周 慶，徐曉瑩，郭 賽，許巧情，羅 凱，郜衛(wèi)華，田 娟，陳效儒

(1.長江大學(xué)，澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點試驗室，湖北荊州 434025；2.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東煙臺 264003；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；4.通威農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，水產(chǎn)健康養(yǎng)殖四川省重點實驗室，成都 610041)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)具有適應(yīng)性強、養(yǎng)殖周期短、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，是當(dāng)前最具商業(yè)價值的水產(chǎn)品之一。近年來，其全國養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量持續(xù)快速增長，由2007年的26.55萬噸增長到2021年的263.36萬噸，增長了8.92倍，年均增長率63.71%[1，2]。然而，目前克氏原螯蝦養(yǎng)殖存在規(guī)格小、出肉率低等問題，嚴重影響其經(jīng)濟效益。因此，尋找提高克氏原螯蝦生長性能的方法成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中亟待解決的問題。

飼料粒徑的大小會影響魚蝦生長性能和飼料效率。BUSTI等[3]分別用2、4和6 mm粒徑飼料飼養(yǎng)215.9 g金頭鯛(SparusAurata)，結(jié)果表明各粒徑飼料對金頭鯛的終末體重和特定生長率無顯著影響，但投喂2 mm粒徑飼料能夠減少飼料浪費。AGUADO-GIMéNEZ等[4]采用T1(投喂2 mm粒徑飼料至金頭鯛達到0.1 kg，然后投喂4 mm粒徑飼料)和T2(投喂2 mm粒徑飼料至金頭鯛達到0.07 kg，隨后投喂4 mm粒徑飼料至0.22 kg，最后投喂6 mm粒徑飼料)兩種方式飼養(yǎng)0.05 kg金頭鯛，結(jié)果表明T2組金頭鯛的特定生長率顯著提高，同時減少了飼料浪費。ZARZAR等[5]分別用1.7、2.3和3.1 mm粒徑飼料飼養(yǎng)軍曹魚(Rachycentroncanadum)，發(fā)現(xiàn)3.1 mm組的增重率顯著高于1.7 mm組，2.3 mm組的飼料系數(shù)顯著低于1.7 mm組。與1.0～1.8 mm粒徑破碎料相比，投喂1.8 mm粒徑顆粒料顯著提高了斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)幼蝦生長速度，提高了飼料效率[6]。AZAZA等[7]分別選用3、7和11 g的尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)開展3個實驗，每個實驗采用相同的4種不同粒徑飼料飼養(yǎng)，結(jié)果表明飼料最佳粒徑隨著尼羅羅非魚的生長而增大。MATTILA等[8]認為飼料粒徑對魚類生長和飼料效率的影響與魚類大小有關(guān)。因此，不同規(guī)格的魚類，投喂適宜粒徑的飼料能夠使其生長性能最好?？耸显r生長速度快，特別是早期生長階段[9]，其個體大小變化快，單一粒徑飼料不能滿足其快速的生長變化。因此，針對克氏原螯蝦幼蝦階段制定多種不同的粒徑飼料組合投飼策略是十分有必要的。

在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)和科學(xué)實驗中，多采用2 mm或3 mm粒徑的硬顆粒飼料飼喂克氏原螯蝦幼蝦[10-14]。因此，本實驗采用這兩種粒徑飼料組合投喂，通過改變不同粒徑投喂天數(shù)以調(diào)整投飼策略飼養(yǎng)克氏原螯蝦幼蝦，研究不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦幼蝦生長性能、消化酶活性和非特異性免疫的影響，以期為克氏原螯蝦的配合飼料生產(chǎn)與應(yīng)用及養(yǎng)殖投餌方案提供科學(xué)理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗飼料(粒徑為2 mm和3 mm)由通威股份有限公司提供，飼料營養(yǎng)成分見表1，所有飼料于-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗飼料基本營養(yǎng)成分(干物質(zhì))Tab.1 Basic nutrients of experimental feed(dry matter)

1.2 養(yǎng)殖管理

克氏原螯蝦幼蝦購自湖北省荊州市高清養(yǎng)殖合作社,于長江大學(xué)水產(chǎn)基地的半室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖桶(直徑×高=150 cm×50 cm)中暫養(yǎng)14 d。每個養(yǎng)殖桶中放入20根(直徑9 cm,長20 cm)PVC水管和塑料仿生水草以供蝦苗攀爬和躲避。暫養(yǎng)結(jié)束后,饑餓24 h,選取初始體重為(7.73±0.05) g的幼蝦隨機分配到12個養(yǎng)殖桶中。養(yǎng)殖實驗共設(shè)置4個處理組,分別為FS1組(3 mm粒徑飼料投喂60 d)、FS2組(2 mm粒徑飼料投喂10 d和3 mm粒徑飼料投喂50 d)、FS3組(2 mm粒徑飼料投喂20 d和3 mm粒徑飼料投喂40 d)和FS4組(2 mm粒徑飼料投喂30 d和3 mm粒徑飼料投喂30 d),每組3個重復(fù),每個重復(fù)25尾蝦,進行為期60 d的養(yǎng)殖。實驗期間每天飽食投喂2次(8:00和17:00),每天清除殘餌及排泄物,每兩天換水1/2。養(yǎng)殖水體水溫為(25.0±1.0) ℃,pH7.0±0.5,溶解氧不低于5.0 mg/L,氨氮小于0.1 mg/L。

1.3 樣品采集與分析

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后克氏原螯蝦禁食24 h，統(tǒng)計養(yǎng)殖桶中克氏原螯蝦數(shù)量并稱重。每桶隨機取10尾蝦，稱量體重和肝胰腺重，用于生長指標(biāo)的計算?？耸显r血淋巴從圍心腔取出，存于1.5 mL的離心管中4 ℃靜置4 h后4 ℃離心(14 400g)后取上清液，于-80 ℃保存，用于抗氧化和免疫相關(guān)指標(biāo)的測定?？耸显r肌肉于-20 ℃保存，用于水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的測定。肝胰腺組織于-80 ℃保存，用于抗氧化和免疫相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.4 分析方法

飼料水中穩(wěn)定性測定：參照姚海航等[15]的方法，準(zhǔn)確稱取10 g飼料，放入尼龍過濾網(wǎng)袋(高30 cm，寬20 cm，孔徑0.25 mm)。將網(wǎng)袋置于恒溫水浴鍋中，水溫為(25.0±1.0) ℃，浸泡一定時間(0.5、1、2、4和12 h)后取出網(wǎng)袋，將網(wǎng)袋內(nèi)飼料置于105 ℃烘箱烘干至恒重(W，g)，另測定未浸泡的飼料水分含量(X，%)。每組設(shè)3個重復(fù)，水中穩(wěn)定性用溶失率C表示。各時間段的飼料粗蛋白和粗脂肪含量測定見基本營養(yǎng)成分分析。

基本營養(yǎng)成分分析：飼料中的水分含量采用105 ℃直接干燥法(GB/T5009.3-2010)測定，肌肉水分采用冷凍干燥法(SCIENTZ-10N型冷凍干燥機)測定。粗蛋白采用凱氏定氮法(GB/T5009.5-2016)測定，粗脂肪采用索氏抽提法(GB/T5009.6-2016)測定，灰分采用灼燒稱重法(GB/T5009.4-2016)測定。

消化酶活性測定：稱取肝胰臟(約0.8 g)，放入10 mL勻漿管中，加入9倍質(zhì)量的去離子水，用玻璃勻漿器進行冰浴勻漿，4 ℃離心(3 000g) 10 min，取上清待測。使用紫外比色法測定胰蛋白酶(trypsin，TPS)活性，使用甲基試鹵靈底物法測定脂肪酶(lipase，LPS)活性，采用淀粉-碘比色法測定淀粉酶(amylase，AMS)活性。所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

血清、肝胰腺抗氧化和免疫相關(guān)指標(biāo)測定：使用磷酸苯二鈉法測定酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性。采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用ABTS法測定總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 統(tǒng)計分析

計算公式如下：

溶失率(C)=[G(1-X)-W]/[G(1-X)]×100%

增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%

存活率(SR)=Nt/N0×100%

特定生長率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%

飼料系數(shù)(FCR)=Wf/(WtNt-W0N0)

肝體比(HIS)=Wh/Wt×100%

含肉率(FC)=Wm/Wt×100%

式中，G為稱取的飼料重量(g)；X為飼料含水率(%)；W為烘干后網(wǎng)袋內(nèi)飼料重量(g)；Wt為終末體重(g)；W0為初始體重(g)；Lt為終末體長(cm)；Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)；t為實驗天數(shù)(d)；Wf為飼料攝入量(g)；Wd為死亡總重(g)；Wh為肝胰腺重(g)；Wm為蝦尾部肌肉重(g)。

實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±standard error)表示。采用SPSS 26.0軟件進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(One-way ANOVA)，Tukey法進行多重比較，當(dāng)P<0.05時，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料的水穩(wěn)定性、粗蛋白和粗脂肪含量變化情況

由表2可知，兩種粒徑飼料隨著在水中浸泡時間的延長，飼料溶失率顯著增大。浸泡0.5、1、2、4和12 h時，3 mm粒徑飼料溶失率極顯著低于2 mm粒徑飼料。由表3可知，隨著在水中浸泡時間的延長，2 mm粒徑飼料粗蛋白含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，在12 h時，粗蛋白含量最大，且顯著高于其他檢測時間段。隨著在水中浸泡時間的延長，3 mm粒徑飼料粗蛋白含量顯著增加，在12 h時，粗蛋白含量最大。浸泡0.5、1、2、4和12 h時，2 mm粒徑飼料粗蛋白含量極顯著低于3 mm粒徑飼料。由表4可知，兩種粒徑飼料隨著在水中浸泡時間的延長，飼料粗脂肪含量總體呈現(xiàn)降低趨勢，2 mm粒徑飼料粗脂肪含量在浸泡12 h時顯著降低，3 mm粒徑飼料在浸泡4 h和12 h時顯著降低。在浸泡0.5 h、1 h和2 h時，兩種粒徑飼料粗脂肪含量無顯著差異，在浸泡4 h和12 h時，3 mm粒徑飼料粗脂肪含量顯著低于2 mm粒徑飼料。

表2 不同時間兩種粒徑飼料的溶失率(干重)Tab.2 Dissolution rate of feed with two particle sizes at different times(dry matter)

表3 不同時間兩種粒徑飼料的粗蛋白含量變化(干重)Tab.3 Change in crude protein content of feed with two particle sizes at different times(dry matter)

表4 不同時間兩種粒徑飼料的粗脂肪含量變化(干重)Tab.4 Changes in crude lipid content of two particle sizes of feed at different times(dry matter)

2.2 不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦生長性能的影響

由表5可知，各組間存活率、肝體比、肥滿度和腹部含肉率均無顯著差異。增重率和特定生長率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且最大值均出現(xiàn)在FS2組，并顯著高于FS4組。FS2組、FS3組和FS4組的飼料系數(shù)顯著低于對照組(FS1)。

表5 不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦生長性能的影響Tab.5 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on growth performance of P.clarkii

2.3 不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肌肉基本成分的影響

由表6可知，不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肌肉的水分、粗蛋白和灰分含量均無顯著影響。隨著投喂2 mm粒徑飼料的天數(shù)占比增加，克氏原螯蝦肌肉粗脂肪含量逐漸降低，且FS1組顯著高于FS4組。

表6 不同飼料粒徑投飼策略對克氏原螯蝦腹部肌肉成分的影響Tab.6 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on abdominal muscle composition of P.clarkii %

2.4 不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肝胰腺消化酶活性的影響

由表7可知，不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肝胰腺中AMS和LPS活性均無顯著影響。TPS活性呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，其活性在FS2組最高，且顯著高于FS4組。

表7 不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肝胰腺消化酶活性的影響Tab.7 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on hepatopancreas digestive enzymes activities of P.clarkii U/mg prot

2.5 不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肝胰腺和血清抗氧化相關(guān)指標(biāo)和非特異性免疫酶活性的影響

由表8可知，不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肝胰腺中ACP、AKP活性和T-AOC均無顯著影響。FS3組的肝胰腺SOD活性顯著高于FS1組。FS2組和FS4組的肝胰腺MDA含量均顯著低于FS1組。由表9可知，不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦血清的T-AOC、SOD、AKP、ACP活性和MDA含量均無顯著性差異。

表8 不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化相關(guān)指標(biāo)和非特異性免疫酶活性的影響Tab.8 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on hepatopancreas antioxidant related indicators and non-specific immune enzyme activity of P.clarkii

表9 不同粒徑硬顆粒飼料對克氏原螯蝦血清抗氧化相關(guān)指標(biāo)和非特異性免疫酶活性的影響Tab.9 Effects of feeding strategies with different particle size pellet feed on serum antioxidant related indicators and non-specific immune enzyme activity of P.clarkii

3 討論

顆粒飼料的水穩(wěn)定性是評價水產(chǎn)飼料質(zhì)量的重要參數(shù)[15]?？耸显r因其具有特殊的攝食行為，導(dǎo)致進食過程緩慢，因此對飼料的水穩(wěn)定性要求更高。一般認為飼料粒徑越小，水穩(wěn)定性越差，越容易被水浸潤，易溶成分就越容易溶失在水中，難溶成分就越容易因飼料破碎剝落而散失在水中[5，6，16-18]。本實驗中，與3 mm粒徑飼料相比，2 mm粒徑飼料溶失率更高，浸泡過程中，粗蛋白含量更低，水穩(wěn)定性更差，結(jié)果符合上述規(guī)律。在浸泡2 h內(nèi)時，兩種粒徑飼料粗脂肪含量無顯著差異，說明兩種粒徑飼料粗脂肪的水穩(wěn)定性在2 h內(nèi)不受粒徑大小的影響。隨著浸泡時間的延長，粗蛋白含量增加，這可能是因為蛋白質(zhì)難溶于水，而飼料中可溶物質(zhì)溶出速度快，相比之下，隨著浸泡時間延長，飼料中蛋白總量減少，但蛋白含量增加，這與朱金林[18]的結(jié)果相同。

一些魚類研究發(fā)現(xiàn)，飼料粒徑大小和魚類生長的關(guān)系遵循二次曲線模型[8]。研究表明在金頭鯛[4]、彭澤鯽(Carassiusauratusvarpengze)[19]、梭子魚(Sanderlucioperca)[8]、尼羅羅非魚[7]和非洲鯰(Clariasgariepinus)[20]等魚類的生長性能隨著飼料粒徑大于或者小于最佳飼料粒徑而降低。本實驗的4種粒徑組合投飼策略中，F(xiàn)S2組的克氏原螯蝦的增重率和特定生長率最高。表明單一粒徑飼料(3 mm)無法滿足克氏原螯蝦幼蝦階段(7.62～17.40 g)的生長需求，適宜的飼料粒徑組合投喂有助于促進克氏原螯蝦幼蝦的生長。與其它組相比，F(xiàn)S2組的飼料粒徑組合更加接近克氏原螯蝦幼蝦階段生長變化所需的最佳飼料粒徑。在飽食投喂的情況下，飼料粒徑主要通過捕獲及攝入難易程度、表面積大小和胃腸排空速率等因素影響魚類生長，當(dāng)飼料粒徑較小時，飼料表面積大，溶失率較高，營養(yǎng)成分溶失[5]。飼料小粒徑加快了胃腸排空速率，導(dǎo)致消化和吸收時間減少，降低消化效率[3，5，7]。同時魚類需要消耗更多的能量，以獲得與投喂較大粒徑飼料相同的攝入量[3-5]。但另一方面而言，小粒徑飼料與消化酶接觸的表面積更大，浸潤所需時間更短，有助于提高消化效率[5，7，21]。較大粒徑飼料則相反，因此飼料粒徑大小需要平衡影響生長的各種因素，從而達到最佳飼料粒徑。一般而言，隨著魚蝦的生長，口、胃腸道等攝食或消化器官逐漸變大，最佳飼料粒徑可能也在增大[8，19]。因此，養(yǎng)殖過程中需要適時調(diào)整投喂飼料粒徑，以適應(yīng)魚蝦的生長。在本研究中，F(xiàn)S2組的飼料粒徑組合比其他組更好，順應(yīng)了克氏原螯蝦在不同生長階段的變化，從而使?fàn)I養(yǎng)溶失情況、食物消化和能量消耗等方面相互協(xié)調(diào)達到相對較好水平，最終促進克氏原螯蝦的生長。雖然克氏原螯蝦攝食行為為抱食，會影響飼料到達消化道的實際粒徑大小，但與克氏原螯蝦一樣具有特殊攝食行為(咀嚼)的金頭鯛，其胃腸排空速率也會受到飼料粒徑大小的影響[3]。因此，不同粒徑的飼料進入克氏原螯蝦消化道后仍然存在粒徑差異。

分析飼料粒徑大小導(dǎo)致的飼料系數(shù)差異不同于營養(yǎng)元素研究實驗，不僅要關(guān)注其對生長的影響，還需要考慮飼料浪費情況[5]。FS1組和FS4組飼料系數(shù)比FS2組和FS3組高，這可能是FS1組所用的3 mm粒徑飼料對于飼養(yǎng)前期的克氏原螯蝦幼蝦來說，粒徑過大，抱食過程中產(chǎn)生很多飼料碎片，造成飼料浪費[22]。FS4組所用的2 mm粒徑飼料，隨著克氏原螯蝦的生長，其粒徑相對變小，捕獲并被攝食的概率降低或花費時間變長，導(dǎo)致飼料溶失增多，造成了飼料浪費[5]。同時該組增重較其它組低，致使飼料系數(shù)升高。本實驗結(jié)果表明，F(xiàn)S1組和FS2組飼料粒徑組合較為適中，減少了飼料浪費，提高了飼料效率。

消化酶與水產(chǎn)動物生長密切相關(guān)，消化酶活性高低會直接影響水產(chǎn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而影響生長[23]。本實驗中，各組肝胰腺脂肪酶活性無顯著差異，這可能是克氏原螯蝦攝入的兩種粒徑飼料粗脂肪含量無顯著差異引起的。隨著2 mm小粒徑飼料投喂天數(shù)的占比逐漸增加，腹部肌肉粗脂肪含量逐漸下降，可能是由于各組間克氏原螯蝦肝胰腺脂肪酶無顯著差異，而小粒徑飼料在胃腸的排空速率快，降低了消化效率[3，5，7]，隨著克氏原螯蝦的生長，飼料粒徑相對變得更小，進一步加劇降低了對脂肪的利用能力，另外攝入小粒徑飼料消耗的能量更多[3-5]，最終導(dǎo)致克氏原螯蝦腹部肌肉粗脂肪含量逐漸降低。胰蛋白酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在FS2組最強，表明適宜的粒徑組合提高了克氏原螯蝦幼蝦階段肝胰腺胰蛋白酶的活性，從而提高其對蛋白質(zhì)的消化利用，進而促進了克氏原螯蝦的生長，而其作用機制有待進一步研究。

克氏原螯蝦的非特異性免疫和抗氧化能力是維持機體良好生長的必要因素之一[24-26]。抗氧化酶是抵抗活性氧損傷的第一道防線[27]，SOD可以清除過量的活性氧，在克氏原螯蝦的抗氧化及免疫系統(tǒng)中起著重要作用[28]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，能夠反映機體組織器官脂質(zhì)過氧化損傷程度[29]。肝胰腺是蝦體的代謝中心器官，極易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致氧化損傷[28]。本實驗發(fā)現(xiàn)，投喂兩種粒徑(2 mm和3 mm)飼料各組肝胰腺的SOD活性均高于單一粒徑飼料組，且FS3組顯著高于FS1組。兩種粒徑飼料組合投喂組(FS2組和FS4組)肝胰腺的MDA含量顯著低于單一粒徑飼料組(FS1組)。表明在單一粒徑飼料(3 mm)投飼策略下，克氏原螯蝦幼蝦階段抗氧化能力較弱，適宜飼料粒徑組合(FS3組)投喂有助于提高克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺的SOD活性，同時適宜飼料粒徑組合(FS2組和FS4組)可以降低MDA含量，減少抗氧化損傷。其作用機制有待進一步研究。ACP是巨噬細胞中溶酶體的標(biāo)志性酶，在機體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[23]。AKP是魚蝦體內(nèi)重要的代謝調(diào)節(jié)酶，在魚蝦營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用中起著重要作用，可提高蝦蟹的抗病能力[27]。克氏原螯蝦缺乏特異性免疫系統(tǒng)，只能依靠非特異性免疫來抵抗病原體的入侵[30]，其中包括ACP和AKP，兩者常用于評估克氏原螯蝦免疫能力。本研究發(fā)現(xiàn)，不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略對克氏原螯蝦肝胰腺和血清的ACP和AKP活性沒有顯著影響。結(jié)果表明，克氏原螯蝦免疫能力不受不同粒徑硬顆粒飼料投飼策略的影響。

4 結(jié)論

單一的粒徑飼料投飼策略不能很好滿足克氏原螯蝦幼蝦階段快速生長變化需求。適宜的飼料粒徑組合投飼策略，能夠提高克氏原螯蝦消化酶活性，增強機體的抗氧化能力，促進生長，降低飼料系數(shù)。根據(jù)本實驗結(jié)果綜合考慮，F(xiàn)S2組的飼料粒徑組合投飼策略更有利于克氏原螯蝦幼蝦階段的生長，因此，建議此階段克氏原螯蝦的硬顆粒飼料投飼策略為2 mm粒徑飼料投喂10 d和3 mm粒徑飼料投喂50 d。