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        潰瘍性結(jié)腸炎動物模型構(gòu)建方法的研究進(jìn)展

        2024-05-07 05:12:22田家華索小濤馬晨曦鄭麗紅王海強
        山東醫(yī)藥 2024年13期
        關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)法動物模型屏障

        田家華,索小濤,馬晨曦,鄭麗紅,王海強

        1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化二科,哈爾濱 150040;2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科

        潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,病理改變主要累及結(jié)腸或直腸的黏膜層和黏膜下層,臨床表現(xiàn)為黏液膿血便、間斷性腹瀉、腹痛、里急后重等。有研究表明,UC可增加自身免疫性肝病、結(jié)直腸癌、貧血等疾病的發(fā)生風(fēng)險,并可引起焦慮、抑郁等精神心理疾病,給患者造成沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和巨大的心理壓力[1-3]。目前,UC的確切發(fā)病機制尚不完全清楚,可能與腸道微生態(tài)失衡、自身免疫功能紊亂以及家族遺傳等因素有關(guān)[4]。UC診斷尚無金標(biāo)準(zhǔn),主要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、結(jié)腸鏡檢查及腸組織病理檢查等綜合分析。但UC 病程往往較長,病情遷延難愈,緩解期與活動期交替出現(xiàn),病例收集和隨訪難度較大。UC動物模型可模擬UC腸黏膜屏障損傷、腸道炎癥狀態(tài)及菌群紊亂情況。因此,通過構(gòu)建合理的動物模型對揭示UC的發(fā)病機制、探索高效的治療策略至關(guān)重要。目前,UC動物模型的構(gòu)建方法主要有誘導(dǎo)法、基因敲除法和聯(lián)合法,這些模型構(gòu)建方法各有利弊,應(yīng)根據(jù)自身實驗需求和實驗條件選擇最適合的動物模型。本文結(jié)合文獻(xiàn)就UC動物模型構(gòu)建方法的研究進(jìn)展作一綜述。

        1 誘導(dǎo)法構(gòu)建UC動物模型

        誘導(dǎo)法是UC 動物模型最常見的建模方法,通常采取口服、灌胃、灌腸三種方式經(jīng)消化道給藥,部分化學(xué)藥物還可采取經(jīng)腹腔注射方式給藥。誘導(dǎo)法的成本相對較低,對實驗室硬件要求較低,并且建模成功率較為理想。但誘導(dǎo)法對給藥時間、藥物濃度及動物敏感性等要求較高,部分誘導(dǎo)藥物的毒性較強,易造成動物死亡。根據(jù)誘導(dǎo)劑不同,誘導(dǎo)法可分為化學(xué)藥物誘導(dǎo)法、微生物誘導(dǎo)法和食物誘導(dǎo)法。誘導(dǎo)法UC 動物模型的誘導(dǎo)藥物、給藥方式、常用動物、建模周期及模型評價見表1。

        表1 誘導(dǎo)法UC模型的誘導(dǎo)藥物、給藥方式、常用動物、建模周期及模型評價

        1.1 化學(xué)藥物誘導(dǎo)法 化學(xué)藥物誘導(dǎo)法是通過化學(xué)藥物、抗原或抗體制劑等破壞腸黏膜屏障并誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥,是最經(jīng)典且最常用的UC 動物模型構(gòu)建方法。最常用的化學(xué)藥物為葡聚糖硫酸鈉(DSS),其次為三硝基苯磺酸(TNBS)和乙酸。此外,還有一些使用頻次較低的化學(xué)藥物,如二硝基苯胺磺酸(DNBS)、惡唑酮(OXA)、吲哚美辛等。通過DSS 構(gòu)建UC 動物模型簡單易行,成功率高,可重復(fù)性強,可模擬UC 急性和慢性炎癥過程。通過TNBS 構(gòu)建UC動物模型,低劑量時炎癥維持時間較短且存在自愈傾向,而高劑量時則易引起動物死亡。但該模型構(gòu)建方法可通過調(diào)整藥物劑量模擬UC 活動期與緩解期交替的臨床狀態(tài)。乙酸構(gòu)建UC 動物模型周期短,藥效持續(xù)時間有限,僅可誘導(dǎo)UC 急性炎癥過程。DNBS 的藥理特征與TNBS 類似,但需配合乙酸使用,建模較復(fù)雜,近年越來越少通過DNBS 構(gòu)建UC 動物模型。OXA 與DNBS 同為半抗原,無法單獨應(yīng)用,需預(yù)先配合乙醇致敏,通過OXA 構(gòu)建UC 動物模型亦逐年減少。吲哚美辛可抑制腸黏膜中前列腺素合成,進(jìn)而損傷腸黏膜屏障,但該藥制備時操作繁瑣,并且損傷部位更趨向于小腸,近年已逐漸被棄用?;瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)法一般需要先將實驗動物置于光照12 h/黑暗12 h交替、適宜的溫度和濕度環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,然后制備相應(yīng)濃度的化學(xué)藥物進(jìn)行口服、灌胃、灌腸或腹腔注射。根據(jù)模擬的臨床分期不同,化學(xué)藥物誘導(dǎo)法建模所需時間由1 周至數(shù)月不等[5]。各化學(xué)藥物的作用機制有所不同,DSS 和乙酸可直接作用于消化道黏膜層及黏膜下層,通過破壞消化道物理屏障的緊密連接結(jié)構(gòu),為致病菌鞭毛、脂多糖等有毒物質(zhì)侵襲結(jié)腸組織創(chuàng)造條件,還可影響TNF-α、IL-6 分泌,進(jìn)而破壞炎癥因子平衡;TNBS、DNBS、OXA則作為抗原通過誘發(fā)免疫炎癥反應(yīng),模擬UC 患者的腸組織病理變化;吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥,可抑制維持腸黏膜屏障的前列腺素分泌,進(jìn)而造成腸黏膜屏障破壞和腸道炎癥?;瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)法的適用范圍較廣,既可用于免疫相關(guān)性研究,又可用于腸黏膜屏障相關(guān)性研究。化學(xué)藥物誘導(dǎo)法的建模動物包括小鼠、大鼠、犬、家兔等,建模難度較低,建模成功率高,但由于其主要通過消化道給藥,能夠直接破壞腸黏膜屏障并誘發(fā)免疫應(yīng)答,部分藥物可能還會誘發(fā)腸外癥狀,如TNBS 對皮下組織的腐蝕性較強,可影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。盡管目前已有學(xué)者提出了實驗動物用藥劑量換算公式,但在實際應(yīng)用中,化學(xué)藥物誘導(dǎo)法構(gòu)建UC 動物模型過程中仍存在用藥劑量混亂情況,從而對模型構(gòu)建成功率造成一定影響。

        1.2 微生物誘導(dǎo)法 腸道菌群是指腸道內(nèi)的微生物,對維持腸道正常功能具有重要作用[6]。正常情況下,腸道菌群可與宿主及外部環(huán)境建立起動態(tài)平衡,一旦腸道菌群紊亂,即可引起宿主多種功能喪失,如黏膜屏障功能喪失、炎癥和免疫功能喪失等,從而誘發(fā)多種疾?。?]。當(dāng)前,腸道菌群與UC 發(fā)病的關(guān)系尚未完全明確,但普遍認(rèn)為益生菌作為優(yōu)勢菌群可抑制致病菌繁殖,同時提供營養(yǎng)物質(zhì)維護腸黏膜屏障,避免腸道炎癥發(fā)生[8]。厚壁菌門及擬桿菌門的主要代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供60%~70%的能量,是維護腸黏膜屏障的重要能量來源。而梭狀芽孢菌、類桿菌等與UC 發(fā)生和病情加重密切相關(guān),在UC 活動期患者腸道中此類菌群豐度明顯增加[9-10]。微生物誘導(dǎo)法是通過灌胃或灌腸方式使致病菌定植于結(jié)腸處,從而誘發(fā)UC相關(guān)癥狀的模型構(gòu)建方法。微生物誘導(dǎo)法包括從UC 患者糞便中提取致病菌移植誘導(dǎo)和使用單一菌株移植誘導(dǎo)兩種。微生物誘導(dǎo)法普遍適用于各類實驗鼠,可模擬UC 患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)。學(xué)者們大多選擇移植UC患者腸道菌群來構(gòu)建其動物模型,建模成功率較高,但出現(xiàn)動物死亡的概率較大,而單一菌株移植建模成功率尚不確定[11]。微生物誘導(dǎo)法構(gòu)建UC 動物模型存在較大的不確定性,難以明確誘發(fā)UC的具體菌屬,故該建模方法有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

        1.3 食物誘導(dǎo)法 特定的飲食習(xí)慣與UC 發(fā)生有一定相關(guān)性。有研究認(rèn)為,膳食纖維攝入減少和肉類、蛋類以及乳制品類食物攝入增多是當(dāng)前UC發(fā)病率不斷增長的主要原因[12-15]。食物誘導(dǎo)法是通過高糖高脂飲食和增加乙醇攝入量等誘導(dǎo)腸黏膜屏障損傷的UC 動物模型構(gòu)建方法。THOMAS 等[16]使用麥芽糖混合豬油制作高脂飼料,小鼠自由進(jìn)食該高脂飼料6周,第6周末予3% DSS,成功構(gòu)建出UC動物模型。LI等[17]每日將SD大鼠置于濕熱環(huán)境中6 h,實驗全程予蜂蜜水、豬油喂養(yǎng),從第3周起每日灌胃高度白酒,成功模擬出熱帶沿海人群的UC動物模型。該方法構(gòu)建的UC動物模型較貼近臨床實際情況,可探索飲食結(jié)構(gòu)與UC 發(fā)病的相關(guān)性。但由于飼養(yǎng)環(huán)境和特定食物制備等問題,該模型構(gòu)建方法主要適用于小型實驗動物,如BALB/c 小鼠、C57BL/6 小鼠、Swiss小鼠。食物誘導(dǎo)法構(gòu)建UC 動物模型的成功率較低,并且不能單獨構(gòu)建UC 動物模型,通常需要聯(lián)合其他UC動物模型構(gòu)建方法[12]。

        2 基因敲除法構(gòu)建UC動物模型

        全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了不少可能與UC 相關(guān)染色體上的易感區(qū)域及易感基因[18]?;蚯贸?0 世紀(jì)80 年代末發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù),是使生物體基因組中的特定基因失活或失效的過程。近年來,修改實驗動物特定基因片段以實現(xiàn)免疫應(yīng)答或屏障功能失常成為構(gòu)建UC 動物模型的新手段?;蚯贸?gòu)建的動物模型為進(jìn)一步探索基因異常所致自發(fā)性UC 的發(fā)病機制提供了可能。根據(jù)敲除基因不同,基因敲除法可分為屏障蛋白基因敲除法和抗炎因子基因敲除法。

        2.1 屏障蛋白基因敲除法 在UC 發(fā)生、發(fā)展過程中,腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能的維持對機體免疫環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[19]。屏障蛋白基因敲除法UC 動物模型是通過敲除構(gòu)成結(jié)腸黏膜屏障的蛋白,以構(gòu)建自發(fā)性UC 動物模型。腸黏膜屏障損傷后,其通透性增加,腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)等可通過受損的腸黏膜屏障進(jìn)入內(nèi)環(huán)境,誘發(fā)和(或)加重炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致UC 的發(fā)生、發(fā)展?;蚯贸_x擇的屏障蛋白包括帶狀閉合蛋白、咬合蛋白、閉合蛋白等,通過在靶基因中引入突變使其失去功能[20]。基因敲除方法有同源重組、RNA 干擾和CRISPR/Cas9。CRISPR/Cas9 是最常用的基因編輯工具,它使用引導(dǎo)RNA 和Cas9 酶在基因組的特定位置引入靶向DNA 斷裂,從而導(dǎo)致基因破壞[21-22]。屏障蛋白基因敲除法構(gòu)建UC 動物模型的成功率高,在實驗過程中無自愈傾向,可完全模擬UC 的腸組織病理變化,并且損傷位置精準(zhǔn)可控,適用于針對閉鎖蛋白、Claudin 蛋白、膜周蛋白家族以及連接黏附分子等靶點的藥物研發(fā),也是未來構(gòu)建UC 動物模型的主流方法。屏障蛋白基因敲除法理論上適用于所有實驗動物,但由于基因工程技術(shù)難度大、成本高,該模型動物主要為小鼠。

        2.2 抗炎因子基因敲除法 腸道內(nèi)炎癥平衡被破壞是UC 的發(fā)病機制之一[23]??寡滓蜃踊蚯贸贑RISPR/Cas9 基因技術(shù)平臺,通過內(nèi)切酶切割雙鏈DNA 導(dǎo)致切割位點移碼突變或片段缺失,造成基因沉默,功能喪失,從而實現(xiàn)基因敲除[24];這一步驟完成后,炎癥平衡被打破,促進(jìn)了炎癥反應(yīng),從而成功構(gòu)建了UC 動物模型[25]??寡滓蜃踊蚯贸ㄊ荱C動物模型中最適合研究發(fā)病機制的建模方法,同時也適用于自發(fā)性UC 高發(fā)人群的靶向藥物研發(fā)。與屏障蛋白基因敲除法類似,該模型動物主要為小鼠,其原因一個是成本高,另一個是抗炎因子基因敲除后,炎癥平衡被破壞,實驗動物存在死亡風(fēng)險。

        3 聯(lián)合法構(gòu)建UC動物模型

        聯(lián)合法采取兩種及以上方法構(gòu)建UC 動物模型,常用于補充單一模型構(gòu)建方法模擬UC 腸組織病理狀態(tài)的不足。GE 等[11]通過化學(xué)藥物聯(lián)合微生物菌群構(gòu)建的小鼠UC 動物模型,不僅能模擬腸道菌群失調(diào)狀態(tài),還能模擬腸道炎癥狀態(tài),此外還解決了單一菌株建模成功率較低的問題。張澤丹等[26]通過化學(xué)藥物聯(lián)合特殊飲食并模擬特殊環(huán)境構(gòu)建的小鼠UC 模型,能夠模擬UC 患者真實的生活習(xí)慣,適用于特定地域或人群的UC 研究。聯(lián)合法構(gòu)建UC動物模型對實驗動物品類要求較低,各品類實驗鼠均可用于構(gòu)建UC 動物模型。聯(lián)合法構(gòu)建UC 動物模型的根本目的在于進(jìn)一步縮小實驗室內(nèi)模擬環(huán)境和臨床實際的差異,可廣泛用于發(fā)病機制的研究,但聯(lián)合法并非多種模型構(gòu)建方法的簡單堆砌,需要科學(xué)合理的前期設(shè)計。

        綜上所述,UC是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,其確切發(fā)病機制尚不完全清楚。目前,UC診斷尚無金標(biāo)準(zhǔn),主要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、結(jié)腸鏡檢查及腸組織病理檢查等綜合分析。但UC病程往往較長,病情遷延難愈,緩解期與活動期交替出現(xiàn),病例收集和隨訪難度較大。而UC動物模型可模擬UC腸黏膜屏障損傷、腸道炎癥狀態(tài)及菌群紊亂情況。因此,通過構(gòu)建合理的動物模型對揭示UC的發(fā)病機制、探索高效的治療策略至關(guān)重要。目前,UC動物模型的構(gòu)建方法主要有誘導(dǎo)法、基因敲除法和聯(lián)合法。這些模型構(gòu)建方法各有利弊,應(yīng)根據(jù)自身實驗需求和實驗條件選擇最適合的動物模型。

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