程慧濤，戴遠(yuǎn)棠，阮炘賀，李育森，李麗華，段旭琢，單金紅，賈弦澤，徐 斌，王 慶，2，趙會宏，2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642；2.廣州南沙華農(nóng)漁業(yè)研究院，廣州 511458；3.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣州 511434；4.廣東東源縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，廣東河源 517500)

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)屬擬鰲蝦科滑螯蝦屬[1]，原產(chǎn)于澳大利亞北部[2]，屬于熱帶淡水小龍蝦[3]，也被稱為澳洲淡水龍蝦，因其個體大，出肉率高，肉質(zhì)鮮美，并且具有廣泛的環(huán)境忍耐力，在pH 5.8～8.2、溫度5～37 ℃、溶氧量不低于1.5 mg/L的水體中都能生存，這也使得紅螯螯蝦在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有很大的潛力[4-6]，是世界上最有價值的經(jīng)濟(jì)淡水甲殼動物之一[7，8]。20世紀(jì)90年代紅螯螯蝦首次引進(jìn)中國，目前主要在我國南方地區(qū)養(yǎng)殖[3]，市場歡迎度很高[9]。

物種的遺傳多樣性會因?yàn)榻H繁殖和遺傳漂變而降低，使物種喪失環(huán)境適應(yīng)能力和降低物種的抗病力，所以物種高水平的遺傳多樣性就顯得非常重要[10]。對不同地區(qū)的紅螯螯蝦養(yǎng)殖品種進(jìn)行遺傳分析可為該物種的遺傳資源保護(hù)提供依據(jù)[3，11]?；蚪M中由1到6個堿基對長單元組成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列被稱為微衛(wèi)星[10]，具有中性、共顯性、高度的多態(tài)性和跨基因組的隨機(jī)分布等特性[12-14]。目前，微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)被用來分析羊、蛇、蟹、蝦和魚等物種的遺傳分析[12，15-17]。

紅螯螯蝦作為十足目甲殼類動物，通常只會顯示出低水平的等位酶變異[9，18]，而對于一些表現(xiàn)出較低的等位酶變異的物種而言，核基因組中的微衛(wèi)星位點(diǎn)已經(jīng)被證明對于記錄類似物種的遺傳多樣性具有重要作用[19]。為了解不同地區(qū)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，本研究基于本實(shí)驗(yàn)室先前轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，選取篩選了8個微衛(wèi)星位點(diǎn)，對中國不同地區(qū)(廣東省湛江市、廣東省佛山市、廣東省惠州市、廣西自治區(qū)南寧市、浙江省湖州市)的5個紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為后續(xù)紅螯螯蝦群體遺傳多樣性研究及相關(guān)育種工作提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的紅螯螯蝦群體分別來自廣東省湛江市(GDZJ)、廣東省佛山市(GDFS)、廣東省惠州市(GDHZ)和廣西自治區(qū)南寧市(GXNN)，從當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶購買，浙江省湖州市(ZJHZ)購自于浙江水產(chǎn)研究所。每個群體30尾，。取背部適量的肌肉樣品共150份，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用基因組DNA提取試劑盒(北京金沙生物技術(shù)有限公司)提取樣品DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，微量分光光度計(jì)測其濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物篩選

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室開展紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組測序得到SSR序列，使用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，合成時正向引物F的5’端加上通用Tag的16個堿基的引物序列，第一次擴(kuò)增DNA時片段就多帶一段Tag序列。第二輪篩選擴(kuò)增條帶理想的PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光引物PCR，所用引物是Tag修飾引物和各自對應(yīng)的反向R引物。用Tag的修飾引物，帶Tag序列的F引物，R引物共3條引物可以一起多重?cái)U(kuò)增達(dá)到目的，最后擴(kuò)增良好的熒光PCR產(chǎn)物用3730xl測序儀進(jìn)行檢測，得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行Genemapper軟件分析，判斷不同引物是否具體片段多態(tài)性，最后獲得8對符合條件的引物(表1)。

表1 8對微衛(wèi)星引物信息Tab.1 Information of eight pairs of microsatellite primers

1.2.3 PCR擴(kuò)增

用合成的引物的不同引物進(jìn)行擴(kuò)增，以擎科金牌Mix(green)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL：金牌Mix(green) 17 μL、10 μmol/L Primer F(加接頭)1 μL、10 μmol/L Primer R 1 μL、Template(gDNA)1 mL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃ 10 s、各引物特異性退火溫度(表1)10 s、72 ℃ 10 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。最后擴(kuò)增良好的熒光PCR產(chǎn)物用3730xl測序儀進(jìn)行檢測，得到的數(shù)據(jù)使用Genemapper軟件分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

SSR位點(diǎn)和種群的各項(xiàng)遺傳多樣性指標(biāo)分別在Popgen32[20]中計(jì)算，包括觀察到的等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、香農(nóng)指數(shù)(I)、多態(tài)性信息指數(shù)(PIC)、哈迪溫伯格平衡(PHWE)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和等位基因豐富度(Ar)。用FSTAT[10]軟件計(jì)算近親繁殖系數(shù)(Fis)和遺傳分化指數(shù)(Fst)。本實(shí)驗(yàn)的種群遺傳結(jié)構(gòu)是基于STRUCTURE 2.3.3版軟件中的貝葉斯模型的種群聚類方法。采用馬爾科夫鏈(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)方法使用預(yù)先設(shè)定的種群分組(K)，同時根據(jù)等位基因頻率對個體進(jìn)行計(jì)算、抽樣和分組。K值被設(shè)定為5，對每個K值進(jìn)行10次獨(dú)立運(yùn)行，每個周期的重復(fù)采樣次數(shù)被設(shè)定為100 000。最后，根據(jù)EVANNO等[21]的方法，在STRUCTURE HARVESTER網(wǎng)站上計(jì)算出最佳K值。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性

由表2可知，8個微衛(wèi)星位點(diǎn)Na數(shù)范圍在3～12，平均為8.125 0。Ne范圍為1.466 4～4.781 1。I的范圍為0.561 1～1.823 4。Ho和He的范圍分別為0.095 9～0.758 4和0.319 1～0.793 5，均值分別為0.490 6和0.622 1。多態(tài)信息含量的數(shù)值范圍為0.280 5～0.764 5，平均值0.590 1，8對引物PIC>0.25，具有較高的多態(tài)信息。綜上，本實(shí)驗(yàn)所開發(fā)的8對SSR引物的多態(tài)性較高。

表2 8對微衛(wèi)星引物的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters at ten microsatellite loci

5個群體在8個微衛(wèi)星位點(diǎn)確定了237個Na(表3)，Na數(shù)范圍為2～10，平均為6.05。Ho和He平均值分別為0.490和0.614。每組的Na數(shù)在6.000(GXNN)～6.625(GDFS)。所有種群間觀察到的Ar數(shù)量無明顯差異，Ar平均值在2.788(ZJHZ)～3.205(GDZJ)。所有群體中平均He在0.593(GDHZ)～0.646(GDZJ)。綜上可以看出遺傳多樣性并未顯著降低。此外，養(yǎng)殖種群的近交系數(shù)(Fis)表明GXNN(0.263)、ZJHZ(0.264)這2個地區(qū)的養(yǎng)殖群體比GDHZ(0.155)、GDZJ(0.226)、GDFS(0.158)這3地區(qū)的群體分化更嚴(yán)重。

表3 5個紅螯螯蝦群體在8個微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)Tab.3 Genetic diversity parameters at eight microsatellite loci among five populations of C.quadricarinatus

2.2 遺傳分化分析

群體間分化程度的指標(biāo)常用Fst和P值量化不同種群間遺傳分化程度(表4)。從結(jié)果中可知，GXNN、GDHZ、GDFS 3個種群相似度最高，ZJHZ和GDZJ最低；并且GXNN、GDHZ、GDFS之間基本沒有遺傳分化，ZJHZ和GDZJ之間存在中等程度的遺傳分化。從分子方差分析(AMOVA)結(jié)果可知(表4)，種群內(nèi)遺傳變異較大，占變異總量的98%，種群間的遺傳變異僅占2%，可以看出遺傳變異主要來自種群內(nèi)。在STRUCTURE(2.3.3版本)軟件中基于貝葉斯模型的群體聚類方法，得到最適delta K值為5(圖1)，表明5個聚類是最可能的種群結(jié)構(gòu)。由圖2可知，5個養(yǎng)殖群體表現(xiàn)明顯的差異，說明這5個種群具有明顯的遺傳結(jié)構(gòu)。

圖1 STRUCTURE分析的ΔK方法繪制的K值變動圖Fig.1 K value change diagram drawn by ΔK method of STRUCTURE analysis

圖2 K=5時150個樣品的STRUCTURE結(jié)果Fig.2 The STRUCTURE results of 150 samples when K=5

表4 群體間的Fst值(下三角)和P值(上三角)Tab.4 Fst value(lower triangle) and P value(upper triangle)

表5 5個種群間AMOVA分析Tab.5 AMOVA analysis of microsatellites among five cultured populations

3 討論

3.1 SSR位點(diǎn)多態(tài)性的意義

本研究開發(fā)了8個新的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，用于分析廣東湛江、廣東惠州、廣東佛山、廣西南寧、浙江湖州5個地區(qū)不同養(yǎng)殖群體之間的遺傳關(guān)系。所有微衛(wèi)星Na數(shù)范圍在3～12，平均值為8.125，與金玲等[22]研究結(jié)果相似。I的數(shù)值范圍為0.561 1～1.823 4。Ho和He的范圍分別為0.095 9～0.758 4和0.319 1～0.793 5，均值分別為0.490 6和0.622 1。8個微衛(wèi)星位點(diǎn)都具有高水平的多態(tài)性(PIC>0.25)，而PIC、Ho、He能夠反映群體中個體的遺傳變異程度，其中PIC是衡量微衛(wèi)星多態(tài)性的一個指標(biāo)，根據(jù)BOTSTEIN等[23]的方法界定衡量基因變異程度高低：當(dāng)PIC>0.5時，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；0.25

3.2 SSR位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性

8個微衛(wèi)星位點(diǎn)在150個個體中的Na數(shù)在2～10之間變化，平均值為6.05，與甲殼動物Na較少的結(jié)論是一致的[24]。該結(jié)果與一些水生動物相似，如戴氏裸玉褶魚(Hypoptychusdybowskii)[25]和斑鱖(Sinipercascherzeri)[26]。在5個養(yǎng)殖群體中，平均Na及He分別為6.05和0.614，與BIAN等[27]關(guān)于紅螯螯蝦的結(jié)果相近。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H0范圍在0.143～0.833，平均值為0.49，與澳洲野生紅螯螯蝦群體(H0：0.35～0.71)相比差距較小。而雜合度的高低在遺傳學(xué)中也代表著遺傳變異性的高低[28]，這也表明本研究采集的國內(nèi)紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體具有較豐富的遺傳多態(tài)性，而已有研究表明，國內(nèi)養(yǎng)殖群體遺傳多樣性雖然保持著較高水平，但與澳洲野生紅螯螯蝦群體相比還是有些許下降[22]。

3.3 群體的遺傳分化與遺傳結(jié)構(gòu)

Fis、AMOV、FCA和結(jié)構(gòu)分析表明，大部分的變異來源于種群內(nèi)部，只有小部分來源于種群間，這個結(jié)果和HE等[3]的研究相似。并且各個群體都保持著較高水平的遺傳距離，其中ZJHZ和GDZJ群體之間遺傳距離最大(0.107 7)。這些結(jié)果都表明這5個紅螯螯蝦群體之間存在差異，而種群內(nèi)的差異很可能是因?yàn)槿斯みx擇對于這些養(yǎng)殖群體的影響還不夠高[10]，或者是由于小規(guī)模養(yǎng)殖的遺傳漂變影響的結(jié)果。在本研究中有4個微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了哈迪溫伯格平衡，而在金玲等[22]的研究中10個位點(diǎn)有5個偏離了哈迪溫伯格平衡，這可能是存在無效等位基因從而導(dǎo)致雜合子缺失[29]。也可能是隨著紅螯螯蝦養(yǎng)殖發(fā)展，不可避免地會發(fā)生近交，而近親繁殖會使種群質(zhì)量衰減、生產(chǎn)力下降[3]。

4 結(jié)論

本研究共鑒定8個多態(tài)多樣性良好的微衛(wèi)星位點(diǎn)。8個位點(diǎn)在150個樣本個體中共檢測出237個Na，平均為6.05，說明這些微衛(wèi)星位點(diǎn)可以用來檢測紅螯螯蝦的遺傳變異。Ho和He也保持著較高水平意味著所采集的國內(nèi)紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體具有較豐富的遺傳多態(tài)性。并且各個群體都保持著較高水平的遺傳距離，其中ZJHZ和GDZJ群體之間遺傳距離最大。這些結(jié)果都表明這5個紅螯螯蝦群體之間存在差異，表明這5個中國紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體具有較高水平的遺傳多態(tài)性，雖然5個養(yǎng)殖群體都保持著較高的遺傳多態(tài)性，但結(jié)合過往研究，隨著累代養(yǎng)殖，紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體會不可避免發(fā)生近交，會對培育品種產(chǎn)生不良影響，也會導(dǎo)致國內(nèi)紅螯螯蝦遺傳多樣性有下降的風(fēng)險(xiǎn)。而以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可為后續(xù)定制科學(xué)合理的選育及保種的方法提供數(shù)據(jù)支持，這樣紅螯螯蝦產(chǎn)業(yè)才能夠持久健康發(fā)展。