任正婷 桂仲璇 蔣 俊 汪 浩 張佐陽

放射性腸損傷是宮頸癌放射治療常見的并發(fā)癥，盡管目前使用精準放療技術成功地減少了對直腸等腸道危及器官的照射，但仍多達20%的宮頸癌患者會出現(xiàn)輻射后腸損傷的癥狀［1-2］。宮頸癌的治療多為綜合治療，包括手術、放療、化療、靶向治療和免疫治療等［3］。值得注意的是，部分藥物也會對腸道黏膜細胞造成一定程度的損傷［4-5］。既往臨床前瞻性研究指出，加用紫杉類藥物同步放化療治療宮頸癌患者會增加腹瀉發(fā)生率［6］。而抗血管生成藥物治療宮頸癌患者可導致胃腸瘺和腸穿孔發(fā)病率升高［7］。慢性放射性腸損傷的主要病理特征是閉塞性血管內膜炎和間質纖維化，導致進行性腸壁缺血［8］。然而目前尚無來自臨床的標本驗證這兩類藥物對慢性放射性腸損傷組織的作用。因此本研究旨在從病理學角度探討紫杉類藥物和抗血管生成藥物對宮頸癌慢性放射性腸損傷的影響，進一步明確宮頸癌慢性放射性腸損傷患者發(fā)生嚴重并發(fā)癥的獨立危險因素，以期為個體化診療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月至2023年4月期間于安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理診斷明確的宮頸癌慢性放射性腸損傷患者49例，年齡40～83 歲，平均（57.2±11.0）歲。49例宮頸癌患者依據(jù)國際婦產科聯(lián)盟（international federation of gynecology and obstetrics，F(xiàn)IGO）分期［9］為ⅠB～ⅣA 期，均采用盆腔外放射治療（external radiation therapy，EBRT）+高劑量率腔內照射（high dose rate intracavitary therapy，HDRICR）聯(lián)合治療。EBRT：42～51Gy/23～28F，陽性淋巴結同步加量至56～62 Gy，5 F/W；HDRICR 采用192Ir 放射源治療，18～30 Gy/3～5 F，1～2 F/W。其中36例患者EBRT采用調強放射治療，10例患者采用三維適形放射治療，3例患者采用二維放射治療。根據(jù)藥物治療方案不同分為抗血管生成藥物治療組12例和無抗血管生成藥物治療組37例；紫杉類藥物化療組23例和無紫杉類藥物化療組26例。

1.2 方法

1.2.1 臨床特征 根據(jù)Herrmann 提出的腫瘤放射治療協(xié)作組（radiation therapy oncology group，RTOG）/歐洲癌癥研究和治療組織（European organisation for research and treatment of cancer，EORTC）評分標準對49例患者的慢性放射性腸損傷臨床癥狀進行分級［10］，3 級和4 級患者納入嚴重并發(fā)癥組。嚴重并發(fā)癥組29例患者中15例行外科手術治療。進一步根據(jù)患者年齡、宮頸癌分期、宮頸病灶大小、化療方案，是否抗血管生成藥物治療、放療總劑量和直腸V20 受量對嚴重并發(fā)癥組與無嚴重并發(fā)癥組患者的基線資料進行臨床特征匹配。見表1。

表1 宮頸癌慢性放射性腸損傷有無嚴重并發(fā)癥患者的臨床特征比較

1.2.2 HE 染色 49例患者標本均經10% 中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，3 μm 連續(xù)切片，行HE 染色，于光學顯微鏡下對結直腸病理學變化按照直腸放射性病理損傷半定量評分系統(tǒng)進行評分［11］，選定評估腸道損傷的5 個指標：黏膜損傷、炎癥細胞浸潤、腸管纖維化、水腫和血管狹窄（見圖1）。見表2。

圖1 HE染色顯示狹窄血管

表2 放射性病理損傷半定量評分表[11]

1.2.3 免疫組化染色（EnVision兩步法） 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后EDTA 高溫高壓抗原修復，切片浸泡在3% H2O2中10 min 以清除內源性過氧化物酶活性，PBS浸泡3 次、每次5 min，PBST 沖洗1 次、5 min，一抗 （包括：單克隆小鼠抗人VEGFA 抗體19003-1-AP 稀釋比1∶50，購于ProteinTech Group 公司，單克隆小鼠抗人CD31 抗體MAB-0720，稀釋比1∶50，購買于北京中杉金橋生物技術有限公司）4 ℃冰箱中孵育過夜，復溫20 min，PBS 重復浸泡，二抗（山羊抗小鼠/兔二抗PV6000購買于北京中杉金橋生物技術有限公司）室溫孵育15 min，經DAB 顯色，蘇木素復染。以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 Masson 染色 Masson 三色染色液（BA4079B）購買于珠海貝索生物技術有限公司，按照試劑盒說明書使用。3 μm 厚度石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，取出Weigert 鐵蘇木素A 液、B 液，1∶1 均勻混合后使用，將組織完全覆蓋5 min，蒸餾水沖洗反藍，經麗春紅酸性品紅溶液染色后蒸餾水沖洗3 min，磷鉬酸溶液染色后經苯胺藍溶液染色5 min，隨后浸泡在0.2%乙酸溶液中，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片。

1.3 觀察指標

1.3.1 放射性損傷程度評估 2 位評估者（中級及以上醫(yī)師職稱）進行盲法評估，評估者不清楚病理標本上患者的臨床信息。先于10 倍物鏡下觀察標本整體情況，再利用多頭顯微鏡進行同時評分，指標一致后記錄評分。病理總分為潰瘍、炎癥、水腫、壞死和纖維化的評分之和。

1.3.2 VEGF 和CD31 陽性判斷 細胞質染色主要呈棕黃色或棕褐色判定血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達陽性；血管內皮細胞的胞質中出現(xiàn)棕褐色顆粒或棕黃色為染色陽性，判定為CD31 陽性（見圖2）。

圖2 免疫組化CD31示狹窄血管內皮細胞

1.3.3 血管狹窄程度評估 2 位評估者（中級及以上醫(yī)師職稱）進行盲法評估，先于10 倍目鏡下觀察標本整體情況，沿黏膜肌層開始劃到黏膜下層和肌層連接區(qū)域，于200 倍物鏡下計數(shù)總面積0.55 mm2黏膜下層CD31 陽性血管數(shù)，計數(shù)直徑＞35 μm 的血管并測量血管狹窄程度。微血管計數(shù)為總血管數(shù)減去大血管數(shù)。血管狹窄比例為所有分級的狹窄血管數(shù)占總血管數(shù)的比例。

1.3.4 纖維化程度評估 膠原纖維呈天藍色至亮藍色，肌纖維、胞質、纖維素、角質呈紅色至紫紅色，紅細胞呈水紅色。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 27.0 進行統(tǒng)計分析。偏態(tài)分布計量資料用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。單因素和多因素分析采用Cox 統(tǒng)計學方法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抗血管生成藥物對慢性放射性腸損傷影響的病理學分析 抗血管生成藥物治療組的狹窄血管計數(shù)、狹窄血管比例、潰瘍和炎癥程度分均高于無抗血管生成藥物治療組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而抗血管生成藥物治療組的微血管計數(shù)和纖維化程度均低于無抗血管生成藥物治療組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 抗血管生成藥物對慢性放射性腸損傷影響的病理學分析[M(P25，P75)]

2.2 紫杉類藥物對慢性放射性腸損傷影響的病理學分析 紫杉類藥物化療組與無紫杉類藥物化療組間各項病理指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 紫杉類藥物對慢性放射性腸損傷影響的病理學分析[M(P25，P75)]

2.3 慢性放射性腸損傷有無嚴重并發(fā)癥的病理學分析 嚴重并發(fā)癥組的狹窄血管比例和潰瘍程度均高于無嚴重并發(fā)癥組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。嚴重并發(fā)癥組與無嚴重并發(fā)癥組間微血管計數(shù)、狹窄血管計數(shù)、病理總分、炎癥、水腫、壞死和纖維化指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 慢性放射性腸損傷有無嚴重并發(fā)癥的病理學分析[M(P25，P75)]

2.4 慢性放射性腸損傷嚴重并發(fā)癥危險因素Cox 分析 把年齡、宮頸癌分期、宮頸病灶大小、化療方案、是否抗血管生成藥物治療、放療總劑量和直腸V60 受量這些臨床特征納入Cox 單因素分析，結果顯示宮頸癌分期、直腸V60≥20%和抗血管生成藥物是影響慢性放射性腸損傷嚴重并發(fā)癥的因素（P均＜0.05）。將這些因素進一步納入Cox 多因素分析，結果表明宮頸癌分期和直腸V60≥20% 是慢性放射性腸損傷患者發(fā)生嚴重并發(fā)癥的獨立危險因素（P均＜0.05），而抗血管生成藥物不是慢性放射性腸損傷患者發(fā)生嚴重并發(fā)癥的獨立危險因素（P＞0.05）。見表6。

2.5 慢性放射性腸損傷不同發(fā)生時間的病理學分析49例患者慢性放射性腸損傷發(fā)生的中位時間為9 個月，平均（24.0±47.4）月。放療后＜1年發(fā)生組的狹窄血管比例、病理總分、潰瘍和炎癥程度均高于放療后≥1年發(fā)生組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而放療后＜1年發(fā)生組的微血管計數(shù)和纖維化程度（見圖3）均低于放療后≥1年發(fā)生組（見圖4），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表7。

圖3 Masson染色示黏膜層內纖維化輕微

圖4 Masson染色示黏膜層內纖維化（藍色）顯著

表7 慢性放射性腸損傷不同發(fā)生時間的病理學分析[M(P25，P75)]

3 討論

放射性腸損傷根據(jù)發(fā)生時間，以3 個月為界限分為急性和慢性兩種類型。部分患者的急性放射性腸損傷癥狀在3 個月內會自行緩解，但有些患者可能發(fā)展成持續(xù)超過3 個月以上的慢性放射性腸損傷［8］。慢性放射性腸損傷的嚴重并發(fā)癥包括直腸大出血、腸梗阻和瘺管形成等，對患者的身體健康和生活質量產生嚴重影響。目前尚無特效的治療手段，部分患者甚至需要手術干預，臨床診治難度較大［11］。慢性放射性腸損傷通常在8～12 個月內發(fā)生，但放射誘導的直腸病可在放療后30年出現(xiàn)［12］。筆者的研究結果顯示，患者發(fā)生慢性放射性腸損傷的中位時間為9 個月，其中兩位患者分別在放療后19年和20年出現(xiàn)放射性腸損傷癥狀。與放射性腸損傷相關的危險因素較多，其中主要的危險因素是直腸受照射劑量體積，例如V60。此外，合并疾病如糖尿病和高血壓也會增加患者發(fā)生慢性放射性腸損傷的風險［13］。抗腫瘤藥物和放射治療的聯(lián)合使用亦可能會加重腸道損傷，從而導致嚴重并發(fā)癥。因此，研究紫杉類藥物和抗血管生成藥物對慢性放射性腸損傷的影響，對臨床上宮頸癌并發(fā)慢性放射性腸損傷患者后續(xù)藥物治療方案的選擇具有重要意義。

慢性放射性腸損傷是一個復雜的病理過程，其中微血管損傷和異常血管生成被認為是其進展的重要原因［14］。然而，在放射性腸損傷的發(fā)生和發(fā)展過程中，血管生成是過度還是抑制存在爭議。Wu 等［15］的研究結果顯示，在慢性放射性腸損傷中，黏膜層和黏膜下層的血管抑素表達明顯增加，提示血管生成受損。筆者的研究結果表明，在放療后1年以上出現(xiàn)腸損傷患者的微血管計數(shù)高于放療后1年內出現(xiàn)腸損傷的患者，但其血管狹窄比例低于放療后1年內出現(xiàn)腸損傷的患者。這些結果提示，早期輻射誘導的炎癥和氧化應激可能導致微血管受損和狹窄。但在炎癥緩解后會出現(xiàn)新生的代償微血管。這些發(fā)現(xiàn)進一步支持了炎癥和血管化之間的病理聯(lián)系［16］。然而，其中的機制非常復雜，包括腸道菌群失調和代謝物增加后引發(fā)炎癥因子釋放，以及通過調控一系列免疫效應分子表達來動態(tài)影響輻射誘導的腸道損傷［17-18］。

既往研究已經表明，在化療性腸炎的組織病理中可以觀察到腸道微血栓形成［19］。此外，抗血管生成藥物也已被發(fā)現(xiàn)能引起血栓性微血管病變［20］。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，接受抗血管生成藥物治療的患者血管狹窄比例高于未接受該治療的患者，但其微血管計數(shù)明顯低于未接受抗血管生成藥物治療的患者。這提示抗血管生成藥物在抑制血管生成的同時可能增加血管損傷。由于血管完整性受損，底層膠質和膠原蛋白被暴露，導致出血或血栓形成，并進一步刺激炎癥反應［16］。這與筆者研究中發(fā)現(xiàn)的抗血管生成藥物治療組患者更明顯的潰瘍和炎癥相符。這些變化可能同時參與放射性腸損傷閉塞性血管病變的發(fā)展過程。目前，抗血管生成藥物主要用于癌癥治療，并且已經在潰瘍型結腸炎（ulcerative colitis，UC）模型［21］和炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者［22］中進行了研究，結果顯示抗血管生成藥物可能是UC 和IBD 的新治療選擇。有報道證實，貝伐珠單抗治療遺傳性出血性毛細血管擴張癥患者的慢性出血和貧血安全有效［23-24］。因此，可以推測抗血管生成藥物可能對減少出血并發(fā)癥有效。另外，一項薈萃分析結果顯示，貝伐珠單抗的出血風險與劑量和應用時間相關［25］。這個發(fā)現(xiàn)給予新的啟示，可以在劑量和時間窗口上進一步探索。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為一個關鍵的促血管生成因子，在平滑肌細胞和成纖維細胞中也有表達［26］，并在特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病機制中起著重要作用。目前已經有研究報道，抗VEGF 是特發(fā)性肺纖維化的廣譜治療選擇之一［27］。放射性纖維化主要由于上皮和內皮細胞損傷導致異常血管結構重建，以及成纖維細胞或肌成纖維細胞群體的擴張和激活，進而導致細胞外基質的異常積累和結構畸變［28］。筆者的研究結果顯示，接受抗血管生成藥物治療的患者纖維化程度輕于未接受抗血管生成藥物治療的患者，這是否與VEGF 存在相關性尚需進一步研究。

然而，紫杉類藥物化療組與無紫杉類藥物化療組之間，在慢性放射性腸損傷患者的病理指標統(tǒng)計結果方面，并未觀察到紫杉類藥物對腸道組織的明顯影響。此外，通過分析發(fā)現(xiàn)，慢性放射性腸損傷嚴重并發(fā)癥組的狹窄血管比例和潰瘍程度高于無嚴重并發(fā)癥組，這與接受抗血管生成藥物治療患者的病理特點部分一致。進一步的Cox 單因素分析結果顯示，宮頸癌分期［29］、直腸V60≥20%［30］和接受抗血管生成藥物治療是影響嚴重并發(fā)癥發(fā)生的因素。然而，多因素分析表明，抗血管生成藥物并非慢性放射性腸損傷患者發(fā)生嚴重并發(fā)癥的獨立危險因素。這可能與該研究為回顧性研究、患者之間均衡性不佳以及樣本量有限有關。

綜上，紫杉類藥物對宮頸癌慢性放射性腸損傷組織沒有明顯的影響?？寡苌伤幬锟杉又貙m頸癌慢性放射性腸損傷組織的血管狹窄、潰瘍和炎癥，但減輕了纖維化。具體的機制需要進一步探索。關于抗血管生成藥物在慢性放射性腸損傷嚴重并發(fā)癥危險因素的單因素和多因素分析結果不一致，提示該研究存在一定的局限性。因此需要更大樣本量的前瞻性臨床研究進一步驗證。