柴文嫻，駱 歡，金 松，王 姣，羅堅強，洪雅琴，耿拓宇，崔恒宓，胡序明

（1.常州市動物疫病預(yù)防控制中心，常州 213002；2.揚州大學 動物科學與技術(shù)學院/表觀遺傳學及表觀基因組學研究所，揚州 225009；3.揚州大學 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009）

巨噬細胞（macrophage）是單核吞噬細胞系統(tǒng)晚期分化細胞，由骨髓造血祖細胞發(fā)育分化釋放進入外周血。作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，巨噬細胞在抵抗病原微生物感染過程中具有關(guān)鍵作用。

近年來，長非編碼RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）作為非編碼RNA的重要家族成員在巨噬細胞天然免疫中的作用也逐漸被認識[1-2]。早期研究發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激小鼠骨髓樹突狀細胞后引起lncRNA異常表達，隨后證實這些lncRNA與小鼠肺部的病毒感染、單核細胞和巨噬細胞的激活密切相關(guān)[3]。在人和鼠巨噬細胞中，lncRNA-Cox2和THRIL對調(diào)節(jié)TLR2信號起著關(guān)鍵作用。值得注意的是，內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous retroviruses, ERVs）也是宿主lncRNAs的重要來源之一。在小鼠巨噬細胞中鑒定了1278個全長ERVs來源的lncRNAs，其中l(wèi)nc-EPAV已被證明可以增強宿主的抗病毒天然免疫應(yīng)答[4]。因此，源自內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的lncRNAs可能是巨噬細胞參與抗病毒免疫反應(yīng)的重要組成部分。

內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒是遠古反轉(zhuǎn)錄病毒感染時留下的痕跡，不僅對早期胚胎發(fā)育和胚胎干細胞具有重要作用，還可能與宿主免疫應(yīng)答有關(guān)。目前，在雞基因組中已鑒定出多種類型的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒，但其基因組結(jié)構(gòu)都與禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）類似[5]。其中，已鑒定雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1定位于雞1號染色體[6]，且受到DNA甲基化調(diào)控[7]。研究表明，雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1衍生的長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1與宿主遺傳抗性有關(guān)[8]，并且能夠在雞胚成纖維細胞中激活抗病毒天然免疫反應(yīng)[9]。然而，關(guān)于lnc-ALVE1-AS1在雞免疫細胞尤其是巨噬細胞細胞中的抗病毒功能及其作用機制尚不清楚。

為了進一步探索lnc-ALVE1-AS1在雞巨噬細胞中的抗病毒作用及其機制，本研究通過抗病毒實驗分析了lnc-ALVE1-AS1對巨噬細胞抗病毒天然免疫和ALV-J病毒增殖能力的影響，并初步探索了lnc-ALVE1-AS1在巨噬細胞中的作用機制。研究結(jié)果為進一步研究lnc-ALVE1-AS1在巨噬細胞中的抗病毒功能和機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞、質(zhì)粒和病毒 重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1由本實驗室構(gòu)建；雞巨噬細胞系（HD11）和J亞群禽白血病病毒（ALV-J）JS09GY3毒株由揚州大學秦愛建教授饋贈。

1.2 主要試劑 RNA-easy Isolation Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)和熒光染料ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購自美國Gibco公司；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent購自美國T hermo Fisher Scientific公司；Amlexanox（TBK1/IKKε inhibitor）購自美國InvivoGen公司；雞TLR3抗體購自美國Novus Biologicals公司；山羊抗兔IgG（Alexa Fluor?488）購自英國Abcam公司；lncRNA FISH Probe Mix購自廣州銳博生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計與合成 所有引物采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計并委托Thermo Fisher Scientific公司合成，引物序列如表1所示。

表1 本研究所使用的qPCR 引物Table 1 The qPCR primers used in this study

1.4 ALV-J感染HD11后lnc-ALVE1-AS1的表達檢測 雞巨噬細胞系HD11細胞接種6孔細胞培養(yǎng)板后，按照病毒感染復(fù)數(shù)MOI=5感染ALV-J（毒株JS09GY3）。病毒感染細胞后6、12和24 h分別收集細胞。然后，按照RNA-easy Isolation Reagent說明書提取總RNA。接下來，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)物。cDNA產(chǎn)物稀釋后通過Bio-Rad公司CFX ConnectTM實時定量PCR儀進行定量分析。反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，SYBR Green Ⅱ 10 μL，上、下游引物各2 μL，無RNA酶水5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個循環(huán)。檢測基因為lnc-ALVE1-AS1，內(nèi)參基因為GAPDH。

1.5 長非編碼RNAlnc-ALVE-AS1轉(zhuǎn)染HD11細胞后ALV-J增殖能力的檢測 HD11細胞接種6孔細胞培養(yǎng)板后感染ALV-J（毒株JS09GY3）（MOI=5）。病毒感染后4 h，根據(jù)Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent說明書分別將pcDNA3.1-lnc-ALVE-AS1（2 μg）和pcDNA3.1-GFP（2 μg）重組真核表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11細胞。病毒感染后48 h，收集上清液，按照IDEXX禽白血病抗原檢測試劑盒的操作步驟，ELISA檢測細胞上清中ALV-J p27蛋白表達水平。細胞上清中的ALV-J效價檢測通過間接免疫熒光分析后計算出ALV-J的TCID50。同時，收集細胞并提取總RNA，并按照材料與方法1.4所述步驟檢測lnc-ALVE1-AS1和ALV-J囊膜基因env表達水平。

1.6 長非編碼RNAlnc-ALVE-AS1轉(zhuǎn)染HD11細胞后天然免疫基因表達的檢測 HD11細胞接種6孔細胞培養(yǎng)板后，根據(jù)Lipof ectamine? 3000 Transfection Reagent說明書分別將pcDNA3.1-lnc-ALVE-AS1（2 μg）和pcDNA3.1-GFP（2 μg）重組真核表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HD11細胞。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后36 h收集細胞并提取總RNA，并按照材料與方法1.4所述步驟檢測TLR3、IRF7、IFN-α、IFN-β、MX1、OASL和IFITM3表達水平。

1.7 長非編碼RNAlnc-ALVE-AS1誘導TLR3信號分析

1.7.1 TLR3干擾后lnc-ALVE-AS1轉(zhuǎn)染HD11細胞天然免疫基因表達的檢測 針對雞TLR3序列（NM_001011691.3），由Thermo Fisher Scientific公司設(shè)計合成兩對RNA干擾序列，具體序列如下：TLR3_Stealth_1 S：5'-CCGAGUACAGCAAUCUGAU UUACUU-3'；TLR3_Stealth_1 AS：5'-AAGUAA AUCAGAUUGCUGUACUCGG-3'；TLR3_Stealth_2 S：5'-CAGCAAAUUUAGGAUUGCAGCAACA-3'；TLR3_Stealth_2 AS：5'-UGUUGCUGCAAUCC UAAAUUUGCUG-3'。

H D 1 1 細胞 接種6 孔細胞培養(yǎng)板后，按照Lipofectamine? RNAiMAX Transfection Reagent說明書進行TLR3 siRNA轉(zhuǎn)染。TLR3 siRNA轉(zhuǎn)染后12 h轉(zhuǎn)染lnc-ALVE1-AS1，具體步驟按照Lipofectamine?3000 Transfection Reagent說明書進行，lnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染細胞后36 h收集細胞并提取總RNA。然后，按照材料與方法1.4所述步驟檢測Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）的表達水平。

1.7.2 TLR3下游信號抑制后lnc-ALVE-AS1轉(zhuǎn)染HD11細胞天然免疫基因表達的檢測 TLR3下游TBK1/IKKε抑制劑Amlexanox（InvivoGen，處理濃度100 μmol/L）作用HD11細胞2 h后轉(zhuǎn)染lnc-ALVE1-AS1。細胞轉(zhuǎn)染后36 h收集細胞并提取總RNA。然后，按照材料與方法1.4所述步驟檢測Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）的表達水平。

1.7.3 lnc-ALVE1-AS1與TLR3共定位分析 長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1和TLR3蛋白在HD11細胞內(nèi)的共定位通過RNA FISH（Fluorescence in situ Hybridization）實驗來確定。靶向lnc-ALVE1-AS1全長序列l(wèi)ncRNA FISH Probe Mix由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計合成。首先，參照RiboTMFluorescent In Situ Hybridization Kit說明書將lnc-ALVE1-AS1探針過夜雜交后分別進行雞TLR3抗體（Novus Biologicals，NBP2-24565）和山羊抗兔IgG（Alexa Fluor?488）孵育。然后，加入DAPI染色液，染色10 min。避光條件下，從孔中小心取出細胞爬片，用封片劑將其固定于載玻片上，最后，通過Leica SP8共聚焦熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計分 析與作圖 用SPSS軟件（version 19.0）和Excel GraphPad（Prism 5）軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。所有實驗數(shù)據(jù)以t檢 驗比較組間差異并以Mean±SEM表示，*表示差 異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 ALV-J感染HD11后lnc-ALVE1-AS1的表達檢測結(jié)果 首先分析了lnc-ALVE-AS1在ALV-J感染雞巨噬細胞系HD11中的表達規(guī)律。與未感染ALV-J的對照組相比，lnc-ALVE1-AS1在ALV-J感染HD11細胞12 h和24 h后持續(xù)下調(diào)。并且，在感染后24 h顯著下調(diào)（圖1）。

圖1 lnc-ALVE-AS1 在ALV-J 感染HD11 細胞的表達檢測結(jié)果Fig.1 Expression detection results of lnc-ALVE-AS1 in ALV-J infected HD11 cells

2.2 長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染HD11細胞后ALV-J增殖能力的檢測結(jié)果 既然ALV-J在感染巨噬細胞過程中抑制lnc-ALVE1-AS1表達，那么意味著lnc-ALVE1-AS1可能具有抵抗ALV-J增殖的能力。由此，進一步觀察lnc-ALVE1-AS1對ALV-J增殖的影響。結(jié)果顯示：與GFP對照組相比，ALV-Jenv基因mRNA表達水平在lnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染后48 h的HD11細胞顯著下調(diào)（圖2A，2B）。同時，過表達lnc-ALVE1-AS1也顯著減少細胞上清液中ALV-J p27蛋白表達（圖2C）。與此結(jié)果一致的是，與對照組相比，HD11上清中的ALV-J的病毒效價在lnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染后48 h明顯減少（圖2D）。這些結(jié)果證實了過表達lnc-ALVE1-AS1可以顯著抑制ALV-J在雞巨噬細胞HD11中增殖。

圖2 長非編碼RNA lnc-ALVE-AS1 轉(zhuǎn)染HD11 細胞后lnc-ALVE-AS1（A）表達以及ALV-J 增殖能力的RT-qPCR（B）、ELISA（C）和TCID50（D）檢測結(jié)果Fig.2 Expression detection results of lnc-ALVE-AS1(A) as well as RT-qPCR (B), ELISA (C) and TCID50 (D) for ALV-J proliferation after HD11 cells were transfected with long coding RNA lnc-ALVE-AS1

2.3 長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染HD11細胞后天然免疫基因表達的檢測結(jié)果 既然lnc-ALVE-AS1可以抑制ALV-J在HD11細胞中增殖，那么過表達lnc-ALVE1-AS1應(yīng)該可以激活抗病毒天然免疫基因表達。如圖3所示，過表達lnc-ALVE1-AS1顯著上調(diào)dsRN A識別受體TLR3和Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）在HD11細胞中表達（圖3）。另外，lnc-ALVE1-AS1也誘導其他抗病毒天然免疫基因（IRF7、MX1、OASL和IFITM3）在HD11細胞中表達。這說明lnc-ALVE1-AS1可以激活HD11細胞抗病毒天然免疫。

圖3 長非編碼RNA lnc-ALVE-AS1 轉(zhuǎn)染HD11 細胞后天然免疫基因表達的檢測結(jié)果Fig.3 Expression detection results of innate immune genes in HD11 cells transfected with the plasmid pcDNA3.1-lnc-ALVE1-AS1

2.4 長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1誘導TLR3信號分析結(jié)果 值得注意的是，lnc-ALVE-AS1顯著激活TLR3及其下游Ⅰ型干擾素在HD11細胞中的表達，這說明TLR3信號可能是lnc-ALVE1-AS1激活抗病毒天然免疫的一個重要途徑。首先，通過干擾TLR3表達后再轉(zhuǎn)染lnc-ALVE1-AS1，與對照組相比，干擾TLR3后顯著抑制lnc-ALVE1-AS1誘導Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）的表達（圖4A）。接下來，通過TLR3信號抑制 劑Amlexanox（TBK1/IKKε inhibitor）阻斷TLR3-TRIF-TBK1/IKKε-TypeⅠinterferons信號通路2 h后，再轉(zhuǎn)染lnc-ALVE1-AS1。結(jié)果顯示：與對照組相比，Amlexanox處理后也顯著抑制了lnc-ALVE1-AS1誘導Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）表達（圖4B）。最后，通過共定位實驗觀察到lnc-ALVE1-AS1可以與TLR3蛋白直接相互作用（圖4C）。這說明lnc-ALVE1-AS1可能通過TLR3信號激活HD11細胞抗病毒天然免疫。

圖4 長非編碼RNA lnc-ALVE-AS1 誘導TLR3 信號分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of induction of TLR3 signals by long non-coding RNA lnc-ALVE-AS1

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在雞巨噬細胞中增殖。在小鼠巨噬細胞也發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒衍生的長非編碼RNA lnc-EPAV可以增強宿主的抗病毒免疫并抑制病毒增殖[4]。另外，雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE衍生的piRNA可能參與抵抗禽白血病病毒[10]。因此，雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE衍生的非編碼RNA如lncRNA和piRNA可能是細胞免疫應(yīng)答的重要組成部分以增強宿主抵抗外源性病毒感染。

通過激活TLR3信號介導的Ⅰ型干擾素應(yīng)答可能是lnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在巨噬細胞中增殖的一個重要機制。過表達lnc-ALVE1-AS1顯著激活TLR3和Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）等抗病毒天然免疫基因表達。然而，lnc-ALVE1-AS1這種能力在干擾TLR3或者抑制TLR3信號后顯著減弱。共聚焦定位分析顯示在巨噬細胞中l(wèi)nc-ALVE1-AS1可以與TLR3蛋白直接結(jié)合。此外，研究也發(fā)現(xiàn)TLR3配體刺激會誘導大量lncRNAs異常表達[11]，暗示lncRNA可作為TLR3識別信號和天然免疫的調(diào)節(jié)因子[12]。這些結(jié)果說明誘導TLR3信號是lnc-ALVE1-AS1激活抗病毒天然免疫的一個重要機制。

研究表明，內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒衍生的RNA能夠被TLR3蛋白識別并激活抗病毒天然免疫。TLR3是一個重要的細胞內(nèi)雙鏈 RNA（Double stranded RNA,dsRNA）識別受體并參與抗病毒反應(yīng)[13]。在哺乳動物中，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA可以通過識別受體TLR3觸發(fā)信號傳導以增強干擾素應(yīng)答[14-16]。關(guān)鍵的dsRNA識別受體TLR3在lnc-ALVE1-AS1轉(zhuǎn)染后的巨噬細胞中顯著上調(diào)，說明dsRNA可能是lnc-ALVE1-AS1發(fā)揮作用的一個重要因素。長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1是一個反義lncRNAs，可能與其序列互補的正義RNA形成dsRNA。另外，lnc-ALVE1-AS1自身結(jié)構(gòu)中可能形成一些短dsRNA片段。這些dsRNA可以被TLR3識別并激活抗病毒天然免疫。這種行為類似于去甲基化抑制劑5-Aza-dC通過激活源自內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒dsRNA來誘導干擾素應(yīng)答反應(yīng)[14-15]。除了識別dsRNA，TLR3還可以識別病毒衍生的帶有凸起/內(nèi)環(huán)的莖結(jié)構(gòu)的單鏈RNA片段[17-18]。生物信息學分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)lnc-ALVE1-AS1可以形成許多帶有凸起/內(nèi)環(huán)的莖結(jié)構(gòu)，這些獨特的RNA結(jié)構(gòu)可能被TLR3識別。然而，關(guān)于lnc-ALVE1-AS1如何調(diào)節(jié)TLR3的機制尚不清楚，還有待進一步研究。

綜上所述，本研究揭示了長非編碼RNAlnc-ALVE1-AS1在巨噬細胞中抗病毒功能及其作用機制，為進一步研究內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒在巨噬細胞中的抗病毒功能和機制奠定了基礎(chǔ)。