溫翠俠 田聰 王萬洲 張旭

【摘要】目的分析下調(diào)N6-甲基酰胺（m6A）去甲基化酶脂肪組織和肥胖相關(guān)蛋白（FTO）的表達(dá)對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSC）增殖與干性維持的影響。方法構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)FTO表達(dá)的干細(xì)胞株，運(yùn)用CCK-8法檢測下調(diào)FTO對GSC細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞神經(jīng)球形成能力的變化；運(yùn)用體外有限稀釋實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞自我更新能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)FTO對GSC細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示，與對照組相比，下調(diào)FTO表達(dá)后減慢了GSC細(xì)胞生長速度。成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組的GSC神經(jīng)球大小和數(shù)量較對照組顯著減少。體外有限稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)FTO表達(dá)后神經(jīng)球自我更新能力減弱；流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡顯示，下調(diào)FTO表達(dá)后增加了GSC細(xì)胞凋亡率。結(jié)論下調(diào)FTO的表達(dá)可抑制GSC的生長與自我更新能力，靶向FTO可能是清除GSC的潛在策略之一。

【關(guān)鍵詞】FTO；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞；神經(jīng)球；凋亡

【中圖分類號】R739.41【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1672-7770（2024）01-0038-05

Effect of downregulation of RNA demethylase FTO expression on glioblastoma stem cell function WEN Cuixia， TIAN Cong， WANG Wanzhou， et al. XuZhou Institute of Medical Science， Xuzhou 221009， China

Corresponding author： ZHANG Xu

Abstract： ObjectiveTo analyze the effects of down-regulated expression of m6A demethylase FTO on the proliferation and maintenance of glioblastoma stem cells（GSCs）. MethodsFTO knock-down glioma stem cells were generated to detect the effect of down-regulated FTO on GSC cell proliferation. The neurosphere formation ability of two groups of GSC cells was assessed by neurosphere formation experiment. In vitro limited dilution assays were used to examine the effects on self-renewal ability of GSC cells after FTO knockdown. Flow cytometry was used to detect the effect of down-regulated FTO on apoptosis of GSC cells. ResultsThe CCK-8 results showed that compared with the control group， downregulation of FTO expression slowed down the growth rate of GSC cells. The results of the ball formation experiment showed that the size and number of GSC nerve balls in the experimental group were significantly reduced compared to the control group. The results of the in vitro limited dilution experiment showed that the self-renewal ability of the neurosphere was weakened after downregulating FTO expression. Flow cytometry detection of apoptosis showed that downregulation of FTO expression increased the apoptosis rate of GSC cells. ConclusionDownregulating the expression of FTO can inhibit the growth and self-renewal ability of GSC， and targeting FTO may be one of the potential strategies to clear GSC.

Key words： FTO; glioblastoma stem cells; neurospheres; apoptosis

基金項(xiàng)目：徐州市科技前沿引領(lǐng)技術(shù)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（KC21012）

作者單位：221009 徐州，徐州市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所（溫翠俠）；徐州市中心醫(yī)院放療科（溫翠俠）；徐州醫(yī)科大學(xué)徐州臨床學(xué)院（溫翠俠）；徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院（田聰，王萬洲）；徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（張旭）

通信作者： 張旭

膠質(zhì)瘤是最常見、惡性程度最高的成人原發(fā)惡性腦腫瘤，也是病死率最高的人類惡性腫瘤之一，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）惡性程度最高［1］。目前的治療方式仍以最大限度手術(shù)切除為主，術(shù)后輔助放化療，但療效仍不理想。GBM的中位生存期受多種因素影響［2］，往往小于15個(gè)月，生存率低，預(yù)后差［3］。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）應(yīng)用臨床二十余年，是目前臨床上一線的化療藥物。但很大一部分GBM患者對TMZ不敏感，并沒有顯著提高患者的生存［4］。所以迫切需要鑒定GBM新的治療靶點(diǎn)，研發(fā)小分子靶向藥物，為臨床上GBM治療提供更有效的治療方式和策略。

在GBM中存在一小部分具有自我更新和多向分化潛能的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（glioblastoma stem cells，GSC），往往是導(dǎo)致GBM高度耐藥性和放療抵抗的原因之一，和GBM的發(fā)生發(fā)展與復(fù)發(fā)密切相關(guān)［5］。與GBM細(xì)胞系相比，GSC表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲，促進(jìn)血管生成，免疫逃逸等惡性生物學(xué)行為的能力［6］。因此，靶向清除GSC，抑制GSC的增殖及其自我更新能力，有利于提高GBM患者的治療效果，改善其預(yù)后。

N6-甲基酰胺（m6A）是發(fā)生在腺苷堿基N6位點(diǎn)的甲基化，這是哺乳動物mRNA中最常見、最多樣的表觀遺傳修飾方式［7］。越來越多的研究表明，m6A修飾通過調(diào)節(jié)致癌或抑癌基因的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞生長，侵襲遷移與凋亡等生物學(xué)功能［8-9］。脂肪組織和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）是重要的m6A去甲基化酶，也是第一個(gè)被鑒定出的m6A去甲基化酶［10］。研究發(fā)現(xiàn)FTO的高表達(dá)可以導(dǎo)致GBM對TMZ化療抵抗［11］。FTO下調(diào)可促進(jìn)腫瘤的EMT轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤對Wnt信號通路抑制劑的敏感性，此外FTO可以維持白血病干細(xì)胞的自我更新能力［12］。這表明FTO是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，靶向抑制FTO可能是治療腫瘤，提高療效的潛在策略之一。

本研究通過慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定下調(diào)FTO表達(dá)的干細(xì)胞系，評價(jià)了下調(diào)FTO表達(dá)對GSC增殖、自我更新能力及GSC凋亡等生物學(xué)功能的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑與材料從臨床手術(shù)中獲得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者組織，從中分離純化獲得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞GSC。在前期的研究中已驗(yàn)證GSC穩(wěn)定表達(dá)GSC的分子標(biāo)志物CD133和Nestin。細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8）購買于徐州微科曼得生物工程有限公司（Vicmed），F(xiàn)TO抗體購買于Abcam公司，Actin抗體購買于Cell Signaling Technology公司。從上海漢恒生物科技有限公司購買下調(diào)FTO基因表達(dá)的慢病毒sh-FTO及對照sh-NC病毒，EGF和bFGF購買于美國PeproTech公司。干細(xì)胞消化液Accutase、B27和Neurobasal培養(yǎng)基購于美國Thermo公司。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于美國BD Pharmingen公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞GSC接種到含有20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、2% B27的Neurobasal培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)。每隔3 d添加1/3體積的新鮮培養(yǎng)基，待GSC生長成大小適中的神經(jīng)球，用NeuroCult Chemical Dissociation Kit分離神經(jīng)球進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。選取生長良好的GSC用于各種實(shí)驗(yàn)。

1.2.2構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)FTO表達(dá)的干細(xì)胞株取指數(shù)生長期狀態(tài)良好GSC消化稀釋成單細(xì)胞懸液，3×105個(gè)/孔鋪于6孔板，加入病毒液及適量助轉(zhuǎn)劑輕輕混勻。操作后72 h，加入含有3 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基，篩除出被病毒轉(zhuǎn)染上的陽性細(xì)胞，直到熒光顯微鏡下細(xì)胞基本全亮。篩選獲得的陽性GSC-shFTO與GSC-shNC細(xì)胞株應(yīng)用于后續(xù)的WB實(shí)驗(yàn)，檢測侵染的干細(xì)胞中FTO的蛋白表達(dá)水平，確定細(xì)胞株構(gòu)建是否成功。

1.2.3Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)把處于指數(shù)生長狀態(tài)的細(xì)胞消化并吹打?yàn)閼乙?，加入?xì)胞裂解液搖勻后，離心提取上清液并檢測蛋白濃度。加入適量體積的上樣緩沖液，獲得相同濃度的蛋白樣本。依據(jù)配方把聚丙烯酰胺凝膠加入垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，電泳完畢后，用濕電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h后，用抗FTO的一抗4 ℃孵育過夜。第2天TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h后，TBST再次洗膜3次，加入ECL顯影液用蛋白表達(dá)成像系統(tǒng)曝光，檢測FTO蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn)將直徑約200 μm的干細(xì)胞球用Accutase消化成單細(xì)胞懸液，按4 000個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每組重復(fù)3個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24、48、72，96、120 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，避光孵育30～60 min后用酶標(biāo)儀檢測在波長450 nm處的吸光值（D）。存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組D-空白對照D）/（對照組D-空白對照D）×100%。

1.2.5神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)將直徑約200 μm的細(xì)胞球用Accutase消化成單細(xì)胞懸液，按1 000個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每組重復(fù)3個(gè)孔，每3天添加50 μL新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至6～12 d左右。顯微鏡下觀察神經(jīng)球大小及數(shù)量。對含有50多個(gè)細(xì)胞的神經(jīng)球進(jìn)行評分，計(jì)算每孔中神經(jīng)球的數(shù)目，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6體外有限稀釋試驗(yàn)將直徑約200 μm的細(xì)胞球用Accutase消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并且按500，100，20，4，1個(gè)／孔梯度接種于96孔板，每組重復(fù)10個(gè)孔。12 d后，觀察各實(shí)驗(yàn)組腫瘤球形成情況，記錄各實(shí)驗(yàn)組干細(xì)胞成球數(shù)目。極限稀釋法分析使用在線軟件（ttp：//bioinf.wehi.edu.au/ softw/elda/）。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將直徑約200 μm的細(xì)胞球用Accutase消化成單細(xì)胞懸液，按每孔約1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細(xì)胞兩次，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒染色。用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，用流式分析軟件FlowJo分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，所選圖表為重復(fù)實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖。以P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1穩(wěn)定下調(diào)FTO表達(dá)的干細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定通過慢病毒侵染并用嘌呤霉素篩選，獲得下調(diào)FTO表達(dá)的GSC細(xì)胞株。分別命名為FTO穩(wěn)定下調(diào)的實(shí)驗(yàn)組（Sh1與Sh2）及對照組（NC）GSC，顯微鏡下觀察基本所有干細(xì)胞表達(dá)GFP綠色熒光。提取蛋白，通過WB實(shí)驗(yàn)檢測FTO蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組FTO蛋白的表達(dá)量較對照組顯著降低，表明穩(wěn)定下調(diào)FTO蛋白表達(dá)的干細(xì)胞株構(gòu)建成功（圖1）。

2.2下調(diào)FTO的表達(dá)對GSC細(xì)胞增殖的影響為了評估FTO對GSC生存的影響，本研究使用CCK-8法檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組在培養(yǎng)24，48，72，96，120 h后的吸光值，分析干細(xì)胞生存情況。結(jié)果顯示隨著時(shí)間的增加，下調(diào)FTO表達(dá)的干細(xì)胞系生長速率顯著降低，表明下調(diào)FTO表達(dá)能顯著抑制GSC的增殖能力（圖2）。

2.3下調(diào)FTO表達(dá)抑制GSC成球能力本研究將實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞接種6～12 d后，在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)球的大小和數(shù)量。結(jié)果顯示與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的GSC神經(jīng)球的大小和數(shù)量均明顯減少，這說明下調(diào)FTO的表達(dá)會抑制GSC神經(jīng)球形成能力（圖3）。

2.4下調(diào)FTO的表達(dá)能夠有效抑制GSC的自我更新能力本研究采用體外有限稀釋實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)FTO對GSC自我更新能力的影響。將實(shí)驗(yàn)組與對照組分別處理12 d后，顯微鏡下觀察干細(xì)胞成球情況，并計(jì)數(shù)每組的神經(jīng)球數(shù)量。FTO下調(diào)組的干細(xì)胞自我更新能力較對照組顯著降低，表明下調(diào)FTO表達(dá)能有效抑制GSC的自我更新能力（圖4）。

2.5下調(diào)FTO的表達(dá)誘導(dǎo)GSC細(xì)胞凋亡為了評估GSC的凋亡是否受FTO表達(dá)水平的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組的GSC細(xì)胞凋亡情況。流式分析結(jié)果顯示，與對照組相比，下調(diào)FTO表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著增加，凋亡率分別為（9.49±0.72）%和（6.50±0.63）%。以上結(jié)果表明下調(diào)FTO表達(dá)可誘導(dǎo)GSC細(xì)胞凋亡（圖5）。

3討論

GBM以惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)著稱，并且是成人最常見的顱內(nèi)原發(fā)的惡性腫瘤［13］，但其缺乏有效的治療措施，近年來雖然出現(xiàn)免疫治療和電場治療等新型的治療方式［14-17］，但仍不能替代手術(shù)切除加術(shù)后放化療的常規(guī)方案［18-19］。近年研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞具有較高的異質(zhì)性［20］，其自我更新和無限增殖的能力是導(dǎo)致腫瘤放化療耐藥性的重要原因［21-22］。因此，研究針對GSC的調(diào)控靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)相關(guān)的靶向藥，對改善GBM的預(yù)后具有重要的意義。本研究證明了下調(diào)FTO表達(dá)可調(diào)控GSC的細(xì)胞活性、成球、自我更新、增殖和凋亡功能，進(jìn)而抑制GSC的生物學(xué)功能。

m6A修飾是真核生物中最常見的RNA修飾類型，參與多種細(xì)胞內(nèi)生物進(jìn)程。通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)功能［8］。m6A修飾是一個(gè)可逆的動態(tài)修飾過程，包括甲基轉(zhuǎn)移酶（METTL3/14），去甲基化酶（FTO/ALKBH5）等多種蛋白參與調(diào)控［23］。研究發(fā)現(xiàn)敲低METTL3 或METTL14表達(dá)可以顯著抑制GSC 生長、自我更新和腫瘤發(fā)生［24］。而敲除ALKBH5同樣可顯著抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的存活［25］。揭示m6A RNA甲基化修飾的異常調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。FTO是首個(gè)被證明的m6A去甲基化酶［26］，研究發(fā)現(xiàn)抑制FTO的表達(dá)能顯著抑制腫瘤的發(fā)展并延長干細(xì)胞種植小鼠的壽命［27］。另外，F(xiàn)TO抑制劑FB23-2可以顯著抑制異種移植小鼠中人類AML細(xì)胞系和原代細(xì)胞的進(jìn)展［12］。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定下調(diào)FTO表達(dá)的GSC細(xì)胞株，通過WB試驗(yàn)驗(yàn)證了FTO的下調(diào)效率，結(jié)果證實(shí)下調(diào)FTO表達(dá)的干細(xì)胞系構(gòu)建成功。隨后，通過CCK-8、神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)等評價(jià)了敲除FTO對GSC細(xì)胞生存和自我更新能力的影響。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，下調(diào)FTO表達(dá)可顯著抑制GSC細(xì)胞增殖，抑制GSC神經(jīng)球形成，進(jìn)而抑制GSC自我更新能力。以上結(jié)果提示，F(xiàn)TO是腫瘤治療的潛在治療靶點(diǎn)，其抑制劑在臨床轉(zhuǎn)化方面具有很好的潛力。

腫瘤的形成不僅與腫瘤細(xì)胞快速增殖有關(guān)，與腫瘤細(xì)胞死亡速度也密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡參與了腫瘤細(xì)胞的形成與進(jìn)程，是抑制腫瘤細(xì)胞生長的主要生物學(xué)作用，對癌癥發(fā)生起負(fù)調(diào)控的作用［28］。相關(guān)研究報(bào)道，敲除或過表達(dá)FTO基因可誘導(dǎo)CoCl2引起的氧化應(yīng)激，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［28］。同樣發(fā)現(xiàn)，抑制FTO活性可通過調(diào)控多條信號通路如PI3K/AKT/mTOR、MAPK、cAMP信號促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖［29］。既往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO抑制MYC-miR-155/23a簇-MXI1反饋電路進(jìn)而導(dǎo)致GBM細(xì)胞U87的TMZ抵抗［30］，本研究通過流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)檢測到，在GSC細(xì)胞中，下調(diào)FTO表達(dá)可誘導(dǎo)GSC細(xì)胞凋亡。但FTO在GSC中如何調(diào)控細(xì)胞凋亡，自我更新等生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，下調(diào)FTO表達(dá)能夠有效抑制GSC細(xì)胞生存、自我更新、增殖和促進(jìn)GSC細(xì)胞凋亡。本研究為針對FTO靶向清除GSC提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有望提高GBM患者的生存周期。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻(xiàn)］

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（收稿2023-05-14修回2023-07-01）