張 鄭,譚景藍(lán),羅慶華

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院精神科,重慶 400016)

注意缺陷與多動障礙(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)是最常見的兒童神經(jīng)發(fā)育障礙之一,其特點(diǎn)是持續(xù)注意力不集中、難以控制沖動行為或過度活躍,常發(fā)病于7～12歲,男孩的發(fā)病率是女孩的3倍,影響著世界5%～7%的兒童[1]。與其他精神疾病相同,遺傳因素發(fā)揮了重要的病因作用,但其他外部環(huán)境因素,如懷孕期間接觸酒精、煙草或毒素、情緒障礙、早產(chǎn)、低出生體重和產(chǎn)前或產(chǎn)后腦損傷等也被證明是ADHD的致病原因[2]。

Omega-3多不飽和脂肪酸(Omega-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)在大腦功能和神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及髓鞘和視網(wǎng)膜的發(fā)育中發(fā)揮著核心作用[3],特別是二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)構(gòu)成了人類大腦中90%的n-3PUFAs和總脂質(zhì)的10%～20%[4],對母嬰健康有許多積極的影響[5],其主要是通過食用富含脂肪的魚類和其他海鮮攝入。有研究表明,ADHD患兒血清中DHA和n-3PUFAs水平較正常對照組低[6]。還有研究發(fā)現(xiàn),較高的DHA攝入量可以降低精神分裂癥、雙相情感障礙、抑郁、焦慮和行為障礙的風(fēng)險,而較低的DHA水平似乎是精神疾病的潛在風(fēng)險因素[7]。此外,DHA對于神經(jīng)發(fā)育的改善,尤其是認(rèn)知功能的改善仍存在爭議,需要進(jìn)一步證明[8]。

觀察性研究因難以準(zhǔn)確考慮所有的混雜因素,很容易受到混雜偏倚的影響。相比之下,孟德爾隨機(jī)化(mendelian randomization,MR)分析將遺傳變異作為工具變量,規(guī)避了混雜因素或反向因果關(guān)系的影響,并可用于研究影響人群健康的風(fēng)險因素[9]。目前還沒有研究采用MR方法來探究DHA對ADHD發(fā)病風(fēng)險是否存在因果效應(yīng),或ADHD和DHA水平的因果關(guān)系?；诖?本研究設(shè)計并完成了一項(xiàng)雙向MR分析,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

表1 MR研究中GWAS數(shù)據(jù)庫的簡要信息

1.2 方法

1.2.1MR研究3個假設(shè)

SNP作為代理表型的遺傳工具變量(instrumental variables,IVs)被用來進(jìn)行雙樣本MR研究。所篩選的SNP應(yīng)滿足MR的3個主要假設(shè):(1)假設(shè)一,工具變量應(yīng)與相應(yīng)的表型具有強(qiáng)相關(guān);(2)假設(shè)二,工具變量不受與結(jié)局有關(guān)聯(lián)的潛在混雜因素的影響;(3)假設(shè)三,工具變量和結(jié)果之間沒有直接關(guān)系[9]。通過MR分析來評估DHA與ADHD之間的雙向因果關(guān)系,流程見圖1。

實(shí)線箭頭線:MR分析流程,且只能通過暴露影響結(jié)局;虛線箭頭:違背MR 3個假設(shè)的影響路徑。

1.2.2工具變量的選擇

所選用于代理DHA工具變量的SNP均滿足全基因組統(tǒng)計顯著性閾值(P<5×10-8),以滿足假設(shè)一,為了獲得獨(dú)立的SNP,進(jìn)行了去連鎖不平衡LD(r2<0.001,kb=10 000)[13]。為了進(jìn)一步評價工具變量強(qiáng)度(R2),計算了每個SNP的F統(tǒng)計量,其中F<10(視為弱工具變量)的工具變量被剔除[14],具體計算公式如下:

F=[(N-k-1)/k]×[R2/(1-R2)][15]

①

R2通過以下公式計算得來:

R2=2×(1-MAF)×MAF×(β/SD)2[16-17]

②

公式中的N代表所選取數(shù)據(jù)集的樣本量,k是選擇用于MR分析的SNP總數(shù),MAF是次要等位基因頻率,β是SNP對DHA的效應(yīng)估計值,SD是β的標(biāo)準(zhǔn)差。

此外,進(jìn)行反向MR分析,以驗(yàn)證ADHD對DHA是否存在因果關(guān)系。同樣從數(shù)據(jù)集中篩選了全基因組顯著(P<5×10-8)和獨(dú)立遺傳(r2<0.001)且無LD的SNP,通過上述標(biāo)準(zhǔn)篩選的SNP用作MR分析的最終工具變量。

1.2.3去除混雜和回文SNP

為了滿足MR假設(shè)二,在PhenoScannerV2數(shù)據(jù)庫(http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/)評估了每個SNP及其相關(guān)表型,并在r2>0.80的閾值上剔除了與ADHD相關(guān)性狀的SNP[18-19]。通過上述選擇的SNP去除具有中間等位基因頻率的所有回文SNP來協(xié)調(diào)DHA和ADHD的數(shù)據(jù)[20],回文SNP定義為具有A/T或G/C等位基因的SNP,且中間等位基因頻率為0.01～0.30[21]。

實(shí)驗(yàn)組學(xué)生和教師任務(wù)分解。學(xué)生任務(wù)：（1）小組學(xué)習(xí)：學(xué)生按5～6人組成學(xué)習(xí)小組，學(xué)習(xí)內(nèi)容分為熱點(diǎn)問題和案例學(xué)習(xí)兩部分。課外每名學(xué)生根據(jù)發(fā)放材料進(jìn)行文獻(xiàn)收集、閱讀、思考，然后開展小組討論，達(dá)成小組共識，重新組織內(nèi)容，為課堂展示做準(zhǔn)備。（2）學(xué)生課堂：以小組為單位，進(jìn)行學(xué)習(xí)內(nèi)容講解，同時回答其他組的提問。其中熱點(diǎn)問題6學(xué)時，案例學(xué)習(xí)6學(xué)時，學(xué)習(xí)成果、學(xué)習(xí)經(jīng)驗(yàn)分享2學(xué)時。（3）課外訓(xùn)練：利用第二課堂，以小組為單位開展社會實(shí)踐活動。學(xué)生以問卷形式開展社區(qū)、養(yǎng)老機(jī)構(gòu)老年健康需求調(diào)查，或應(yīng)用所學(xué)知識、技能開展老年慢性病健康教育、護(hù)理服務(wù)活動。

1.2.4效應(yīng)統(tǒng)計和敏感性分析

采用逆方差加權(quán)法(inverse-varianceweighted,IVW)作為主要的統(tǒng)計分析方法,該方法通過應(yīng)用Wald比率結(jié)合了SNP特異性估計,通過meta分析法綜合了DHA對ADHD的匯總因果效應(yīng)[22]。并使用了加權(quán)中位數(shù)法(weighted median,WM)、MR-Egger回歸和MR多效性殘差和離群值(MR-PRESSO)模型作為補(bǔ)充分析方法。MR-Egger截距的P值用于指示定向多效性,MR-PRESSO法用于檢測并去除異常值后再生成估計值,以區(qū)分去除異常值前后估計值之間的差異[23]。此外,使用Cochran’sQ值來表示DHA所用的工具變量之間的異質(zhì)性[24]。此后,在反向MR分析中使用與上述相同的MR方法。用效應(yīng)指標(biāo)優(yōu)勢比(odds ratio,OR)和95%CI報告效應(yīng)估計值,若OR>1,說明暴露對結(jié)局可能是一個危險因素,增加了該結(jié)局發(fā)生的可能性;若OR>0～<1,則說明暴露對結(jié)局存在潛在保護(hù)作用。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用R4.1.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正向MR分析

經(jīng)過上述篩選標(biāo)準(zhǔn)(P<5×10-8,r2<0.001,F>10),并排除與結(jié)局存在潛在關(guān)聯(lián)的混雜因素后,共納入37個SNP作為DHA的工具變量。分別與ADHD1、ADHD2數(shù)據(jù)集進(jìn)行同方向糾正,并剔除回文SNP后確定了兩組工具變量,包括19個來自PGC2019和15個來自PGC2022的SNP,且篩選出的SNP具有較強(qiáng)的統(tǒng)計強(qiáng)度,F為398.1～441.5,超過了常規(guī)閾值10,見表2。

表2 基于IVW模型的DHA對ADHD風(fēng)險的因果效應(yīng)

IVW結(jié)果顯示,DHA對ADHD存在潛在因果效應(yīng),兩組MR分析結(jié)果均說明DHA是ADHD的潛在保護(hù)因素;此外,WM分析也得出了一致的結(jié)論,但結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。然而,在PGC2019數(shù)據(jù)集中MR-Egger方法得到了相反的結(jié)論,但結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

A:ADHD1與DHA水平分析;B:ADHD2與DHA水平分析;水平X軸:DHA遺傳效應(yīng);垂直Y軸:ADHD遺傳效應(yīng);黑點(diǎn):MR分析中使用的SNP;由于IVW和WM在分析中估計值相似,圖片視覺上顯示重疊。

表3 基于3種MR方法的DHA與ADHD風(fēng)險因果關(guān)系

2.2 反向MR分析

在滿足上述閾值(P<5×10-8,r2<0.001,F>10)下,來自PGC2019數(shù)據(jù)集的ADHD1未找到足夠的SNP,因此反向MR共納入了來自PGC2022數(shù)據(jù)集的27個SNP作為ADHD的工具變量,與DHA數(shù)據(jù)集進(jìn)行同方向糾正,并剔除回文SNP后確定20個SNP,結(jié)果顯示ADHD對DHA存在潛在因果效應(yīng),IVW和WM提示ADHD患者體內(nèi)DHA水平低于健康人群(P<0.05),見表4。此外,MR-Egger分析也得出了一致的結(jié)論,但結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

水平X軸:ADHD遺傳效應(yīng);垂直Y軸:DHA遺傳效應(yīng);黑點(diǎn):MR分析中使用的SNP;由于IVW和WM在分析中估計值相似,圖片視覺上顯示重疊。

表4 基于3種MR方法的ADHD與DHA風(fēng)險因果關(guān)系

2.3 敏感性與多效性分析

正向MR分析中,MR-Egger未顯示任何多效性(P>0.05);對于反向MR分析,MR-Egger也未顯示存在任何多效性(P>0.05)。使用Cochran’sQ檢驗(yàn)評估每個數(shù)據(jù)集內(nèi)部異質(zhì)性,檢驗(yàn)數(shù)據(jù)集內(nèi)無明顯的異質(zhì)性證據(jù)(P>0.05)。此外,還進(jìn)行了MR-PRESSO檢驗(yàn),得到一致結(jié)果,均未發(fā)現(xiàn)存在定向多效性和離群SNP,見表5。

表5 敏感性分析結(jié)果的總結(jié)

3 討 論

本研究從遺傳角度發(fā)現(xiàn)DHA和ADHD存在雙向因果關(guān)聯(lián),為ADHD的早期預(yù)防提供了依據(jù),有助于為孕產(chǎn)婦飲食攝入提供指導(dǎo),以降低ADHD的發(fā)病風(fēng)險。

正向MR分析結(jié)果顯示,DHA是ADHD發(fā)病的潛在保護(hù)因素。有研究表明,DHA在妊娠晚期至兒童2歲時被迅速融入視網(wǎng)膜和腦神經(jīng)組織中[25],由于胎兒DHA的自主合成較低,母體DHA的攝入和胎盤的轉(zhuǎn)運(yùn)功能對胎兒獲取DHA至關(guān)重要[26]。存在多項(xiàng)流行病學(xué)證據(jù)表明DHA水平與注意力呈正相關(guān),與ADHD的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[27],而DHA補(bǔ)充劑有助于改善7～14歲兒童的心理社會功能、注意力集中及情緒問題[28]。此外,產(chǎn)前補(bǔ)充DHA同樣有益于學(xué)齡前兒童的注意力和執(zhí)行能力[29],尤其是早產(chǎn)兒[30],這與本研究結(jié)果一致。有學(xué)者認(rèn)為,這可能是因胎兒較低的DHA水平導(dǎo)致腦白質(zhì)完整性缺陷和額底神經(jīng)膠質(zhì)回路的功能連接降低,進(jìn)而增加兒童患ADHD癥狀的風(fēng)險[31]。還有研究表明,DHA可能通過抑制核因子-κB活性,促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)的活性,進(jìn)而起到抗炎作用來控制ADHD癥狀[32]。目前來說,DHA影響ADHD的具體機(jī)制尚不明確,其可能還與皮層多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的改變[25]及腦-腸軸有關(guān)[33]。

反向MR分析結(jié)果顯示,ADHD患者具有較低的DHA水平,這與既往研究[34]結(jié)論一致,ADHD兒童在紅細(xì)胞膜上呈現(xiàn)獨(dú)特的脂肪酸譜,DHA水平明顯低于健康兒童。

本研究優(yōu)勢在于使用MR來研究DHA與ADHD之間的雙向因果效應(yīng),由于遺傳信息在時間順序上先于出生后環(huán)境因素的暴露,故而避免了觀察性研究中混雜因素帶來的偏倚,相比于隨機(jī)對照試驗(yàn)的成本和倫理問題,更高效地探討了二者的因果關(guān)系。當(dāng)然,本研究也存在一定的局限性,研究對象為歐洲人群,其他種族能否得出相同的結(jié)論有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究基于雙向MR,利用遺傳數(shù)據(jù)進(jìn)行了DHA與ADHD的雙向因果推斷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHA水平對ADHD的發(fā)病存在潛在保護(hù)作用,同時ADHD患兒具有較低的DHA水平。但二者之間具體的作用機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步研究。