楊璐舟，王剛

巴中市中心醫(yī)院眼科，四川巴中636000

視網(wǎng)膜靜脈阻塞是臨床常見的一種眼底血管病，其發(fā)病率為0.3%～2.3%，僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變［1］。目前，視網(wǎng)膜靜脈阻塞的發(fā)病機制尚不完全清楚，其致病因素包括高眼壓、青光眼等局部因素和高血壓、糖尿病、高血脂等全身因素［2］。視網(wǎng)膜靜脈阻塞會導(dǎo)致不同程度視力障礙，部分患者治療反應(yīng)較差［3］。因此，臨床一直在尋找視網(wǎng)膜靜脈阻塞預(yù)后的生物標(biāo)志物，以便指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。微小核糖核酸（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 分子，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而廣泛參與多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。miR-33a-5p 是miRNA 家族中的一員，定位于人22號染色體［4］。近期有研究通過高通量微陣列檢測發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者房水miR-33a-5p 水平顯著降低［5］。SMAD同源物7（SMAD7）基因定位于人染色體18q21.1，其編碼蛋白在調(diào)節(jié)TGF-β家族細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用［6］。而TGF-β 可通過控制細(xì)胞骨架重塑、視網(wǎng)膜屏障和微血管內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等參與視網(wǎng)膜靜脈阻塞的發(fā)生、發(fā)展［7］。有研究報道，miR-33a-5p 能夠靶向調(diào)控SMAD7 而參與機體多種生物學(xué)過程［8］。但血清miR-33a-5p、SMAD7 水平與視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后的關(guān)系鮮見報道。本研究觀察了視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p、SMAD7 水平變化，并探討二者與視力預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年6 月—2023 年1 月巴中市中心醫(yī)院眼科收治的視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者108例（觀察組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合視網(wǎng)膜靜脈阻塞診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；②單眼發(fā)?。虎鄢踉\；④入院前未接受任何相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他視網(wǎng)膜疾病者；②合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；③合并惡性腫瘤者；④合并自身免疫性疾病者。其中，男52 例、女56 例，年齡28～74（53.96 ± 6.76）歲，有并發(fā)癥79 例（黃斑囊樣水腫41 例、玻璃體出血19 例、視網(wǎng)膜新生血管15例、新生血管性青光眼4例）。同期隨機另選在巴中市中心醫(yī)院體檢健康的志愿者108 例（對照組），男53 例、女55 例，年齡26～72（52.85 ± 7.08）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)巴中市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：202009）。所有研究對象或其家屬知情同意并自愿簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-33a-5p、SMAD7檢測 觀察組入院次日、對照組體檢當(dāng)日，采集清晨空腹外周靜脈血3～5 mL，待血液自然凝固后取上清，以3 000 r/min 離心10 min、離心半徑12 cm，留取上層血清，-20 ℃冰箱保存。

取部分血清，按血清總RNA 提取試劑盒說明提取血清總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA 純度高且分子完整。按cDNA 第一鏈合成試劑盒說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃10 min。以cDNA 為模板，按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。miR-33a-5 上游引物5'-GCCAGTAGCACTCACCATAGCTCGC-3'、下游引物5'-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3'，內(nèi)參U6 上游引物5'-GCTGGACTCTAGGGTGCAAG-3'、下游引物5'-GAGCATACCAGGTGGTAGTAG-3'。反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL，2 ×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s 共40 個循環(huán)。所有操作在ABI 7500 Fast 實時熒光定量PCR 儀上完成。PCR擴增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-33a-5p水平。

取剩余血清，采用Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀、按ELISA 法檢測血清SMAD7。所有操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 治療與隨訪 所有視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者予雷珠單抗0.5 mg 玻璃體腔內(nèi)注射治療，每個月注射1次，連續(xù)注射3 次。治療3 個月后，評估視力?；佳圩罴殉C正視力≤0.05 為盲、＞0.05～≤0.3 為低視力［10］。患眼低視力或盲為預(yù)后不良，患眼最佳矯正視力＞0.3為預(yù)后良好。108例視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者中，預(yù)后不良57例、預(yù)后良好51例。

1.4 視力預(yù)后相關(guān)的資料收集分析 收集所有視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者治療前臨床資料，包括性別、年齡、BMI、發(fā)病部位，是否合并高血壓、糖尿病、高血脂和有無并發(fā)癥以及血清miR-33a-5p、SMAD7 水平等。比較視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后良好者與預(yù)后不良者上述臨床資料，將有統(tǒng)計學(xué)差異的指標(biāo)納入多因素Logistic 回歸模型，分析視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的危險因素。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗符合正態(tài)分布，以±s表示，結(jié)果比較采用獨立樣本t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。危險因素分析采用多因素Logistic回歸模型。預(yù)測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-33a-5p、SMAD7 水平比較 觀察組與對照組血清miR-33a-5p 水平分別為0.58 ±0.16、1.04 ± 0.32，血清SMAD7水平分別為（42.71 ±6.72）、（14.37 ± 3.59）ng/L。觀察組血清miR-33a-5p水平低于對照組，血清SMAD7水平高于對照組（t分別為13.362、38.657，P均＜0.01）。

2.2 視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p 水平與血清SMAD7 水平的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p 水平與血清SMAD7水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.649，P＜0.05）。

2.3 視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的危險因素 視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后良好者與預(yù)后不良者臨床資料比較見表1。以視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后為因變量（預(yù)后不良=1，預(yù)后良好=0），以血清miR-33a-5p、SMAD7 水平以及是否合并高血壓、高血脂和有無并發(fā)癥為自變量，納入多因素Logistic 回歸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-33a-5p 水平降低、血清SMAD7 水平升高和合并高血壓、高血脂以及有并發(fā)癥是視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的獨立危險因素（P均＜0.05），見表2。

表1 視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后良好者與預(yù)后不良者臨床資料比較

表2 視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.4 血清miR-33a-5p、SMAD7 水平對視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的預(yù)測效能 ROC 曲線分析顯示，血清miR-33a-5p、SMAD7 水平預(yù)測視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的曲線下面積（AUC）分別為0.870、0.869，二者聯(lián)合預(yù)測視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的AUC為0.938。血清miR-33a-5p、SMAD7 水平聯(lián)合預(yù)測視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的AUC高于二者單獨（Z分別為2.419、2.422，P均＜0.05），見表3。

表3 血清miR-33a-5p、SMAD7水平對視網(wǎng)膜靜脈阻塞視力預(yù)后不良的預(yù)測效能結(jié)果

3 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞是繼糖尿病視網(wǎng)膜病變之后第二常見的視網(wǎng)膜血管疾病，發(fā)病初期癥狀不明顯，多數(shù)患者在體檢時被查出［11］。視網(wǎng)膜靜脈阻塞會導(dǎo)致不同程度視力障礙，還可引起黃斑囊樣水腫、玻璃體出血、視網(wǎng)膜新生血管、新生血管性青光眼等并發(fā)癥。視網(wǎng)膜靜脈阻塞的治療反應(yīng)較差，其視力改善效果相對有限［12］。因此，臨床一直在尋找預(yù)測視網(wǎng)膜靜脈阻塞視力預(yù)后的生物標(biāo)志物，以便指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。

miRNA 是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 分子，在血液、尿液、唾液等體液中廣泛存在，可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)［13］。miR-33a-5p 是miRNA家族中的一員，定位于人22 號染色體。有研究報道，miR-33a-5p能夠參與膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂肪酸/葡萄糖等代謝過程，與妊娠期糖尿病、頸動脈粥樣硬化以及多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［14］。LIU等［15］研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性IgA 腎病患者血清、尿液和腎組織miR-33a-5p 水平顯著低于健康志愿者，隨著腎臟損傷程度加重，血清、尿液和腎組織miR-33a-5p水平逐漸降低。因此認(rèn)為，miR-33a-5p可作為反映IgA腎病患者腎臟損傷嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清miR-33a-5p 水平顯著低于對照組；視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良者血清miR-33a-5p 水平顯著低于其預(yù)后良好者，多因素Logistic 回歸分析顯示，血清miR-33a-5p 水平降低是視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的獨立危險因素。結(jié)果提示，血清miR-33a-5p 水平降低與視網(wǎng)膜靜脈阻塞發(fā)生和視力預(yù)后不良密切相關(guān)，可作為預(yù)測視網(wǎng)膜靜脈阻塞發(fā)生和視力預(yù)后的生物標(biāo)志物。

SMAD7基因定位于人染色體18q21.1，其編碼蛋白是TGF-β信號通路的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，與炎癥性疾病、多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［16］。MONTELEONE等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在壞死性小腸結(jié)腸炎、環(huán)境性腸功能障礙、難治性乳糜瀉和巨細(xì)胞病毒誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組織中SMAD7 表達(dá)上調(diào)，使TGF-β1信號通路受到抑制，而敲除SMAD7 則可恢復(fù)TGF-β1信號通路的傳導(dǎo)功能，從而減輕腸道炎癥。已有研究證實，TGF-β1信號通路與視網(wǎng)膜靜脈阻塞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［7］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清SMAD7 水平高于對照組；視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良者血清SMAD7 水平高于其預(yù)后良好者，多因素Logistic回歸分析顯示，血清SMAD7水平升高是視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的獨立危險因素。結(jié)果提示，SMAD7 可能通過增強炎癥反應(yīng)，參與視網(wǎng)膜靜脈阻塞的發(fā)生、發(fā)展，并可作為預(yù)測視網(wǎng)膜靜脈阻塞發(fā)生和視力預(yù)后的生物標(biāo)志物。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-33a-5p 能夠靶向負(fù)調(diào)控SMAD7 而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，有望成為心血管疾病的治療靶點［7］。本研究分析發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p 水平與血清SMAD7 水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-33a-5p 可能靶向負(fù)調(diào)控SMAD7 而介導(dǎo)視網(wǎng)膜靜脈阻塞的發(fā)生。ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-33a-5p、SMAD7 水平聯(lián)合預(yù)測視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的AUC高于二者單獨，提示miR-33a-5p、SMAD7 可作為預(yù)測視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的血清生物標(biāo)志物。有研究表明，合并高血壓、高血脂以及有并發(fā)癥是視網(wǎng)膜靜脈阻塞視力預(yù)后不良的危險因素［18］。本研究多因素Logistic 回歸分析亦證實，合并高血壓、高血脂和有并發(fā)癥是視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的獨立危險因素。提示密切關(guān)注視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者合并癥和并發(fā)癥，以便采取針對性干預(yù)措施，能夠有效抑制視網(wǎng)膜靜脈阻塞的病情進(jìn)展。

綜上所述，視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者血清miR-33a-5p水平降低、血清SMAD7 水平升高；血清miR-33a-5p水平降低、血清SMAD7水平升高是視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良的獨立危險因素；血清miR-33a-5p、SMAD7 水平對視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者視力預(yù)后不良均有一定預(yù)測價值，二者聯(lián)合預(yù)測價值更高。但miR-33a-5p、SMAD7 參與視網(wǎng)膜靜脈阻塞發(fā)生、發(fā)展的具體分子機制仍不完全清楚，尚需進(jìn)一步研究。