徐晶晶，高 飛,2，武吉強，程雪飛，劉宇婷，傅欣玲，鄭 浩,2，童 武,2，童光志,2，李國新,2

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.揚州大學 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）是一個含有多蛋白的DNA病毒，成熟的PRV病毒結構包括病毒DNA、核衣殼、被膜和囊膜，其中核衣殼主要起支撐病毒結構和保護DNA的功能，大量的被膜蛋白和囊膜蛋白則在病毒粒子的增殖、調節(jié)宿主免疫通路和調控宿主凋亡等方面有廣泛的作用[1]。2011年，我國許多豬場發(fā)生了由PRV變異毒株引起的豬偽狂犬病，PRV經典疫苗如Barhta-K61等免疫不能為豬提供完全保護[2-3]。

2012年，本實驗室把PRV變異株JS-2012株在Vero細胞上39℃連續(xù)傳代120代后，獲得1株疫苗候選株JS-2012-F120株。和JS-2012相比，F(xiàn)120的測序結果顯示，UL16基因發(fā)生了移碼突變。UL16蛋白是PRV的重要被膜蛋白，在病毒的毒價、病毒在細胞上的擴散、病毒對小鼠的毒力等多方面有很重要的作用[4-5]。但是，迄今為止，對UL16蛋白的研究只停留在病原學，并未探討在PRV感染細胞時，pUL16可能參與的細胞通路。為了探索UL16蛋白對PRV的影響，本研究就pUL16的功能以及與其相互作用的分子進行了研究。本研究用IP的方法、借助質譜篩選了在PRV感染時，與pUL16相互作用的宿主蛋白，以研究pUL16可能參與的細胞通路。通過篩選發(fā)現(xiàn)UL16蛋白與凋亡誘導因子1（apoptosisinducing factor mitochondria associated 1, AIFM1）相互作用。AIFM1是一個結構復雜的線粒體蛋白，能優(yōu)化線粒體呼吸鏈的功能、參與氧化還原代謝，是第一個被發(fā)現(xiàn)的caspase非依賴性的凋亡蛋白?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)TGEV、IV、Rabies virus、PEDV等病毒均能誘導細胞產生caspase非依賴性的凋亡[6-9]，這可能預示pUL16參與細胞的氧化還原反應通路或凋亡通路。但PRV是否能引起這種凋亡，至今尚未有研究報道。因此本文針對AIFM1與pUL16互作對PRV的增殖作用，以及在PRV增殖過程中AIFM1的作用進行研究，對進一步了解pUL16蛋白有一定積極的意義，也豐富了對皰疹病毒的研究。

1 材料和方法

1.1 病毒與細胞 偽狂犬病病毒變異株JS-2012（GenBank登錄號：KP257591）、JS-2012-ΔUL16、PK-15、Vero和293t細胞為本實驗室保存，所有的細胞均在37℃、5% CO2和10% Fetal bovine serum（FBS，Gibco，USA）條件下，在Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 Top10和DH5α感受態(tài)細胞均購自天根生化科技（北京）有限公司；Anti-AIFM1抗體；UL19抗體由本實驗室保存；caspase-3試劑盒、caspase-6 試劑盒、caspase-8試劑盒、caspase-9試劑盒和JC-1凋亡試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；不含EDTA的胰酶購自Thermo Fisher公司；Lipo3000轉染試劑購自英濰捷基（Invitrogen）生物科技有限公司；anti-HA抗體，anti-FLAG和antimyc抗體購自默克（Merck）公司。

1.3 siRNA的設計與合成 對AIFM1分子的siRNA進行設計，序列見下表1，siRNA由吉瑪生物科技有限公司合成。

表1 AIFM1 siRNA 序列Table 1 siRNA sequences of AIFM1

1.4 免疫沉淀（co-Immunoprecipitation, IP）

1.4.1 外源的UL16-HA與AIFM1-FLAG的IP檢測 將293t細胞分裝于6孔板中，待細胞密度達到70%時，用Lipo3000單轉染UL16-HA、AIFM1-FLAG、pCAGGS，共轉染UL16-HA和AIFM1-FLAG后，將6孔板放于培養(yǎng)箱中。24 h后，用IP lysis收集細胞，并用HA-beads做IP，保存樣品，用于后續(xù)SDSPAGE，轉膜后分別用anti-HA和anti-FLAG作為一抗進行Western blot鑒定。

1.4.2 UL16-HA與內源AIFM1的IP檢測 將Vero細胞分裝于6孔板中，待細胞密度達到70%時，用FuGENE轉染UL16-HA和pCAGGS，然后將6孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，用IP lysis收集細胞，并用HA-beads做IP，保存樣品，用于后續(xù)SDS-PAGE，轉膜后分別用anti-HA和anti-AIFM1作為一抗進行Western blot鑒定。

1.5 UL16與AIFM1共定位

1.5.1 UL16-HA質粒與內源AIFM1共定位情況 將Vero細胞分裝于事先放入蓋玻片的6孔板中，混勻細胞，并將6孔板放于培養(yǎng)箱中。細胞密度達到70%時，轉染UL16-HA質粒，輕輕混勻后將6孔板放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后分別用冰甲醇固定細胞和用5%BSA封閉細胞，并用PBS洗3次。接著用anti-myc和AIFM1作為一抗37℃孵育同一孔的細胞1 h，PBS洗細胞3次，并用anti-mouse和anti-rabbit二抗孵育細胞1 h，PBS洗細胞后，用DAPI染細胞核、封片、晾干后用蔡司激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5.2 PRV感染時，UL16與細胞內AIFM1共定位情況 將PK-15細胞分裝于有蓋玻片的6孔板中，混勻細胞，將6孔板放于培養(yǎng)箱中。細胞密度達到90%時，用0.1 MOI JS-2012和JS-2012-ΔUL16分別感染細胞1 h，然后棄去細胞上清液，用PBS洗細胞2次，加入無FBS DMEM，并將6孔板放于培養(yǎng)箱中。24 h后，棄去病毒上清液，用稀釋的線粒體探針和活細胞37℃作用20 min，然后用細胞固定液（配方：4%蔗糖，4%多聚甲醛，pH7.4）固定細胞，用5%BSA封閉細胞。PBS洗細胞3次后，將稀釋的UL16多克隆抗體和AIFM1抗體作為一抗，37℃孵育細胞1 h，然后用熒光二抗孵育細胞，最后用DAPI染細胞核，封片、晾干，用蔡司激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 過表達AIFM1對PRV增殖的影響

1.6.1 過表達AIFM1對PRV蛋白表達的影響 將PK-15細胞平均分裝到6孔板中，細胞密度達到70%時，用Lipo3000分別轉染質粒1 μg AIFM1-FLAG、3 μg AIFM1-FLAG和3 μg空載體p3×FLAG，然后將6孔板放于培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。18 h后，用0.1 MOI的JS-2012和JS-2012-ΔUL16分別感染細胞。1 h后，吸去細胞的病毒上清液，用PBS洗細胞2次，并向細胞中加入無FBS DMEM，將6孔板放入培養(yǎng)箱，并在病毒感染后的12、24和36 h分別收取細胞中的蛋白，保存于-40℃，用于SDS-PAGE和Western blot檢測。

1.6.2 過表達AIFM1對PRV TCID50的影響 將PK-15細胞平均分裝到6孔板中，細胞密度達到70%時，用Lipo3000分別轉染質粒1 μg AIFM1-FLAG、3 μg AIFM1-FLAG和3 μg空載體p3×FLAG，然后將6孔板放于培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。18 h后，用0.1 MOI的JS-2012和JS-2012-ΔUL16分別感染細胞。1 h后，吸去細胞的病毒上清液，用PBS洗細胞2次，并向細胞中加入無FBS DMEM，將6孔板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并在病毒感染后的12、24和36 h分別收取病毒上清液，保存于-80℃，用于后續(xù)檢測TCID50。

1.7 干擾AIFM1對PRV增殖的影響

1.7.1. 驗證合成的siRNA有效性 將PK-15細胞分裝到12孔板中培養(yǎng)；細胞密度達到70%時，用RNAMAX分別轉染25 μg siRNA1、siRNA2、siRNA3（序列見表1），然后將細胞放于培養(yǎng)箱中，30 h后，棄去細胞上清，收取細胞，存于-20℃，用于后續(xù)的SDSPAGE和Western blot檢測。

1.7.2 干擾AIFM1表達對PRV蛋白表達的影響 將PK-15細胞平均分裝到6孔板中，細胞密度達到70%時，用RNAMAX轉染siRNA和siCTR，然后將6孔板放于培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。30 h后，用0.1 MOI的JS-2012和JS-2012-ΔUL16分別感染細胞。1 h后，吸去細胞的病毒上清液，用PBS洗細胞2次，并向細胞中加入無FBS DMEM，將6孔板放入培養(yǎng)箱，并在病毒感染后的12、24和36 h分別收取細胞中的蛋白，保存于-40℃，用于SDS-PAGE和Western blot檢測。

1.7.3 干擾AIFM1的表達對PRV TCID50的影響 將PK-15細胞平均分裝到6孔板中，細胞密度達到70%時，用RNAMAX轉染siRNA和siCTR，然后將6孔板放于培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。30 h后，用0.1 MOI的JS-2012和JS-2012-ΔUL16分別感染細胞。1 h后，吸去細胞的病毒上清液，用PBS洗細胞2次，并向細胞中加入無FBS DMEM，將6孔板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后在病毒感染后的12、24和36 h分別收取病毒上清液，保存于-80℃，用于后續(xù)測TCID50。

1.8 流式細胞分析 因為AIFM1在非經典的凋亡通路中有很重要的作用，因此用V-PI檢測細胞凋亡，將PK-15細胞分裝到5 cm dish中，然后將dish放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞密度達到70%時，轉染AIFM1-FLAG，然后將dish放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；18 h后，使用0.1 MOI JS-2012和JS-2012-ΔUL16感染細胞；1 h后，棄掉病毒上清液，PBS洗細胞2次，向dish中加入無FBS DMEM，并將dish放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；樣品染色：用不含EDTA的胰酶消化后，300×g、4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性；用預冷的PBS洗滌細胞2次，4℃離心5 min。收集1×105～5×105個細胞；棄掉PBS，用100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞；加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL PI Staining Solution，輕輕混勻。室溫反應10～15 min、避光；向其中加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后放置于冰上，樣品在1 h內用流式細胞儀檢測；樣品分析：流式細胞儀分析。

1.9 經典凋亡通路的研究 為了研究在AIFM1對經典凋亡通路的影響，分別進行了caspase-3、caspase-6、caspase-8、caspase-9的檢測，按照caspase試劑盒進行操作。樣品中caspase 3催化pNA產生的吸光度=樣品A405-空白對照A405 Caspase 3酶活力單位：在37℃、1 h內可以剪切1 nmoL Ac-DEVD-pNA產生1 nmoL的caspase 3的酶量。

2 結果

2.1 外源的UL16-HA與AIFM1-FLAG互作 為了確定pUL16與外源性AIFM1、內源性AIFM1相互作用，用UL16-HA與AIFM1質?；蚣毎械腁IFM1進行IP。結果表明，UL16-HA質粒表達的蛋白與AIFM1-FLAG質粒表達的蛋白相互作用，UL16-HA質粒表達的蛋白也與細胞內的AIFM1相互作用（圖1）。因此，可以得出結論 PRV UL16蛋白與宿主蛋白AIFM1相互作用。

圖1 UL16 與AIFM1 相互作用Fig.1 The interaction between pUL16 and AIFM1

2.2 UL16與AIFM1共定位

2.2.1 UL16-HA質粒與內源AIFM1共定位情況 在2.1中，已經證明pUL16與AIFM1互作，為了確定pUL16與AIFM1在細胞中表達時是否能共定位，我們轉染了UL16-HA質粒和AIFM1-FLAG質粒，進行IFA（圖2）。IFA結果表明，AIFM1定位在細胞質和細胞核中，pUL16與AIFM1能共定位。

圖2 轉染的UL16-myc 與AIF-FLAG 共定位Fig.2 Transfected UL16-myc co-localized with AIF-FLAG

2.2.2 PRV感染時，pUL16與細胞內AIFM1共定位情況 為了研究在PRV感染時，pUL16和AIFM1是否相互作用，將JS-2012和JS-2012-ΔUL16感染PK-15細胞，進行IFA。結果顯示，JS-2012感染細胞時，AIF和pUL16可以共定位與線粒體，且AIFM1出現(xiàn)在細胞核中，即AIFM1出現(xiàn)了易位（圖3）。

圖3 PRV 感染時，UL16 與AIFM1 共定位與線粒體，且AIFM1 易位進細胞核Fig.3 PRV infected PK-15 cells, UL16 co-localized with AIFM1 in mitochondria, and AIFM1 translocated into nucleus

2.3 過表達AIFM1抑制PRV的增殖

2.3.1 過表達AIFM1對PRV蛋白表達的影響 過表達不同濃度AIFM1，并感染JS-2012或JS-2012-ΔUL16后，收集蛋白做Western blot。結果表明，過表達AIFM1后，JS-2012的增殖受到一定的抑制，而且抑制JS-2012-ΔUL16增殖的程度要更強，這種抑制程度和過表達的AIFM1的量呈正相關（圖4）。

圖4 過表達AIFM1 抑制JS-2012（A）或JS-2012-ΔUL16（B）的增殖Fig.4 The replication of JS-2012 (A) or JS-2012-ΔUL16 (B) was inhibited when AIFM1 was over expressed

2.3.2 過表達AIFM1對PRV TCID50的影響 過表達AIFM1，并感染JS-2012或JS-2012-ΔUL16后，收集上清液進行TCID50檢測。結果表明，過表達AIFM1后，JS-2012的增殖受到一定的抑制，而且抑制JS-2012-ΔUL16增殖的程度要加大（圖5）。

圖5 過表達AIFM1 抑制JS-2012（A）或JS-2012-ΔUL16（B）的增殖Fig.5 The replication of JS-2012 (A) or JS-2012-ΔUL16 (B) was inhibited when AIFM1 was over expressed

2.4 干擾AIFM1增強PRV的增殖

2.4.1 干擾AIFM1表達對PRV蛋白表達的影響 干擾AIFM1，并感染JS-2012或JS-2012-ΔUL16后，收集蛋白進行Western blot鑒定。結果表明，干擾AIFM1后，JS-2012的增殖有所增強，而且增強JS-2012-ΔUL16增殖的程度要加大（圖6）。

圖6 干擾AIFM1 增強JS-2012（A）或JS-2012-ΔUL16（B）的增殖Fig.6 The replication of JS-2012 (A) or JS-2012-ΔUL16 (B) was promoted when AIFM1 was knocked down

2.4.2. 干擾AIFM1的表達對PRV TCID50的影響 干擾AIFM1，并感染JS-2012或JS-2012-ΔUL16后，收集上清液進行TCID50檢測。結果表明，干擾AIFM1后，JS-2012的增殖有所增強，而且增強JS-2012-ΔUL16增殖的程度要加大（圖7）。

圖7 敲低AIFM1 抑制JS-2012（A）或JS-2012-ΔUL16（B）的增殖Fig.7 The replication of JS-2012 (A) or JS-2012-ΔUL16 (B) was promoted when AIFM1 was knocked down

2.5 PRV感染時AIFM1提高細胞凋亡 由于在線粒體膜的膜電位發(fā)生極差時，AIFM1從線粒體易位到細胞質，并進一步進入細胞核，結合DNA，從而能促進細胞進行caspase非依賴性的凋亡， 在PRV感染時，也會發(fā)生線粒體膜電位的改變和細胞凋亡，那AIFM1在這個過程中是否有一定的作用？為了驗證這一疑問，我們過表達或干擾AIFM1，然后將PK-15細胞感染JS-2012或JS-2012-ΔUL16，并用JC-1檢測線粒體膜電位的變化。結果顯示，過表達AIFM1時，JS-2012感染的細胞的線粒體膜點位降低，即凋亡率較高；干擾AIFM1表達時，JS-2012感染的細胞的線粒體膜點位升高，即凋亡率較高。JS-2012-ΔUL16的細胞呈現(xiàn)相同的特點（圖8）。

圖8 PRV 感染時，AIFM1 增大線粒體內外膜電位差Fig.8 When PRV infected cells, AIFM1 enlarged the potential diff erences in mitochondria

2.6 PRV感染時，AIFM1對細胞caspase表達的影響 將過表達AIFM1或干擾siAIFM1的PK-15細胞感染JS-2012或JS-2012-ΔUL16，并分別于感染后12 h、24 h收集細胞檢測細胞caspase-3、caspase-6、caspase-8或caspase-9的表達量。由于PRV感染后12 h時，細胞僅有少數發(fā)生凋亡，因此我們主要觀察PRV感染后24 h時細胞凋亡情況。結果顯示，JS-2012感染細胞24 h時，過表達AIFM1，caspase-6表達量升高，caspase-3、caspase-9和caspase-8表達量無差異；干擾AIFM1表達時，caspase-6表達量升高，caspase-3、caspase-9表達量無差異，caspase-8表達量升高。JS-2012-ΔUL16感染細胞24 h時，過表達AIFM1，caspase-6、caspase-3表達量升高，caspase-9表達量無差異，caspase-8表達量降低；干擾AIFM1表達時，caspase-6、caspase-3、caspase-8表達量升高，caspase-9表達量無差異（圖9）。

圖9 PRV 感染時，AIFM1 對PK-15 細胞caspase 表達的影響Fig. 9 The expressions of caspase when PRV infected PK-15 cells by treating with AIFM1

3 討論

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的、以豬為終末宿主的、可感染多種動物的急性傳染病。本研究主要針對的是我們實驗室于2012年分離到的1株偽狂犬病病毒變異株JS-2012，之前的研究發(fā)現(xiàn)JS-2012的UL16的序列和Bartha-K61、SC株等傳統(tǒng)的PRV毒株UL16的序列并沒有發(fā)生突變[10-11]，因此我們的研究結果可以推廣到PRV。研究發(fā)現(xiàn)，PRV pUL16與宿主蛋白AIFM1互作。通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)，AIFM1能抑制PRV的增殖，且pUL16能減弱這種抑制作用。

AIFM1在優(yōu)化線粒體呼吸鏈，參與氧化還原方面有很重要的作用[12-13]，另外，AIFM1是caspase非依賴性的蛋白，在線粒體膜電位發(fā)生改變時，能從線粒體易位至細胞核，與染色質結合，促使DNA碎片化，從而誘導細胞凋亡。本研究中，轉染的pUL16能與AIFM1共定位于細胞質、細胞核和線粒體。PRV感染時，AIFM1不僅可以與pUL16共定位，而且能易位進入細胞核，引起細胞凋亡。凋亡又叫細胞程序性死亡，是所有細胞均有的正常過程，皰疹病毒的US3、gJ、LAT等均能對病毒感染時的細胞凋亡有影響[14]。AIFM1參與內源性凋亡途徑，即通過感知線粒體膜電位（mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）的變化，啟動凋亡通路。因此，我們用CCCP刺激線粒體膜電位發(fā)生變化，并用流式檢測了PRV感染時，AIFM1對細胞凋亡的影響，結果顯示，JS-2012后JS-2012-ΔUL16感染時，AIFM1能促進細胞的凋亡。由于至今為止，對AIFM1引起的凋亡通路的研究并不透徹，因此，雖本研究沒有涉及后續(xù)的通路，但依舊值得進一步的研究。