喬曉芳，王迎舉，倫琦星，陶海濤

（1. 河南省藥品審評(píng)查驗(yàn)中心·河南省疫苗檢查中心，河南 鄭州 450000； 2. 江蘇萬(wàn)創(chuàng)滅菌設(shè)備科技有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212200）

中藥制劑原料中藥材多帶有大量微生物，是中藥制劑被微生物污染的主要途徑之一［1］，微生物在適宜條件下會(huì)大量生長(zhǎng)繁殖，從而導(dǎo)致藥品變質(zhì)、腐敗、療效降低或失效，甚至可能對(duì)人體有害?；谠搭^控制、過(guò)程控制的風(fēng)險(xiǎn)管理理念，在藥品生產(chǎn)過(guò)程中，減少或殺滅微生物，是保證藥品質(zhì)量的關(guān)鍵。常用的輻照滅菌法存在設(shè)備費(fèi)用高，部分藥物滅菌后療效可能降低，影響液體藥劑的穩(wěn)定性，使用需注意安全防護(hù)的缺點(diǎn)［2-4］；流通蒸汽滅菌法存在含揮發(fā)油類(lèi)、芳香類(lèi)中藥材不適用，滅菌后藥粉水分大易板結(jié)成塊，存在需二次干燥、二次粉碎的弊端；乙醇?xì)怏w滅菌法存在生產(chǎn)效率低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、能源用量大、費(fèi)工費(fèi)時(shí)的問(wèn)題［5］。藥材原粉經(jīng)滅菌處理后常直接用于口服固體制劑生產(chǎn)，如何選用適宜的方法滅菌是藥廠(chǎng)生產(chǎn)的一大難題。屬性層次模型（AHM）現(xiàn)已在藥品工藝優(yōu)化、藥物合理性評(píng)價(jià)等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［6-7］，但其受人為主觀(guān)因素影響較大，存在主觀(guān)偏差或人為排斥某些指標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)；熵權(quán)法（EWM）客觀(guān)性強(qiáng)、精準(zhǔn)度高［8-9］，但其難以考慮到人的主觀(guān)感受和價(jià)值判斷，受數(shù)據(jù)誤差的影響較大。兩法結(jié)合綜合賦權(quán)，能確保多評(píng)價(jià)指標(biāo)的相對(duì)權(quán)重更具科學(xué)性和準(zhǔn)確性［10］，可用于中藥及其制劑、醫(yī)藥領(lǐng)域等優(yōu)劣性評(píng)價(jià)。正交試驗(yàn)法采用多指標(biāo)作為評(píng)價(jià)對(duì)象，能最大限度地降低試驗(yàn)誤差，提高評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性和最優(yōu)方案的可行性［11-12］。本研究中在充分調(diào)研高溫瞬時(shí)滅菌智能化滅菌在藥品食品等行業(yè)應(yīng)用情況的基礎(chǔ)上［13-17］，對(duì)黃芩藥材高溫瞬時(shí)滅菌新方法進(jìn)行滅菌工藝探索，對(duì)其滅菌效果進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，為中藥材選擇適宜的滅菌方法提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

QYGI-300C 型切藥機(jī)（濟(jì)南沃成設(shè)備有限公司）；SF - 130 型錘擊式中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠(chǎng)）；WC - FMD - 150 型高溫瞬時(shí)滅菌設(shè)備（江蘇萬(wàn)創(chuàng)滅菌設(shè)備科技有限公司）；LC20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；BT25S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

黃芩（禹州市凱旋藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為221101，221102，221103）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-202223，含量97.2%），黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111595-201808，含量97.9%），漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111514 - 202207，含量≥98%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸、乙醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 高溫瞬時(shí)滅菌藥材制備

取藥材樣品適量，除去雜質(zhì)，置沸水中煮10 min，取出，悶透，切薄片，干燥，粉碎成細(xì)粉，過(guò)50目篩，采用聚乙烯自封袋分裝，每袋100 g，即得高溫瞬時(shí)滅菌藥材。

2.2 微生物限度檢查及滅菌率計(jì)算

稱(chēng)取滅菌前后藥材細(xì)粉樣品各10 g，加無(wú)菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液（pH 7.0）分別制成1∶10（m/V，下同）、1∶100、1∶1 000 和1∶10 000 的供試液。滅菌前樣品按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1108 中藥飲片微生物限度檢查法檢查，微生物限度應(yīng)符合需氧菌總數(shù)<105cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)<103cfu/g，大腸埃希菌和沙門(mén)菌不得檢出，耐膽鹽革蘭陰性菌<104cfu/g。滅菌后樣品按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105，1106 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查法檢查，微生物限度應(yīng)符合需氧菌總數(shù)< 104cfu / g，霉菌和酵母菌總數(shù)<102cfu/g，大腸埃希菌和沙門(mén)菌不得檢出，耐膽鹽革蘭陰性菌<102cfu/g。滅菌率（%）=（樣品滅菌前需氧菌總數(shù)+滅菌前霉菌及酵母菌總數(shù)-樣品滅菌后需氧菌總數(shù)-滅菌后霉菌及酵母菌總數(shù)）/（樣品滅菌前需氧菌總數(shù)+滅菌前霉菌及酵母菌總數(shù)）×100%。

2.3 黃芩苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（47∶53，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)不低于4 000，分離度>1.5，基線(xiàn)分離良好。

2.3.2 溶液制備

取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.60 mg/mL 的對(duì)照品貯備液；取適量，用甲醇稀釋10 倍，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取樣品0.6 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇75 mL，加熱回流提取3 h，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，冷卻至室溫，加70%乙醇定容，取適量，用70%乙醇稀釋20 倍，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

線(xiàn)性關(guān)系考察、定量限與檢測(cè)限試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品貯備液適量，用甲醇分別稀釋至4，10，20，40，100，200 倍，得系列對(duì)照品溶液。取適量，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并以黃芩苷質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y= 4.133 9 × 106X+ 829.3（r= 0.999 8，n=6）。結(jié)果表明，黃芩苷質(zhì)量濃度在3.00～150.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。以信噪比（S/N）為3和10 時(shí)待測(cè)成分的質(zhì)量濃度分別為檢測(cè)限和定量限，結(jié)果依次為0.039 μg/mL和0.131 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.3.2 項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)為221101）適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，結(jié)果的RSD為1.41%（n=6），表明方法日內(nèi)精密度良好。取同一供試品溶液（批號(hào)為221101）適量，1 d進(jìn)樣1 次，連續(xù)6 d，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.86%（n=6），表明方法日間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)為221101）適量，分別于室溫下放置0，2，4，7，12，18，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.95%（n= 7），表明供試品溶液室溫放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為221101）樣品適量，精密稱(chēng)定，共6 份，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果黃芩苷含量的RSD為1.51%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的黃芩樣品（批號(hào)為221101）細(xì)粉9 份，每份約0.3 g，精密稱(chēng)定，分別加入3.327 mg/mL黃芩苷對(duì)照品溶液8，10，12 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均加樣回收率為99.54%，RSD為1.21%（n=9）。

2.3.4 黃芩苷轉(zhuǎn)移率

取滅菌前后樣品各適量，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算黃芩苷的含量及其轉(zhuǎn)移率。黃芩苷轉(zhuǎn)移率（%）= 滅菌后黃芩苷含量/滅菌前黃芩苷含量×100%。

2.4 浸出物含量及浸出率

取樣品約3 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入稀乙醇100 mL，按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2201醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，計(jì)算供試品中浸出物含量，并計(jì)算浸出率。浸出率（%）=滅菌后浸出物含量/滅菌前浸出物含量×100%。

2.5 高溫瞬時(shí)滅菌工藝優(yōu)化

2.5.1 因素與水平

在前期單因素預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以進(jìn)料速率（A）、滅菌溫度（B）、滅菌時(shí)間（C）為影響因素，以浸出率、滅菌率、黃芩苷轉(zhuǎn)移率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法進(jìn)行工藝優(yōu)選。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

2.5.2 指標(biāo)權(quán)重考察

AHM：本研究中邀請(qǐng)5名副高級(jí)職稱(chēng)及以上藥學(xué)專(zhuān)家，按AHM 法對(duì)3 個(gè)考察指標(biāo)（滅菌率、黃芩苷轉(zhuǎn)移率和浸出率）分別比較指標(biāo)Pa相對(duì)于Pb（a ≠b）的相對(duì)重要性ia-b和ib-a，根據(jù)數(shù)學(xué)屬性要求ia-b和ib-a滿(mǎn)足ia-b≥0，ib-a≥0，ia-b+ib-a=1，ia-a=0 和ib-b=0，構(gòu)建相對(duì)屬性判斷矩陣（表2）。一致性檢驗(yàn)計(jì)算公式如下。

表2 考察指標(biāo)相對(duì)屬性判斷矩陣Tab.2 Relative attribute judgment matrix of investigation indicators

參考上述公式對(duì)相對(duì)屬性判斷矩陣進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，同時(shí)按公式分別計(jì)算3個(gè)考察指標(biāo)的相對(duì)權(quán)重。結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，所構(gòu)建的相對(duì)屬性判斷矩陣符合一致性檢驗(yàn)要求，表明判斷矩陣合理，滅菌率、黃芩苷轉(zhuǎn)移率和浸出率AHM相對(duì)權(quán)重依次為0.523 3，0.320 0，0.156 7。

EWM：首先對(duì)考察指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，按公式（式中，Zab=；若Zab= 0，則lnZab= 0）計(jì)算3 個(gè)考察指標(biāo)（滅菌率、黃芩苷轉(zhuǎn)移率和浸出率）的信息熵，再按公式計(jì)算3 個(gè)考察指標(biāo)的相對(duì)權(quán)重，結(jié)果顯示滅菌率、黃芩苷轉(zhuǎn)移率、浸出率EWM 相對(duì)權(quán)重依次為0.727 4，0.189 2，0.083 4。

2.5.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

取2.1項(xiàng)下高溫瞬時(shí)滅菌樣品，并固定出料溫度為35 ℃，L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表3（其中綜合評(píng)分= 滅菌率× 0.837 9 + 黃芩苷轉(zhuǎn)移率× 0.133 3 +浸出率×0.028 8），方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

由表3 可知，3 個(gè)因素作用強(qiáng)度依次為B > A > C。由表4可知，因素B（滅菌溫度）對(duì)結(jié)果有顯著影響（P<0.05）。綜合表3、表4結(jié)果及實(shí)際情況，確定黃芩高溫瞬時(shí)滅菌最佳工藝為A2B2C1，即進(jìn)料速率為120 kg/h，滅菌溫度為170 ℃，滅菌時(shí)間為6 s（出料溫度為35 ℃）。

2.6 中試驗(yàn)證試驗(yàn)

取3 批黃芩藥材樣品適量，按2.1 項(xiàng)下方法制備高溫瞬時(shí)滅菌樣品，按優(yōu)選工藝參數(shù)，依法對(duì)樣品進(jìn)行高溫瞬時(shí)滅菌。按2.2項(xiàng)下方法對(duì)滅菌前后樣品進(jìn)行微生物限度檢查并計(jì)算滅菌率，結(jié)果見(jiàn)表5（其中- 為未檢出）；按2.3 項(xiàng)下方法進(jìn)行黃芩苷含量測(cè)定并計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表6；按2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行浸出物檢測(cè)并計(jì)算浸出率，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果顯示，滅菌后樣品含菌量明顯減少，3 批樣品滅菌率均大于99.0%（批號(hào)221101，221102，221103樣品分別為99.90%，99.43%，99.79%）；滅菌前后黃芩苷及浸出物含量無(wú)明顯變化，黃芩苷轉(zhuǎn)移率及浸出率均大于95.0%。表明工藝重現(xiàn)性好，多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)黃芩高溫瞬時(shí)滅菌對(duì)有效成分均無(wú)影響，優(yōu)選出的工藝參數(shù)可用于樣品的高溫瞬時(shí)滅菌。

表6 滅菌前后樣品中黃芩苷含量及轉(zhuǎn)移率Tab.6 Content and transfer rate of baicalin in samples before and after sterilization

表7 滅菌前后樣品浸出物含量及浸出率（%）Tab.7 Extract content and extraction rate of samples before and after sterilization（%）

3 討論

3.1 高溫瞬時(shí)滅菌因素水平選擇

中藥細(xì)粉按試驗(yàn)設(shè)定的進(jìn)料速率進(jìn)入高溫瞬時(shí)滅菌設(shè)備，攪拌槳帶動(dòng)物料旋轉(zhuǎn)，使物料懸浮于高速流動(dòng)過(guò)熱蒸汽中，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥細(xì)粉的高溫瞬時(shí)滅菌，滅菌后細(xì)粉經(jīng)汽料分離冷卻系統(tǒng)進(jìn)行快速物料分離并急驟冷卻，降低了中藥細(xì)粉中有效成分的流失。進(jìn)料速率、攪拌旋轉(zhuǎn)速率、滅菌溫度、蒸汽壓力、滅菌時(shí)間、物料出口溫度等工藝參數(shù)均會(huì)直接影響滅菌效果和中藥細(xì)粉質(zhì)量，優(yōu)化高溫瞬時(shí)滅菌工藝參數(shù)對(duì)于確保產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。本研究中選取進(jìn)料速率、滅菌溫度和滅菌時(shí)間等關(guān)鍵因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)法對(duì)黃芩高溫瞬時(shí)滅菌工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素預(yù)試驗(yàn)摸索，最終確定正交試驗(yàn)中3個(gè)指標(biāo)的水平。

3.2 正交試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇

滅菌設(shè)備及工藝能否有效實(shí)施不僅要考慮滅菌效果，同時(shí)還需確保所滅菌物料的產(chǎn)品質(zhì)量。2020年版《中國(guó)藥典（四部）》分別對(duì)中藥飲片和非無(wú)菌產(chǎn)品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、大腸埃希菌、沙門(mén)菌及耐膽鹽革蘭陰性菌進(jìn)行了具體規(guī)定，大腸埃希菌和沙門(mén)菌均為不得檢出，同時(shí)中藥飲片中耐膽鹽革蘭陰性菌含菌量通常較低，遂考慮將需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)作為黃芩高溫瞬時(shí)滅菌工藝滅菌效果評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)規(guī)定中藥飲片需氧菌總數(shù)< 105cfu/ g，霉菌和酵母菌總數(shù)< 103cfu/ g，非無(wú)菌含藥材原粉產(chǎn)品需氧菌總數(shù)<104cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)<102cfu/g，故最終將滅菌率作為滅菌效果評(píng)價(jià)指標(biāo)。黃芩苷為黃芩特征成分和主要活性成分，浸出物含量也直接影響著黃芩的產(chǎn)品質(zhì)量，為確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)滅菌前后黃芩苷轉(zhuǎn)移率和浸出率進(jìn)行分析，并將其作為黃芩藥材高溫瞬時(shí)滅菌工藝產(chǎn)品質(zhì)量保障評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)黃芩藥材高溫瞬時(shí)滅菌工藝進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)將微生物限度檢查、黃芩苷含量、浸出物含量等指標(biāo)作為中試驗(yàn)證產(chǎn)品的檢測(cè)指標(biāo)，確保優(yōu)化后的最優(yōu)工藝能滿(mǎn)足黃芩藥材高溫瞬時(shí)滅菌的要求。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中優(yōu)化后的黃芩藥材高溫瞬時(shí)滅菌工藝重復(fù)性好，滅菌效果良好，滅菌后樣品符合2020年版《中國(guó)藥典（四部）》非無(wú)菌含藥材原粉的固體口服給藥制劑項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定，滅菌率達(dá)99.0%，能滿(mǎn)足產(chǎn)品生產(chǎn)需要；同時(shí)滅菌前后黃芩苷及浸出物含量無(wú)明顯變化。本研究中為推進(jìn)高溫瞬時(shí)滅菌新方法在中藥滅菌生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。然而，中藥材種類(lèi)繁多，高溫瞬時(shí)滅菌是否適用于花類(lèi)、葉類(lèi)、果實(shí)類(lèi)、含揮發(fā)油類(lèi)、芳香類(lèi)等中藥材的滅菌，還有待進(jìn)一步論證。