方 卉 李全利

2016年，美國牙髓病學(xué)者學(xué)會（American association of endodontist， AAE）將牙髓再生定義為：一種通過生物學(xué)手段替代受損牙齒結(jié)構(gòu)（如牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體、牙根結(jié)構(gòu)和細(xì)胞等）的治療方法。牙髓再生途徑可以分為兩類：一種是基于外源性干細(xì)胞移植技術(shù)的有細(xì)胞再生性牙髓治療，另一種是基于內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢技術(shù)的無細(xì)胞再生性牙髓治療［1］。 其中無細(xì)胞再生性牙髓治療是目前學(xué)者們認(rèn)為更有可能實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的再生方式［2］。它是通過誘導(dǎo)根尖周內(nèi)源性干細(xì)胞向根管內(nèi)遷移、增殖和分化，以實(shí)現(xiàn)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生。可能細(xì)胞來源包括牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells， DPSCs）、根尖乳頭干細(xì)胞（stem cells from apical papilla， SCAP） 和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BM-MSCs） 等［3］。

牙髓再生治療的成功除了需要干細(xì)胞的參與外，還離不開良好的根管系統(tǒng)感染控制。但是，近年來一系列的研究顯示，高濃度的根管消毒糊劑具有明顯的干細(xì)胞毒性，會影響牙髓再生中干細(xì)胞的存活及分化［4-5］。所以為了提升牙髓再生治療的成功率，臨床亟需尋找合適的根管消毒藥物濃度。本文將對牙髓再生治療中根管消毒糊劑的濃度研究現(xiàn)狀作一綜述，并介紹部分新型抗菌策略。

1 根管消毒糊劑的種類

牙髓再生治療中應(yīng)用最廣泛的根管消毒糊劑是Hoshino等［6-7］在1996年提出的三聯(lián)抗生素糊劑（triple antibiotic paste，TAP）。TAP 由甲硝唑，環(huán)丙沙星和米諾環(huán)素組成的混合物，能夠有效控制感染壞死的根管。但是由于米諾環(huán)素的存在會導(dǎo)致牙齒變色，所以又誕生了甲硝唑和環(huán)丙沙星組成的二聯(lián)抗生素糊劑（double antibiotic paste， DAP）［8］。此外，2012年Ruparel 在傳統(tǒng)三聯(lián)抗生素糊劑的基礎(chǔ)上提出使用頭孢克洛替代米諾環(huán)素，并證明其對SCAP 具有良好的生物相容性9］。此方案和后來提出的使用克林霉素替代米諾環(huán)素［10］方案均被稱為改良三聯(lián)抗生素糊劑（modified-triple antibiotic paste， mTAP）。另有一些其它研究報道使用Ca（OH）2作為血運(yùn)重建步驟中的根管消毒糊劑［11］，但是Ca（OH）2抗菌活性相對較弱，無法有效清除頑固性感染根管中的糞腸球菌。所以為了提高抗菌效果，2007年P(guān)allotta等提出將氫氧化鈣、甲硝唑及環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，簡稱為CMC（calcium hydroxide， metronidazole and ciprofloxacin）并證實(shí)CMC對糞腸球菌、金黃色葡萄球菌和脆弱擬桿菌的抗菌效果強(qiáng)于氫氧化鈣的單獨(dú)應(yīng)用［12］。

2 根管消毒糊劑濃度對干細(xì)胞的影響

2.1 TAP TAP 的干細(xì)胞毒性與其藥物濃度及作用時間有關(guān)［13-14］。2012年，Ruparel 等發(fā)現(xiàn)當(dāng)TAP 濃度為10～100 mg/mL時，SCAP 的細(xì)胞存活率＜20%；當(dāng)TAP 濃度為1 mg/mL 時細(xì)胞的存活率約為58%，且隨著藥物濃度的進(jìn)一步稀釋（0.1～1 mg/mL）細(xì)胞存活率呈現(xiàn)明顯上升趨勢［9］。2014年Labban 等［15］通過乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測法（LDH 檢測法）和細(xì)胞增殖比色法（WST-1 檢測法）對不同濃度TAP 的DPSCs 細(xì)胞毒性及細(xì)胞增殖影響進(jìn)行了評估；實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同濃度（5，2.5，2，1.51，1，0.5 和0.3 mg/mL）TAP 組中，當(dāng)TAP 濃度高達(dá)5 mg/mL 時會對DPSCs 產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性且造成細(xì)胞增殖率的顯著下降。Jamshidi 等［13］對不同濃度TAP 在不同時間點(diǎn)對SCAP 的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著TAP 濃度（0.1～100 mg/mL）上升和反應(yīng)時間（24 h、48 h 和72 h）延長，SCAP 細(xì)胞存活率呈現(xiàn)下降趨勢，反應(yīng)24 h 和48 h 時，10 mg/mL 和100 mg/mL TAP 組的SCAP 細(xì)胞存活率明顯低于對照組（P＜0.05）；在72 h 時，1、10 和100 mg/mL TAP 均導(dǎo)致SCAP 細(xì)胞存活率明顯下降。除此以外，最新研究還發(fā)現(xiàn)低濃度（0.1～0.8 mg/mL）TAP 也會對SCAP 活性及其牙源性分化潛能造成不利影響［16］，而此結(jié)論同目前AAE推薦使用的藥物濃度（1～5 mg/mL）相矛盾。所以究竟是否需要進(jìn)一步降低牙髓再生中TAP 藥物濃度仍需要更多實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

2.2 DAP 與TAP 相比較，DAP（甲硝唑+環(huán)丙沙星）的抗菌效果降低，無法消滅感染根管中的糞腸球菌［11］。但是，研究發(fā)現(xiàn)甲硝唑和阿莫西林組成的DAP 對糞腸球菌的抗菌效果和TAP 相似。可能原因是阿莫西林作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，而環(huán)丙沙星是通過抑制DNA 的合成在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，所以前者可能比后者具有更強(qiáng)更快的殺菌作用［17］。

DAP 的干細(xì)胞毒性與TAP 相似，具有濃度相關(guān)性。Ruparel等［9］證明DAP 以劑量依賴性的形式引起SCAP 活力降低，并且當(dāng)濃度低于0.1 mg/mL 時對細(xì)胞活力沒有副作用。Jamshidi 在2021年的研究中指出當(dāng)DAP 濃度≤1 mg/mL 時對SCAP 的存活沒有顯著負(fù)面影響，而相同濃度下TAP 比DAP 具有更高的細(xì)胞毒性［13］。2022年的最新研究發(fā)現(xiàn)低濃度（0.1～0.8 mg/mL）DAP對SCAP 活性及其牙源性分化潛能無不利影響［16］。甚至有學(xué)者證明低濃度抗菌藥物可能對細(xì)胞生長和增殖發(fā)揮積極影響。Khoshkhounejad 等［18］分別對7 μg/mL（最小抑菌濃度）、31 μg/mL（最小殺菌濃度）和156 μg/mL（最小生物膜抑制濃度）DAP 的干細(xì)胞毒性展開研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度DAP 對SCAP 具有增殖促進(jìn)作用。 所以未來對于DAP 在牙髓再生中研究可能更傾向于在保證其細(xì)胞相容性的同時提升DAP 藥物濃度，實(shí)現(xiàn)其抗菌性和細(xì)胞相容性的兼顧。

2.3 mTAP mTAP 是針對傳統(tǒng)TAP 中米諾環(huán)素導(dǎo)致牙體變色問題而衍生出的一種改良三聯(lián)抗生素糊劑。Rahhal 等［19］分析了250、500 和1 000 μg/mL 三個濃度mTAP 對SCAP 的影響，發(fā)現(xiàn)所有濃度的mTAP 均導(dǎo)致細(xì)胞活性和分化潛能不同程度降低。其中250 μg/mL mTAP 組的細(xì)胞存活率最高（71.56%）。Ruparel等也證實(shí)100 μg/mL mTAP 對SCAP 沒有細(xì)胞毒性［9］。除此以外，Saberi 等在2019年還研究了mTAP（頭孢克洛）與氯己定混合后對SCAP 的細(xì)胞毒性影響，他們發(fā)現(xiàn)與氫氧化鈣組對比，mTAP（0.125～10 mg/mL）組細(xì)胞存活最低，且在與氯己定混合后細(xì)胞毒性顯著增加。TBE（Trypan Blue）和MTT 檢測結(jié)果顯示在使用濃度＞5 mg/mL mTAP 作為根管內(nèi)封藥時，無論是何種媒介都會造成細(xì)胞存活率下降至20% 以下［20］。所以，目前AAE 推薦在牙髓再生治療中使用1～5 mg/mL 濃度的mTAP 作為根管內(nèi)消毒藥物。

2.4 氫氧化鈣 Ca（OH）2是臨床上最常用的一種根管消毒藥物，它的抗菌活性依賴于與細(xì)菌的直接接觸。Ca（OH）2對糞腸球菌和白色念珠菌的抗菌效果較差。但是有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將Ca（OH）2基化合物顆粒添加到更復(fù)雜的配方中時，它的抗菌活性得到了提升，如商品化的UltraCal 糊劑（Ultradent Products，Inc.， South Jordan， UT， USA）已經(jīng)被證實(shí)具有與TAP 一樣的殺菌能力［17］。除此以外，近期還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)將水楊酸和氫氧化鈣混合后不僅能夠提高其抗菌性能還對DPSCs 細(xì)胞活性無影響［21］。

與TAP、DAP 以及mTAP 相比較，相同濃度的Ca（OH）2對干細(xì)胞的不良影響最低［9，13，22］。Labban 等［22］發(fā)現(xiàn)Ca（OH）2對DPSCs 無細(xì)胞毒性的最高濃度是2.5 mg/mL。Jamshidi 等［13］發(fā)現(xiàn)Ca（OH）2在任何濃度（0.1、0.5、1 和10 mg/mL）以及時間點(diǎn)（24、48、72 h）對SCAP 都不具有細(xì)胞及基因毒性，并且在濃度為1 mg/mL 時能有效促進(jìn)細(xì)胞增殖。原因可能是低濃度Ca（OH）2上調(diào)磷酸化細(xì)胞外信號相關(guān)激酶，而這正是牙髓細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的一個增殖標(biāo)記。Selis 甚至提出Ca（OH）2作為臨床牙髓學(xué)根管內(nèi)用藥的金標(biāo)準(zhǔn)［23］。

3 新型根管抗菌策略

牙髓再生是一項(xiàng)以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療方法，控制根管感染與創(chuàng)造干細(xì)胞再生所需微環(huán)境至關(guān)重要［24］。雖然目前臨床上提倡使用低濃度的根管消毒糊劑，但其是否實(shí)現(xiàn)了生物相容性消毒與牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體可預(yù)測性再生的完美結(jié)合仍具有爭議。因此，部分學(xué)者仍致力于探尋新型抗菌策略，其中就包括天然抗菌材料和人工合成抗菌材料。

3.1 天然抗菌材料

3.1.1 蜂膠 蜂膠不僅具有廣譜抗菌活性［25］，還具有抗氧化、抗齲壞和抗炎的特性［26］。早在2011年開始蜂膠樹脂材料就被提倡作為漱口水［27］、牙膏［28］的天然添加成分。研究還發(fā)現(xiàn)，蜂膠可以預(yù)防齲齒、菌斑形成［29］，可以作為牙齒撕脫后的細(xì)胞保存介質(zhì)［30］以及牙髓暴露的處理劑［31］。2023年一篇系統(tǒng)性綜述對蜂膠的抗糞腸球菌性能進(jìn)行了分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜂膠作為根管內(nèi)用藥時表現(xiàn)出比Ca（OH）2更強(qiáng)的抗糞腸球菌效果［33］。關(guān)于蜂膠在牙髓再生治療中的效果，有報道指出濃度≤4 mg/mL 的蜂膠對牙髓及牙周膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性比Ca（OH）2至少低10倍［32］。當(dāng)在動物體內(nèi)牙髓再生研究中使用蜂膠作為根管內(nèi)封藥時，其帶來的軟硬組織沉積效果與TAP 相似，甚至優(yōu)于TAP結(jié)果［34］。

3.1.2 殼聚糖基顆粒 殼聚糖是一種陽離子天然無毒化合物，目前已經(jīng)被廣泛用作藥物載體，具有良好的生物相容性、降解性及無毒性。一項(xiàng)研究中使用殼聚糖作為TAP 和Ca（OH）2顆粒的載體，當(dāng)與使用生理鹽水作為載體相比較時，發(fā)現(xiàn)殼聚糖基化合物的抗菌效果明顯高于后者［35］。而這一發(fā)現(xiàn)可以通過殼聚糖分子固有的可能抗菌作用機(jī)制來解釋。因?yàn)闅ぞ厶侵袔д姷陌被咸烟荖H3+可能與帶負(fù)電的細(xì)菌表面成分相互作用，繼而改變細(xì)胞通透性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Ducret 等人在體外實(shí)驗(yàn)中使用新型富含殼聚糖的纖維蛋白水凝膠，發(fā)現(xiàn)殼聚糖的加入更有利于促進(jìn)人牙髓組織再生，并且對牙髓細(xì)胞的形態(tài)、活力、增殖以及膠原基質(zhì)的產(chǎn)生無有害影響［36］。

3.1.3 石墨烯基材料 石墨烯是近年來發(fā)展起來的，一種由碳原子緊密堆積成的單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的新型材料。因其獨(dú)特的機(jī)械性能、電化學(xué)物理性質(zhì)（如機(jī)械強(qiáng)度、高比表面積、熱穩(wěn)定性及獨(dú)特的表面特性）以及抗菌性能而具有廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值［37-39］。尤其是在組織工程方面，它不但表現(xiàn)出良好的生物相容性，還能夠促進(jìn)和維持干細(xì)胞生長及分化［40］。為了研究石墨烯對牙髓組織再生的影響，Rosa 等［41］對DPSCs 在氧化石墨烯基基底上的增殖和分化潛能展開了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯基組的DPSCs 表現(xiàn)出細(xì)胞牙源性基因表達(dá)上調(diào)。除此以外，近年來為了增強(qiáng)根管消毒能力，還在氧化石墨烯基質(zhì)上合成出了AgNPs 并證實(shí)其在抗菌活性及破壞生物膜方面都具有理想效果［42］。

3.2 人工合成抗菌材料

3.2.1 生物活性玻璃 生物活性玻璃是一種表面活性材料，具有促軟、硬組織再生的能力［43］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，迄今為止，至少有25 種生物活性玻璃已被批準(zhǔn)用于臨床，其用途之廣涉及骨空隙充填，牙本質(zhì)過敏，傷口敷料以及癌癥治療等［44］。其中納米生物活性玻璃因其獨(dú)特的理化性能（比表面積大，生物降解能力快，生物活性離子釋放快）以及卓越的生物活性更是引起牙齒組織再生研究的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)納米生物活性玻璃能夠募集干細(xì)胞向牙本質(zhì)遷移并促進(jìn)細(xì)胞附著、牙源性分化，最終形成牙髓-牙本質(zhì)樣組織［45］。除此以外，生物活性玻璃還可以通過添加抗菌劑和再生制劑來實(shí)現(xiàn)功能化，如一項(xiàng)研究成功合成了Ag-MBGs，并對其根管內(nèi)抗生物膜活性進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)Ag-MBGs 通過銀離子的釋放對糞腸球菌具有良好的抗菌效果［17］。而Ag-MBGs 對牙髓再生治療中干細(xì)胞的影響尚需進(jìn)一步研究。

3.2.2 抗生素洗脫納米纖維 近年來，通過靜電紡絲技術(shù)，牙科領(lǐng)域已成功建立出含抗生素的納米纖維藥物遞送系統(tǒng)［17］。電紡納米纖維作為低濃度抗生素緩釋的載體能創(chuàng)造出更有利于組織再生的無菌環(huán)境。Bottino 等人在近期一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建出3D管狀TAP 洗脫納米纖維，并證實(shí)其能夠很好的適應(yīng)根管形態(tài)，實(shí)現(xiàn)良好的感染控制以及促根尖愈合［46］。

4 小結(jié)與展望

目前，臨床上用于牙髓再生治療的根管消毒糊劑主要是三聯(lián)抗生素糊劑、二聯(lián)抗生素糊劑和氫氧化鈣糊劑。雖然高濃度的抗生素組合糊劑表現(xiàn)出較強(qiáng)的根管消毒能力，但同時也帶來了干細(xì)胞細(xì)胞毒性影響，所以AAE 更推薦使用低濃度（1～5 mg/mL）抗生素作為牙髓再生根管內(nèi)封藥。但也有研究發(fā)現(xiàn)即使是AAE 推薦的低濃度TAP 依然具有細(xì)胞毒性［16］，所以仍需更多研究確定其結(jié)論的準(zhǔn)確性。氫氧化鈣糊劑對某些細(xì)菌的抗菌效果雖然不如抗生素糊劑，但其對干細(xì)胞的毒性較低，能促進(jìn)牙本質(zhì)中重要的生物活性生長因子釋放，增強(qiáng)干細(xì)胞存活和增殖能力，所以近年來也被提倡應(yīng)用。

然而，因?yàn)槟壳把浪柙偕委熤?，根管消毒藥物濃度對根尖乳頭干細(xì)胞的毒性影響的體外研究一直局限于生理?xiàng)l件下，沒有考慮到細(xì)胞在接觸抗菌藥物之前可能已經(jīng)處于被細(xì)菌副產(chǎn)物刺激的激活狀態(tài)。細(xì)菌的副產(chǎn)物，如脂多糖、脂磷壁酸，能夠激活殘余細(xì)胞導(dǎo)致炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，這激活的免疫反應(yīng)又會對根尖乳頭干細(xì)胞的藥物毒性反應(yīng)產(chǎn)生影響。如2019年Sipert 等［47］研究就發(fā)現(xiàn)，改良的環(huán)丙沙星、甲硝唑、氫氧化鈣混合物對人類根尖乳頭干細(xì)胞沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，但在糞腸鏈球菌的副產(chǎn)物—脂磷壁酸預(yù)處理后卻表現(xiàn)出了細(xì)胞毒性。因此，在今后的牙科材料細(xì)胞毒性測試研究中，我們有必要強(qiáng)調(diào)考慮細(xì)胞微環(huán)境的重要性。

另一方面，為了避免傳統(tǒng)根管消毒藥物對牙髓再生帶來的不利影響，大量新型根管抗菌策略相繼出現(xiàn)。它們雖然表現(xiàn)出良好的生物相容性根管消毒能力，但仍缺乏精心設(shè)計(jì)的體外和體內(nèi)研究，尤其是隨機(jī)臨床試驗(yàn)。所以在尋找牙髓再生治療成功的道路上，我們依然是任重而道遠(yuǎn)。