強(qiáng)、產(chǎn)羔多、適應(yīng)性強(qiáng)等特點。綿羊肺炎支原體（Mo）是引起山羊和綿羊發(fā)生支原體性肺炎的主要病原之一[9]，臨床上多表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦、間質(zhì)性纖維素性肺炎等[10]，死亡率高，嚴(yán)重阻滯了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。自從張雙翔等[11]于2011年首次從貴州省暴發(fā)胸膜肺炎的山羊的肺臟中分離到Mo后，Mo感染病例在貴州省多個地區(qū)相繼出現(xiàn)，且不同品種羊?qū)o的易感性和癥狀均有明顯的差異。因此本研究選取貴州5個主要品種羊為研究對象，探討不同品種羊?qū)o的易感性與TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系，為研究Mo對不同品種羊的致病機(jī)理及其治療方案提供參考資料。

TLRs介導(dǎo)的MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路，還是免疫調(diào)節(jié)治療的重要靶點[12-13]。MyD88是TLR信號通路的核心接頭蛋白，在先天性免疫、獲得性免疫和多種疾病的發(fā)生中均起著重要作用[14]。Moreira等[15]研究發(fā)現(xiàn)來自紫玉米的花青素提取物（AE）可通過調(diào)節(jié)TLRs MyD88通路，下調(diào)LPS注射誘導(dǎo)的關(guān)鍵急性炎癥成分（IL-1β、IL-6、IL-10、KC和CCL2），提供預(yù)防和抗炎的有益活性。Zhang等[16]研究數(shù)據(jù)表明，TLR2/4-MyD88-NF-κB信號通路參與了顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機(jī)制，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著顯著的作用。本研究發(fā)現(xiàn)不同品種羊感染Mo后肺臟樣本中MyD88、TRAF6、FOS基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)與試驗羊臨床死亡率呈正相關(guān)，其原因可能是Mo感染后其肺臟MyD88信號通路被迅速激活，上調(diào)了炎癥因子的表達(dá)，肺組織發(fā)生嚴(yán)重炎癥導(dǎo)致呼吸衰竭而死，今后可通過抑制MyD88信號通路因子的表達(dá)探索羊支原體肺炎的治療手段。因此，研究Mo感染對貴州不同品種羊TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平的影響具有重要的現(xiàn)實意義。

盡管T L R s 是進(jìn)化上保守的模式識別受體（Pattern recognition receptor, PRRs）大家族的成員[17-18]，但也有研究表明TLRs及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在不同人或動物群體間存在一定的差異性。杜江等[19]研究發(fā)現(xiàn)TLR4及MyD88多態(tài)性與江蘇地區(qū)人群對幽門螺桿菌易感性相關(guān)；姬曉蓓等[20]研究證實了TLR3c.1377、TLR9 2848可能皆與多發(fā)性硬化（multiple sclerosis, MS）易感基因緊密連鎖，與中國南方漢族人群對MS的易感性相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)不同品種羊感染Mo后臨床癥狀與病理變化有明顯差異，且貴州白山羊在96 h內(nèi)全部死亡，之后貴州黑山羊和黔北麻羊相繼死亡，而波爾山羊和麻羊僅表現(xiàn)為輕微的呼吸道癥狀。5個品種試驗羊在感染Mo后其肺臟和血液中TLRs-MyD88-TRAF6-NF-?B/AP-1通路基因表達(dá)量均高于對照組，可能為Mo感染引發(fā)肺炎所致；早期死亡的貴州白山羊肺臟中MyD88、NF-κB、JUN基因表達(dá)差異倍數(shù)顯著高于其余4個品種羊，與其死亡率呈正相關(guān)，其原因可能是貴州白山羊?qū)o易感程度高，從而快速激活MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)加劇而快速死亡。研究還發(fā)現(xiàn)隨時間的變化，血液中MyD88、TRAF6、FOS、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)在感染死亡羊與感染未死亡羊間呈現(xiàn)出明顯的差異，且MyD88、FOS、JUN基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)與試驗羊死亡率呈正相關(guān)，而NF-κB呈負(fù)相關(guān)，其原因可能是未死亡羊NF-κB基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)量高，使其機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)增強(qiáng)，從而存活下來，但其機(jī)制尚未可知，可作為下一步研究的重點。綜上所述，分析認(rèn)為TLRs MyD88通路因子基因轉(zhuǎn)錄水平與不同品種羊?qū)o的易感程度有關(guān)，可為將來研究Mo對于不同品種羊的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。