譚燕杰，石郎天，姚勇剛△

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208； 2. 重慶市中醫(yī)院，重慶 400011）

炎癥性腸?。↖BD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D）［1］。近年來，IBD 在亞洲、歐美及中東地區(qū)的發(fā)病率不斷上升，但目前仍缺少有效的治療手段，導(dǎo)致IBD患者生活質(zhì)量降低，社會負擔(dān)加重［2-3］。IBD的病因尚未明確［4］，隨著研究的不斷深入，越來越多的研究表明腸道黏膜屏障的破壞與IBD 的發(fā)病密切相關(guān)［5-6］。ZO - 1 和Occludin 蛋白為縫隙連接蛋白，在IBD 發(fā)病的病理生理過程中，通過與其他蛋白相互作用，形成了上皮細胞之間的緊密連接，從而發(fā)揮維持上皮屏障完整性的關(guān)鍵作用［7-8］。去氫駱駝蓬堿是藥用植物駱駝蓬種子的提取物，在國內(nèi)及中東部分地區(qū)已有上千年的藥用歷史。現(xiàn)代研究表明，該成分具有抗炎性反應(yīng)、抗病毒、抗感染、抗氧化等作用［9］，但其對IBD 的作用尚未明確。本研究中探討了去氫駱駝蓬堿對IBD模型小鼠腸道組織黏膜屏障的防護作用，從而為開發(fā)IBD治療手段提供新思路。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：KH - BL 型包埋機（湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司）；YD - 315 型石蠟切片機（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；LTP - 400 型脫水機（金華市華速科技有限公司）；Bio - rad 蛋白電泳轉(zhuǎn)印套裝1658029、Biorad Powerpac HC 164-5052型電泳儀（美國Bio-rad公司）。

試藥：去氫駱駝蓬堿（批號為HY-N0737A）、蛋白酶抑制劑（批號為HY-13259），均購自美國MCE公司；2%硫酸葡聚糖鈉（DSS，美國MP Biomedicals 公司，批號為0216011080）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號為C0105M）、細胞裂解緩沖液（批號為P0013B），均購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；戊二醛（梯希愛<上海>化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號為G0067）；硝酸纖維素濾膜（美國PALL 公司，批號為P - N66485）；ZO-1 抗體（批號為21773-1-AP）、Occludin 抗體（批號為27260-1-AP）、GAPDH 抗體（批號為60004-1-Ig），均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（賽默飛世爾科技< 中國>有限公司，批號為A-11034）；轉(zhuǎn)印模塊（美國Biorad公司，批號為1658029）。

動物：C57BL/6J 小鼠，64 只，雄性，2月齡，體質(zhì)量（22±2）g，于溫度25 ℃，相對濕度40%，12 h/12 h 明暗交替環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2022-0007。動物飼養(yǎng)于重慶市中醫(yī)院動物實驗室，實驗期間小鼠自由進食飲水。本研究經(jīng)重慶市中醫(yī)院實驗動物倫理審查批準（批件號2023-DWSY-TYJ）。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模與給藥

將64 只小鼠隨機分為空白對照組（等體積水）、藥物對照組（0.05 mg/mL去氫駱駝蓬堿）、模型組（等體積水）和藥物觀察組（0.05 mg/mL去氫駱駝蓬堿），各16只。在小鼠飲水中添加2%的DSS，連續(xù)喂養(yǎng)7 d，以復(fù)制IBD小鼠模型；空白對照組和藥物對照組以水喂養(yǎng)。建模成功后，各組小鼠予相應(yīng)藥物或水，連續(xù)4 d。

1.2.2 體質(zhì)量及生存率

每組取10 只小鼠，分別于建模第0～7 天稱定體質(zhì)量，觀察各組小鼠建模第0～11 天的生存率，并進行組間比較。

1.2.3 結(jié)腸長度及病理學(xué)評分

每組取6只小鼠，收集結(jié)腸組織，測量其長度，并固定，將標本置4%多聚甲醛24 h，隨后脫水、石蠟包埋和切片（厚4 μm），HE 染色，顯微鏡下觀察?；诮M織損傷參數(shù)（腺體增生、上皮損傷和水腫程度）和炎性參數(shù)（單核細胞、多形核細胞、淋巴細胞和浸潤位置）進行評分。評分范圍為0～3分和0～4分，對于組織損傷參數(shù)分別對應(yīng)不存在、輕微、中度、嚴重，對于炎性參數(shù)分別對應(yīng)不存在、黏膜、黏膜下層、全層（肌層和漿膜受累）、彌漫性。

1.2.4 蛋白表達

采用Western blot法。取小鼠結(jié)腸組織，加入液氮研磨，加入細胞裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，研成勻漿，冰上靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，隨后提取蛋白。采用BCA 法進行蛋白定量，隨后進行SDS -PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉，用5% 脫脂奶粉稀釋的ZO - 1抗體（1∶500）、Occludin 抗體（1∶800，V/V）4 ℃下孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min，用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（1∶5 000，V/V），室溫下孵育60 min，TBST 再次洗膜3次，每次10 min，采用化學(xué)發(fā)光法顯影。使用Image J軟件計算蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。生存分析使用對數(shù)秩（Mantel- Cox）檢驗。采用Shapiro- Wilk檢驗判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合且方差齊時行雙側(cè)、未配對t檢驗。對于假定具有相等方差和正態(tài)分布的3 組及以上數(shù)據(jù)，使用單因素方差分析（ANOVA），再使用Bonferroni 事后檢驗進行多重比較。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存率、體質(zhì)量及結(jié)腸長度

與模型組比較，藥物觀察組小鼠的生存率明顯升高，體質(zhì)量變化率明顯減小，結(jié)腸長度明顯增加（P<0.05）。詳見圖1。

注：*P < 0.05，**P < 0.01。圖2、圖3同。A. 生存曲線 B. 體質(zhì)量 C. 結(jié)腸長度圖1 小鼠生存曲線、體質(zhì)量及結(jié)腸長度Note：*P < 0.05，**P < 0.01（for Fig.1 - 3）.A.Survival curve B.Body mass C.Colon lengthFig.1 Survival curve，body mass and colon length of mice

2.2 腸道組織病理學(xué)評分及形態(tài)

與空白對照組比較，模型組小鼠病理損傷明顯加重，結(jié)腸黏膜和黏膜下層出現(xiàn)上皮損傷，炎性細胞增多，部分細胞核出現(xiàn)溶解，且病理學(xué)評分明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，藥物觀察組小鼠病理損傷程度明顯減輕，結(jié)腸黏膜和黏膜下層上皮損傷明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少，且病理學(xué)評分明顯降低（P< 0.05）。詳見圖2。

a1. 空白對照組 a2. 藥物對照組 a3. 模型組 a4. 藥物觀察組A. 顯微鏡圖（HE，× 100） B. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖2 病理組織學(xué)及病理組織評分a1.Blank control group a2.Drug control group a3.Model group a4.Drug observation groupA.Microscopic images（HE，× 100） B.Data statisticsFig.2 Pathological histology and pathological score

2.3 ZO-1 和Occludin 蛋白

與空白對照組比較，模型組小鼠ZO-1和Occludin蛋白表達水平均明顯降低（P< 0.05）；與模型組比較，藥物觀察組小鼠ZO-1 和Occludin 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）。詳見圖3。

3 討論

近年來已有大量研究廣泛探討了IBD 的發(fā)病機制和治療策略。既往研究表明，免疫系統(tǒng)異常激活、遺傳易感性、腸道菌群失調(diào)、飲食相關(guān)因素及環(huán)境因素等多種因素與IBD 的發(fā)病相關(guān)［8，10］。傳統(tǒng)療法中使用的免疫抑制劑、益生菌、生物制劑等，在部分患者中可能表現(xiàn)出限制性或不良反應(yīng)［11-13］，故尋找新的治療策略以改善IBD患者的預(yù)后尤為重要。

近年來，越來越多的研究關(guān)注了天然產(chǎn)物和草藥中的活性成分，探索其對IBD的潛在療效［14-15］。去氫駱駝蓬堿具有潛在的藥用價值，在一些實驗?zāi)Ｐ椭酗@示出對炎性疾病具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［16-17］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，藥物觀察組小鼠的存活率顯著升高，結(jié)腸長度明顯增加，IBD 相關(guān)的病理組織學(xué)明顯改善，進一步強調(diào)了其有益效果。表明去氫駱駝蓬堿可能作為治療IBD的潛在藥物。

IBD 的病理生理特點為腸道黏膜屏障的破壞［8，18］，導(dǎo)致腸道內(nèi)微生物易穿越，繼而引發(fā)炎性反應(yīng)。腸道黏膜屏障的破壞可能涉及黏膜上皮細胞的改變及縫隙連接蛋白的異常表達［19］。既往研究證實，縫隙連接蛋白（如ZO - 1，Occludin 等）在維持腸道屏障完整性方面十分重要，其水平失調(diào)與IBD 的發(fā)病有關(guān)［20］。本研究結(jié)果表明，去氫駱駝蓬堿有效地調(diào)節(jié)了腸道組織中縫隙連接蛋白ZO - 1 和Occludin 的表達，提示其可能通過增強腸道屏障功能和減少黏膜通透性來發(fā)揮作用。去氫駱駝蓬堿改善腸道屏障功能的能力在IBD 的背景下尤為重要，因為黏膜屏障的破壞會促進IBD 的發(fā)展并加劇炎性反應(yīng)。通過恢復(fù)腸道屏障的完整性，去氫駱駝蓬堿有可能減輕腸腔抗原和病原體對黏膜的滲透，病理組織上表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜和黏膜下層上皮損傷減輕，炎性細胞浸潤減少，從而減輕IBD 特有的炎性反應(yīng)。

去氫駱駝蓬堿對縫隙連接蛋白的影響還表明了其在治療IBD外對胃腸道健康的更廣泛意義?？紤]到腸道屏障完整性在維持腸道穩(wěn)態(tài)和預(yù)防各種胃腸道疾病方面的核心作用，去氫駱駝蓬堿可能在治療與黏膜屏障功能失調(diào)有關(guān)的多種疾病方面具有潛力。

綜上所述，去氫駱駝蓬堿對IBD 模型小鼠的腸道屏障具有一定防護作用，其機制可能為提高ZO - 1 和Occludin 蛋白表達水平。未來仍需進一步明確該成分如何調(diào)控縫隙連接蛋白，同時需進一步研究其完整的治療潛力。