孫銘雪，鄭 晗，甘 星，韋奇志，馬徐發(fā)，謝 鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

拉氏鱥(Phoxinuslagowskii)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cypriniformes)雅羅魚亞科(Cypriniformes)鱥屬(Phoxinus)，在中國主要分布于黑龍江、遼河、黃河及長江中上游的支流[1]。該魚在我國北方屬小型經(jīng)濟(jì)魚類，喜棲息于低溫清澈且溶氧較高的水體中；其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，營養(yǎng)價(jià)值較高。近年來我國北方地區(qū)加強(qiáng)對(duì)拉氏鱥增養(yǎng)殖技術(shù)的研究和推廣，取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。有關(guān)拉氏鱥的研究多集中于人工繁殖和生態(tài)學(xué)方面。張永泉等[2]采集黑龍江流域野生拉氏鱥進(jìn)行馴養(yǎng)，篩選優(yōu)質(zhì)親魚催產(chǎn)，制備受精卵進(jìn)行人工孵化，完成了拉氏鱥的人工繁殖研究。莊雪等[3]利用D-loop分析遼寧省11個(gè)水庫中拉氏鱥種群的遺傳多樣性和適應(yīng)性變異，結(jié)果表明水庫隔離的繁殖對(duì)種群的發(fā)展有一定的影響。謝鵬[4]基于比較轉(zhuǎn)錄組對(duì)我國鱥屬魚類在溫度適應(yīng)方面進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示拉氏鱥在進(jìn)化上與適應(yīng)低緯度水域生活環(huán)境的相關(guān)基因表現(xiàn)出快速進(jìn)化或正向選擇。然而有關(guān)溫度等環(huán)境因子對(duì)拉氏鱥生長發(fā)育影響的研究卻鮮有報(bào)道。

魚類作為生活在水中的變溫動(dòng)物，溫度是影響魚類生長、發(fā)育、繁殖等活動(dòng)的重要環(huán)境因子之一。溫度升高能夠促進(jìn)生物體內(nèi)的代謝活動(dòng)，但超過一定的范圍則會(huì)抑制其生長，甚至造成生物體死亡[5]。有研究表明，在一定范圍內(nèi)適當(dāng)升高溫度，可以提高多種魚的生長性能，例如草魚(Ctenopharyngodonidella)[6]、駝背鱸(Cromileptesaltivelis)[5]、美洲黑石斑(Centropristisstriata)等。目前，利用基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)溫度變化可以引起鯉(Cyprinuscarpio)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8]等大量基因的表達(dá)發(fā)生改變。研究溫度對(duì)拉氏鱥生長相關(guān)基因的影響可以為探索該魚高溫適應(yīng)提供理論依據(jù)，進(jìn)而可通過遺傳選育培育新品種，突破養(yǎng)殖區(qū)域限制。

魚類的生長主要是由下丘腦-垂體-肝臟生長軸調(diào)控的[9]，轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族是調(diào)控GH-IGF生長軸的重要基因家族，TGF-β超家族主要分為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，Bmp)和TGF-β兩個(gè)亞家族。Bmp亞家族包括BMPs、部分GDFs等[10]，在動(dòng)物的骨骼生長和器官發(fā)育過程中具有著重要作用，通過對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和小鼠卵巢切除模型的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)bmp4傳導(dǎo)活化被抑制后，小鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松現(xiàn)象，說明bmp4可以促進(jìn)骨組織再生[11]。gdf8是肌肉生長負(fù)調(diào)控因子，MCPHERRON等[12]研究發(fā)現(xiàn)gdf8缺失的小鼠會(huì)出現(xiàn)肌纖維增長和肌肉肥大的現(xiàn)象。Smad是TGF-β家族重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，smad4和smad7是TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子[13]。Sox基因家族在脊椎動(dòng)物早期發(fā)育過程中起著重要作用[14]，生長分化因子5誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后檢測(cè)到sox9顯著表達(dá)，表明sox9與軟骨發(fā)育密切相關(guān)[15]。

脊椎骨作為多數(shù)硬骨魚類支撐體軸最重要的組織，其形態(tài)發(fā)育和生長直接關(guān)系到魚類軀體的生長。同時(shí)，在魚類個(gè)體生物學(xué)研究中，脊椎骨又是良好的年齡鑒定材料，可用于魚類生長特性的分析。本實(shí)驗(yàn)基于團(tuán)隊(duì)拉氏鱥比較轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果(暫未發(fā)表)，篩選出與骨形態(tài)發(fā)育和生長相關(guān)的差異表達(dá)基因bmp2b、bmp4、bmp7a、smad4、smad7、sox9a和gdf8，擬探究不同溫度飼養(yǎng)條件下，拉氏鱥脊椎骨中這些基因的表達(dá)差異，旨在為拉氏鱥等非模式魚類響應(yīng)溫度變化的生長機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支撐，以及為其溫度馴化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用拉氏鱥采集于長江水系(宜昌市，興山縣)，體長(6.1±0.6)cm，體質(zhì)量(2.6±0.7)g。樣本采集后置于實(shí)驗(yàn)室水族箱恒溫循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)馴養(yǎng)14 d使其適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境。養(yǎng)殖水溫保持在(23.0±0.5) ℃，水體溶解氧5.0 mg/L以上，pH 7.0～7.2。采用紅蟲投喂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)挑選大小相近、健康無病的拉氏鱥120尾作為實(shí)驗(yàn)用魚。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)15、20、25、30 ℃，每組設(shè)置三個(gè)平行組，每個(gè)平行組10尾魚，實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)12個(gè)規(guī)格為60 L的聚乙烯塑料桶中進(jìn)行。水溫通過空調(diào)與電子加熱棒調(diào)控，室內(nèi)環(huán)境保持陰暗，每天換水20 L(備用曝氣水與各組水溫保持一致)，投喂紅蟲，投飼率為5%，投喂15 min后進(jìn)行吸底。養(yǎng)殖28 d后從各平行組選規(guī)格相近的3尾拉氏鱥取脊椎骨樣品進(jìn)行混樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 總RNA提取

將凍存的脊椎骨樣品取出后按照Trizol法抽提總RNA，采用紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)測(cè)定所提總RNA的濃度及純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

使用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)引物(表1)，各引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司武漢分公司合成，實(shí)驗(yàn)室稀釋至10 μmol/L保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for real-time fluorescent quantitative PCR

表2 不同溫度飼養(yǎng)28 d后各組體長和體質(zhì)量的變化Tab.2 Effects of different temperatures on growth of P.lagowskii

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

參照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照一步快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:總RNA 6 μL,4×AccuRT Reaction Mix 2 μL,室溫放置5 min,AccuRT Reaction Stopper 2 μL,5×All-In-One RT Master Mix 4 μL,Nuclease-free water 6 μL。輕輕混勻,25 ℃靜置10 min,42 ℃孵育15 min,85 ℃滅活5 min,反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存。

采用QuantStudioTM6Flex熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，ABI，USA)，cDNA使用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYB Green Master Mix，0.4 μL Rox referene Dye II，0.8 μL Primer-F/R，6 μL ddH2O，2 μL cDNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?5 ℃預(yù)變性10 min；②擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40輪循環(huán)；③熔解反應(yīng)：95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

熒光定量反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器導(dǎo)出的擴(kuò)增曲線的Ct值，選擇β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS 26.0軟件作單因素方差分析(One-Way ANOVA)，GraphPad 9.0.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度組拉氏鱥生長的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，拉氏鱥的平均體長在4個(gè)溫度下沒有發(fā)生顯著性變化，各組間體長增長范圍為1.25～1.83 mm，增長的平均值為1.63 mm。體質(zhì)量在25 ℃和30 ℃組中顯著高于15 ℃和20 ℃組，15 ℃組和20 ℃組的平均體質(zhì)量分別減少了0.12 g和0.09 g，而25 ℃組和30 ℃組分別增重了0.32 g和0.44 g。

2.2 總RNA檢測(cè)

經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，所有總RNA樣品的A260 nm/280 nm均在1.8～2.0之間。隨機(jī)挑選4份樣品進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，可見有明顯的3條帶，28 S和18 S條帶清晰，5 S條帶較弱，表明提取的總RNA質(zhì)量均較好(圖1)。

圖1 拉氏鱥脊椎骨總RNA電泳圖Fig.1 Total RNA electrophoresis of P.lagowskii

2.3 各引物qPCR熔解曲線

各對(duì)引物的熔解曲線如圖2所示，曲線均顯示出單一的熔解峰，無引物二聚體及非特異性引物，說明引物特異性良好，符合qPCR要求。

圖2 bmp4、bmp2b、bmp7a、smad4、smad7、gdf8、sox9a和內(nèi)參基因β-actin的熔解曲線Fig.2 Melting curves of bmp4、bmp2b、bmp7a、smad4、smad7、gdf8、sox9a，and β-actin

2.4 拉氏鱥脊椎骨中相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的變化

不同溫度條件下拉氏鱥bmp4、bmp2b、bmp7a基因在脊椎骨中的相對(duì)表達(dá)量如圖3所示。以15 ℃養(yǎng)殖組作為對(duì)照組，bmp4基因相對(duì)表達(dá)量在15 ℃和20 ℃組中沒有顯著差異，溫度上升到25 ℃時(shí)的表達(dá)量顯著升高，溫度升高至30 ℃，表達(dá)量顯著降低；bmp2b在25 ℃和30 ℃組顯著低于15 ℃和20 ℃組的表達(dá)量；bmp7a基因的表達(dá)量在15 ℃和20 ℃組無明顯差異，而25 ℃和30 ℃的表達(dá)量顯著高于15 ℃和20 ℃組。

圖3 拉氏鱥脊椎骨Bmps mRNA在不同溫度下的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of Bmps mRNA in the vertebrae of P.lagowskii at different temperatures

作為介導(dǎo)TGF-β家族成員信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵性蛋白家族，本研究中拉氏鱥smad4和smad7基因在不同溫度下的相對(duì)表達(dá)量變化較為明顯(圖4)。兩基因的相對(duì)表達(dá)量均在25 ℃組顯著高于其余3個(gè)溫度組，且為顯著的先上升后下降的趨勢(shì)。

圖4 拉氏鱥脊椎骨Smads mRNA在不同溫度下的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of Smads mRNA in the vertebrae of P.lagowskii at different temperatures

如圖5所示，gdf8基因的相對(duì)表達(dá)量隨著溫度升高呈出明顯的上升趨勢(shì)，在30 ℃組的表達(dá)量達(dá)到峰值且顯著高于其他三個(gè)溫度組。sox9a的表達(dá)量在15 ℃和20 ℃組間無明顯差異，溫度升至25 ℃，表達(dá)量顯著升高，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，表達(dá)量明顯下降。

圖5 拉氏鱥脊椎骨gdf8和sox9a mRNA在不同溫度下的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of gdf8 and sox9a mRNA in the vertebrae of P.lagowskii at different temperatures

3 討論

魚類的生長發(fā)育過程與溫度、光照、溶氧等環(huán)境因子有著密切的關(guān)系，其中溫度是最重要的影響因子[16]。適宜的溫度是魚類保持正常生長速度、維持正常生理狀態(tài)的必要條件，也是獲得最大經(jīng)濟(jì)效益的保障。溫度過高或過低都會(huì)影響魚類的生長狀態(tài)[17]。本實(shí)驗(yàn)中，拉氏鱥在15、20、25 ℃和30 ℃四個(gè)溫度組飼養(yǎng)前后的體長沒有顯著變化且無組間差異；而體質(zhì)量在15 ℃和20 ℃組中無顯著差異，25 ℃組和30 ℃組的體質(zhì)量顯著高于前兩組，但后兩組間的體質(zhì)量無顯著差異。脊椎骨中bmp4、bmp7a、smad4、smad7和sox9a基因的相對(duì)表達(dá)量在25 ℃時(shí)達(dá)到最大值，平均體質(zhì)量也顯著升高，說明拉氏鱥生長的適宜溫度應(yīng)該在25 ℃左右；各基因表達(dá)量在30 ℃時(shí)大部分顯著降低，且體質(zhì)量相對(duì)于25 ℃未顯著增加，推測(cè)30 ℃可能已接近拉氏鱥適宜生長溫度的上限，其攝食和生長相關(guān)的代謝活動(dòng)開始減弱。

轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是一類龐大的調(diào)控動(dòng)物肌肉生長發(fā)育的超家族，該家族中的多個(gè)基因已被證實(shí)與肌肉發(fā)育有直接或間接的關(guān)系[18]。其成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bmps)是一種多功能細(xì)胞因子，促進(jìn)骨細(xì)胞增殖分化，誘導(dǎo)軟骨和骨形成[19]，在脊椎動(dòng)物的生長中起重要作用。在本研究中，3種骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)量與體重的組間差異大致相同。

bmp4由成骨細(xì)胞分泌，通過刺激成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)骨和軟骨形成[20]。本實(shí)驗(yàn)中，溫度從20 ℃升至25 ℃，拉氏鱥的bmp4基因的表達(dá)量顯著升高。韓明洋等[21]探究了卵形鯧鰺仔魚頭部和脊柱軟骨組織中與骨骼發(fā)育相關(guān)基因在不同溫度下的表達(dá)差異，結(jié)果表明，溫度升高，bmp4的表達(dá)增強(qiáng)。YTTEBORG等[22]對(duì)大西洋鮭的研究結(jié)果同樣表明bmp4的表達(dá)會(huì)隨著水溫的升高而增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其大致相似，但過高的溫度會(huì)抑制拉氏鱥bmp4的表達(dá)。bmp2被認(rèn)為是活性最強(qiáng)且是唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子，bmp2b作為bmp2基因的亞型，在有機(jī)體內(nèi)行使著與bmp2基因同樣的分子功能。bmp2b基因的表達(dá)量在溫度升高至25 ℃時(shí)顯著降低。NISHIMURA等[23]的研究結(jié)果表明，smad6的過表達(dá)可抑制bmp2的成骨作用。smad6和smad7都屬于抑制型蛋白，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)的smad7基因在溫度較高的養(yǎng)殖組中的相對(duì)高表達(dá)可能同樣抑制了bmp2的成骨作用，因而bmp2b基因的表達(dá)量下降。在一些硬骨魚中，例如斑馬魚[24]，bmp7分化為bmp7a和bmp7b兩個(gè)亞型，bmp7a參與早期背腹軸分化，在胚胎背腹軸發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[25]。SETOGUCHI等[26]發(fā)現(xiàn)脊椎損傷后bmp7基因的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，推測(cè)bmp7在脊椎損傷早期發(fā)揮保護(hù)作用。本研究中，bmp7a基因表達(dá)量隨著溫度升高呈上升趨勢(shì)，且在溫度從20 ℃升到25 ℃時(shí)，表達(dá)量顯著升高。這可能預(yù)示著在20～25 ℃這個(gè)區(qū)間內(nèi)，溫度上升，對(duì)拉氏鱥的發(fā)育有一定的促進(jìn)作用，從而為軀體生長的提速打下基礎(chǔ)。

Smads是TGF-β超家族的信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核的重要基因家族[27]，smad4在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起關(guān)鍵作用[28]。本研究中，smad4基因在不同溫度下的變化趨勢(shì)與bmp4的大致相同。隨著溫度從15 ℃上升到25 ℃，bmp4的成骨作用增強(qiáng)，smad4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用增強(qiáng)；溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，smad6競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合smad4，負(fù)反饋?zhàn)饔迷鰪?qiáng)，smad4的表達(dá)量顯著下降。smad7被稱為“軟骨抑制因子”，可破壞軟骨發(fā)育進(jìn)程以及損壞軟骨細(xì)胞[29]。smad7作為bmp2下游的重要軟骨抑制因子，在bmp2誘導(dǎo)下表達(dá)明顯升高。

gdf8在生物體內(nèi)對(duì)于維持成肌細(xì)胞的增殖和分化的穩(wěn)態(tài)有著十分重要的作用，通過負(fù)向調(diào)節(jié)肌肉生長參與機(jī)體的生長發(fā)育過程[30]。本研究中該基因在20 ℃和25 ℃組間無顯著差異，且顯著低于30 ℃組。這可能暗示著在20～25 ℃的溫度范圍內(nèi)，拉氏鱥脊椎骨中包含gdf8在內(nèi)的多個(gè)基因參與的調(diào)控下，成肌細(xì)胞的增殖和分化處于良好穩(wěn)態(tài)，有利于生長發(fā)育，該結(jié)果與葉恒振[31]研究布氏鯧鲹肌肉中g(shù)df8表達(dá)量的結(jié)果相似。sox9a在軟骨和骨骼的形態(tài)發(fā)生和分化中發(fā)揮作用[32]。韓明洋等[33]的研究結(jié)果為26 ℃下sox9a的表達(dá)量顯著高于29 ℃和32 ℃。本實(shí)驗(yàn)中sox9a在25 ℃組的表達(dá)量顯著高于其它三組，與其結(jié)果高度吻合。這說明25 ℃的飼養(yǎng)水溫對(duì)拉氏鱥脊椎骨中sox9a基因的表達(dá)有促進(jìn)作用，從而調(diào)節(jié)其軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)拉氏鱥的生長。

4 小結(jié)

本研究結(jié)果表明，不同飼養(yǎng)溫度對(duì)拉氏鱥脊椎骨中bmp4、bmp2b、bmp7a、smad4和smad7、gdf8和sox9a基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量有顯著影響。通過單因素方差分析，拉氏鱥脊椎骨中與生長相關(guān)的7個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，拉氏鱥在20～25 ℃之間脊椎骨中骨形態(tài)發(fā)生蛋白和GH-IGF生長軸的基因相對(duì)表達(dá)量較高，而且溫度20 ℃躍升至25 ℃時(shí)體質(zhì)量顯著增加，推測(cè)在這個(gè)溫度范圍內(nèi)拉氏鱥骨骼發(fā)育和生長相關(guān)的代謝通路和生物學(xué)過程更為活躍。

本研究更多的還是側(cè)重于這些基因所具有的分子功能，而對(duì)其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞組分以及所參與的生物學(xué)過程未能進(jìn)行深入的探討。在未來研究中，可圍繞bmp4、bmp7a和smad4等基因，進(jìn)一步挖掘其參與的代謝通路，以及介入的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，力爭(zhēng)更加系統(tǒng)地解析這些基因參與拉氏鱥等小型魚類生長發(fā)育，特別是骨骼發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。