韓紫薇，趙斗，馬自強(qiáng)，仇燕*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院,河北石家莊 050018；2.新疆冠農(nóng)股份有限公司技術(shù)中心,新疆庫爾勒 841000）

疲勞一般可分為精神疲勞和身體疲勞,肌肉疲勞是由劇烈運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生,會(huì)導(dǎo)致大量自由基的產(chǎn)生和積累進(jìn)而產(chǎn)生氧化損傷。當(dāng)機(jī)體進(jìn)行超負(fù)荷的體力勞動(dòng)未得到及時(shí)緩解時(shí),會(huì)產(chǎn)生一系列的生理變化,大量的代謝產(chǎn)物如乳酸和尿素氮在體內(nèi)不能代謝出去,就會(huì)造成機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力下降,嚴(yán)重時(shí)能損傷機(jī)體器官從而引起抑郁癥、癌癥和帕金森等疾病的產(chǎn)生[1]。有研究表明,腸屏障的損傷和腸道菌群的變化可能導(dǎo)致慢性疲勞綜合征患者疲勞后的嚴(yán)重不適[2],疲勞綜合征往往伴隨著腸道菌群紊亂[3]。因此腸道菌群在疲勞產(chǎn)生的過程中起到非常重要的作用。膳食補(bǔ)充石菖蒲[4]、紅景天[5]、黃芪多糖[6]、番茄紅素[7]等中草藥或食物來源的天然物質(zhì)能有效延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞,其抗疲勞作用主要通過抑制神經(jīng)遞質(zhì)的累積、增加機(jī)體能量物質(zhì)儲(chǔ)備、促進(jìn)脂肪供能、維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、減少代謝物堆積、增強(qiáng)線粒體生物合成以及修復(fù)線粒體損傷來實(shí)現(xiàn)[8]。近年來,抗疲勞功能性飲料成為促進(jìn)疲勞消除和提高機(jī)體機(jī)能的理想產(chǎn)品[9],受到廣泛青睞。

番茄（LycopersiconesculentumMill.）含有豐富的維生素C、番茄紅素和多酚等活性物質(zhì),這些物質(zhì)具有抗氧化、降血脂和抗癌活性,對(duì)人類健康具有積極影響[10]。番茄及其衍生產(chǎn)品是促進(jìn)健康的營(yíng)養(yǎng)食品和微量營(yíng)養(yǎng)素的良好來源。利用釀酒酵母發(fā)酵番茄汁,可改善果汁的物理性質(zhì)和番茄紅素的體外生物可及性[11]。番茄汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后其中的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素、B族維生素含量均有較大提高,且菌體分泌的蛋白酶能夠分解多余的多肽和蛋白質(zhì)從而提高氨基酸種類和含量[12]。利用益生菌（植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌）發(fā)酵的番茄原汁,融合了益生菌和番茄汁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與保健功能,且其口感得到改善[13]。

目前關(guān)于益生菌發(fā)酵番茄汁（probiotic fermented tomato juice,PFTJ）抗疲勞作用的研究未見報(bào)道。因此,本研究通過小鼠負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn),結(jié)合小鼠生化指標(biāo)、骨骼肌中5′-腺嘌呤核苷酸蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1alpha,PGC-1α）基因的表達(dá)水平評(píng)估PFTJ 的抗疲勞效果,并通過腸道菌群群落結(jié)構(gòu)探究其調(diào)節(jié)腸道菌群的功能,以期為功能型番茄發(fā)酵制品的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵番茄汁（經(jīng)植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌充分發(fā)酵后超高溫瞬時(shí)殺菌）:新疆冠農(nóng)股份有限公司。無特定病原體（specific pathogen free,SPF）級(jí)雄性ICR 小鼠:（20±2）g,北京華阜康生物科技股份有限公司,合格證號(hào)SCXK（京）2019-0008,飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25±1）℃,自由飲水進(jìn)食,將小鼠進(jìn)行1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后分組實(shí)驗(yàn)。

紅景天膠囊:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040023）；尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）測(cè)定試劑盒、乳酸（lactic acid,LA）測(cè)定試劑盒、糖原測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）測(cè)定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde,MDA）測(cè)定試劑盒:南京建成生物工程研究所；快速去基因組cDNA 第一鏈合成試劑盒:康維世紀(jì)生物科技股份有限公司；化學(xué)染料法定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）預(yù)混液（無ROX）:莫納生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（RE-52）:賽默飛世爾科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ）:天津市泰斯特儀器有限公司；酶標(biāo)儀（SpectraMAX i3x）:美國(guó)美谷分子儀器有限公司；電子天平（AR124CN）:美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；熒光定量PCR 儀（CFX connectTM）:美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組

將雄性ICR 小鼠隨機(jī)分成4 組:空白對(duì)照組（生理鹽水）、陽性對(duì)照組（紅景天膠囊0.06 g/kg）、PFTJ 低劑量組（5 mg/kg）和高劑量組（15 mg/kg）,每組10 只,實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周?？瞻讓?duì)照組每天灌胃10 mL/kg 的生理鹽水,PFTJ 低劑量組和高劑量組分別灌胃5 mg/kg 和15 mg/kg 的PFTJ,連續(xù)灌胃4 周,每7 d 量取一次體質(zhì)量,按體質(zhì)量變化量調(diào)整灌胃量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理審批單位為河北科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)（批準(zhǔn)號(hào):2022017）。

1.3.2 小鼠負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)

末次灌胃PFTJ 40 min 后進(jìn)行小鼠負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn),將小鼠置于溫度（25±5）℃、水面高25 cm 左右的塑料容器中,并在小鼠尾部負(fù)荷體質(zhì)量10%的鐵塊進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn),以小鼠沉入水面10 s 不能浮出水面的時(shí)間作為負(fù)重力竭游泳時(shí)間[14]。

1.3.3 血清和肌肉組織中生化指標(biāo)的測(cè)定

負(fù)重力竭游泳小鼠休息10 min 后于眼眶靜脈取血,將血液收集到1.5 mL 離心管中,4 ℃、3 000 r/min離心15 min,分離后取血清,置于1.5 mL 離心管,于-20 ℃中保存待測(cè)。按照試劑盒方法測(cè)定BUN 含量和LA 含量。

頸椎脫臼法處死小鼠,取0.25 g 的骨骼肌組織加入2.25 mL 的生理鹽水,冰水浴條件下研磨勻漿,制成質(zhì)量體積比為10%的組織勻漿液,4 ℃、2 500 r/min 下離心10 min,取上清液,按照試劑盒方法測(cè)定糖原和MDA 含量以及SOD 和GSH-Px 活性。

1.3.4 小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）分析

采用RT-qPCR 分析小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1αmRNA 基因的表達(dá)。苯酚-胍鹽法（Trizol）法從骨骼肌中提取總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。PGC-1α正向引物序列為（5′CGATGACCCTCCTCACACCAAAC3′）,反向引物序列為（5′TTGCGACTGCGGTTGTGTATGG3′）；AMPK正向引物序列為（5′CGAGTGTTCGGAGGAGGAGGTC3′）,反向引物序列為（5′GTGGGCTGGTTGCTAGGTAGAAATC3′）。之后進(jìn)行RT-qPCR,qPCR 條件為95 ℃15 min,之后95 ℃10 s、56 ℃30 s 和72 ℃30 s,40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2（-ΔΔCT）方法進(jìn)行。

1.3.5 腸道菌群的測(cè)定

小鼠飼養(yǎng)4 周后每只小鼠收集3～5 粒糞便（每組3 個(gè)平行）,提取糞便DNA、16S RNA V3～V4 可變區(qū)擴(kuò)增,引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACATCHVGGGTWTCTAAT-3′）,之后進(jìn)行高通量測(cè)序。利用UPARSE 軟件對(duì)操作分類單元（operational taxonomic units,OTU）進(jìn)行聚類設(shè)置相似度為97%,通過比對(duì)數(shù)據(jù)庫（比對(duì)閾值為70%）,對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋。其余數(shù)據(jù)處理均在上海美吉生物公司生信云（https://cloud.majorbio.com/）中進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用SPSS Statistics 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,Duncan法進(jìn)行多重差異顯著比較,Origin 2019 作圖,P<0.05表示數(shù)據(jù)有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFTJ 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

小鼠體質(zhì)量變化反映了PFTJ 對(duì)小鼠食欲和健康情況的影響[15]。灌胃4 周各組小鼠的體質(zhì)量變化情況如表1 所示。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化（n=10）Table 1 Change in body weight of mice in each group（n=10）g

由表1 可知,隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng),小鼠的體質(zhì)量呈增加趨勢(shì)。在同一時(shí)間,PFTJ 組與空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組相比均無明顯差異。同時(shí),灌胃期間小鼠未發(fā)現(xiàn)異?；蛩劳銮闆r,結(jié)果表明PFTJ 不會(huì)影響小鼠的健康生長(zhǎng)。

2.2 PFTJ 對(duì)小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間的影響

負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)是評(píng)估抗疲勞能力的動(dòng)物模型之一[16]。游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以反映疲勞程度,運(yùn)動(dòng)耐力的提升是抗疲勞功效的表現(xiàn)。PFTJ 灌胃ICR 小鼠28 d 后,各組小鼠的負(fù)重力竭游泳時(shí)間見表2。

表2 各組小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間（n=10）Table 2 Exhausted swimming time of mice in each group（n=10）min

由表2 可知,與空白對(duì)照組相比,陽性對(duì)照組、PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組的負(fù)重力竭游泳時(shí)間均有所延長(zhǎng),PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組的力竭游泳時(shí)間分別為34.60 min 和38.81 min,較空白對(duì)照組分別提高了22.65%和37.58%,以上結(jié)果表明,PFTJ能延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重力竭游泳時(shí)間,提高運(yùn)動(dòng)耐力,且小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間隨PFTJ 灌胃劑量的升高而延長(zhǎng),PFTJ 具有一定的抗疲勞作用。

2.3 PFTJ 對(duì)小鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影響

疲勞的產(chǎn)生與代謝產(chǎn)物的積累有關(guān),過多的代謝物會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用[17]。高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)會(huì)造成機(jī)體中尿素氮（BUN）和乳酸（LA）的過量積累。當(dāng)運(yùn)動(dòng)將機(jī)體貯存的能量消耗殆盡時(shí)就會(huì)分解肌肉蛋白而產(chǎn)生氨,高濃度的氨會(huì)影響腦組織內(nèi)能量代謝和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞[18]。血液中的氨以BUN 形式存在,是蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物,在肝臟中合成后被血液運(yùn)輸?shù)侥I臟隨尿液排出。在長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,肌肉內(nèi)的氧氣不斷地消耗,會(huì)出現(xiàn)缺氧的現(xiàn)象,這時(shí)會(huì)促進(jìn)糖酵解過程中丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化作用下產(chǎn)生大量的LA,使肌肉和血液中的pH 值降低進(jìn)而影響糖原分解,能量供應(yīng)受阻而造成運(yùn)動(dòng)性疲勞[19]。PFTJ 對(duì)小鼠血清中BUN 含量的影響見圖1。

圖1 PFTJ 對(duì)小鼠血清中尿素氮含量的影響Fig.1 Effect of PFTJ on blood urea nitrogen（BUN）concentration in the serum of mice

由圖1 可知,負(fù)重力竭游泳后空白對(duì)照組小鼠血清中的BUN 含量為9.40 mmol/L,陽性對(duì)照組、PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組的BUN 含量均低于空白對(duì)照組。隨著PFTJ 劑量升高BUN 含量呈下降趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比,PFTJ 高劑量組的BUN 含量顯著下降了27.34%（P<0.05）。

PFTJ 對(duì)小鼠血清中LA 含量的影響如圖2 所示。

圖2 PFTJ 對(duì)小鼠血清中乳酸含量的影響Fig.2 Effect of PFTJ on lactic acid（LA）concentration in the serum of mice

由圖2 可知,與空白對(duì)照組相比,陽性對(duì)照組、PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組的乳酸含量分別下降了4.90%、5.01% 和14.00%,其中PFTJ 高劑量組能顯著降低小鼠體內(nèi)乳酸的產(chǎn)生（P<0.05）。綜上,PFTJ 能夠有效清除劇烈運(yùn)動(dòng)后小鼠體內(nèi)的BUN 和LA,延緩疲勞的產(chǎn)生、增強(qiáng)抗疲勞能力。

2.4 PFTJ 對(duì)小鼠肌糖原含量的影響

肌糖原是機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)的主要能量來源,肌糖原消耗嚴(yán)重會(huì)影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力,尤其是運(yùn)動(dòng)耐受力[20]。劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)使肌糖原迅速分解,從而為肌肉收縮提供能量,所以肌糖原的含量可以很好地反映疲勞程度。PFTJ 對(duì)小鼠肌糖原含量的影響見圖3。

圖3 PFTJ 對(duì)小鼠骨骼肌中肌糖原含量的影響Fig.3 Effect of PFTJ on muscle glycogen content in the skeletal muscle of mice

由圖3 可知,空白對(duì)照組的肌糖原含量為5.28 mg/g,與空白對(duì)照組相比,陽性對(duì)照組、PFTJ 低劑量組和高劑量組肌糖原含量分別顯著提高了44.70%、21.97%和47.35%（P<0.05）。PFTJ 處理組能提高肌糖原含量,為肌肉收縮提供足夠能量,減少糖原消耗,緩解疲勞。Kim 等[21]研究發(fā)現(xiàn),灌喂高劑量鐵皮石斛提取物能降低小鼠運(yùn)動(dòng)期間作為能量來源的糖原的利用,這與本研究結(jié)果相同。

2.5 PFTJ 對(duì)小鼠肌肉組織中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),產(chǎn)生大量自由基[如活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）],降低機(jī)體抗氧化能力,進(jìn)而誘導(dǎo)疲勞產(chǎn)生[1]。SOD、GSH-Px 和CAT 這些抗氧化酶在清除自由基及其代謝產(chǎn)物方面起重要作用,還可以預(yù)防各種疾病,被認(rèn)為是抵抗ROS 的重要防線。PFTJ 對(duì)小鼠肌肉組織中抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響見圖4～圖6。

圖4 PFTJ 對(duì)小鼠SOD 活性的影響Fig.4 Effect of PFTJ on SOD activity in mice

由圖4 可知,空白對(duì)照組小鼠肌肉組織的SOD 活性為16.51 U/mg。與空白對(duì)照組相比,陽性對(duì)照組、PFTJ 低劑量組和高劑量組分別顯著提高了55.00%、29.07% 和76.56%（P<0.05）。由圖5 可知,PFTJ 高劑量組GSH-Px 活性較空白對(duì)照組顯著提高了21.35%（P<0.05）。由圖6 可知,MDA 含量隨PFTJ 劑量的增加而降低,與空白對(duì)照組相比,PFTJ 高劑量組顯著降低了38.06%（P<0.05）。以上結(jié)果表明,PFTJ 能夠提高小鼠肌肉抗氧化酶（SOD 和GSH-Px）活性,降低自由基代謝產(chǎn)物MDA 的積累,且具一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖5 PFTJ 對(duì)小鼠GSH-Px 活性的影響Fig.5 Effect of PFTJ on GSH-Px activity in mice

圖6 PFTJ 對(duì)小鼠MDA 含量的影響Fig.6 Effect of PFTJ on MDA content in mice

2.6 PFTJ 對(duì)小鼠骨骼肌中AMPK 和PGC-1α 基因表達(dá)的影響

AMPK/PGC-1α 是調(diào)控能量代謝的關(guān)鍵信號(hào)通路,在肌肉運(yùn)動(dòng)和物質(zhì)利用中發(fā)揮重要作用。AMPK 在運(yùn)動(dòng)疲勞時(shí)被迅速激活,PGC-1α 作為AMPK 的重要下游靶分子,可直接被AMPK 磷酸化,在線粒體生物發(fā)生中起關(guān)鍵作用[20]。PFTJ 對(duì)小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α基因表達(dá)的影響見圖7。

圖7 PFTJ 對(duì)小鼠骨骼肌中AMPK 和PGC-1α 基因相對(duì)表達(dá)的影響Fig.7 Effects of PFTJ on the mRNA relative genes expression of AMPK and PGC-1α in the skeletal muscle of mice

由圖7 可知,與空白對(duì)照組相比,陽性對(duì)照組和PFTJ 處理組小鼠肌肉中AMPK和PGC-1α的mRNA表達(dá)水平均有所提高。隨著PFTJ 劑量的增加,AMPK和PGC-1α的表達(dá)水平增加。與空白對(duì)照組相比,陽性對(duì)照組AMPK和PGC-1α的mRNA 表達(dá)水平分別提高了38.71%和80.95%,PFTJ 低劑量組和高劑量組小鼠骨骼肌AMPK的表達(dá)水平分別顯著提高了83.40%和231.90%,PGC-1α的mRNA 表達(dá)水平分別顯著提高了160.60% 和417.87%（P<0.05）。由此可見,PFTJ 可誘導(dǎo)AMPK和PGC-1α表達(dá)水平的升高,促進(jìn)線粒體的合成,從而增加ATP 的產(chǎn)生,延緩疲勞。Wen 等[7]發(fā)現(xiàn)番茄紅素可以激活A(yù)MPK/PGC-1α 調(diào)控通路,促進(jìn)線粒體的生物合成,使快收縮肌肉纖維向慢收縮肌肉纖維的轉(zhuǎn)變,慢收縮肌肉纖維能夠高效利用氧合成ATP 維持肌肉收縮,增強(qiáng)骨骼肌的疲勞抗性。

2.7 PFTJ 對(duì)小鼠腸道菌群多樣性的影響

腸道菌群多樣性及其對(duì)人體的生理和病理之間的關(guān)系現(xiàn)已得到廣泛研究證實(shí)。利用香菜類黃酮[20]、鐵皮石斛多糖[22]進(jìn)行飲食干預(yù)調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群,增加菌群多樣性,可以提高抗疲勞能力。腸道菌群Alpha多樣性分析能反映生物群落的豐富度和多樣性。Chao指數(shù)主要反映微生物群落的豐富度,數(shù)值越大,表明群落中含有OTU 數(shù)目越多,群落的豐富度越大；Shannon指數(shù)反映微生物群落的多樣性,數(shù)值越大,表明群落中多樣性越高。PFTJ 對(duì)小鼠腸道菌群多樣性的影響見圖8。

圖8 PFTJ 對(duì)小鼠腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)的影響Fig.8 Effects of PFTJ on Alpha diversity indexes of the intestinal microflora in mice

由圖8 可知,空白對(duì)照組小鼠Chao 和Shannon 指數(shù)分別為226.90 和1.36,陽性對(duì)照組小鼠Chao 和Shannon 指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）。與空白對(duì)照組相比,PFTJ 低劑量組和PFTJ 高劑量組小鼠Chao 和Shannon 指數(shù)均有所提高,其中PFTJ 高劑量組小鼠Chao 和Shannon 指數(shù)分別提高了22.24% 和111.76%。以上結(jié)果表明,PFTJ 能提高Chao 和Shannon 指數(shù),改善小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性,并隨著PFTJ 劑量呈現(xiàn)一定劑量依賴趨勢(shì)。

Beta 多樣性是利用每個(gè)樣品序列的進(jìn)化關(guān)系和豐度信息來計(jì)算樣本之間的距離,以反映樣本（組）之間是否存在顯著的微生物群落差異[23]。主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）是Beta 多樣性常用的分析方法。小鼠腸道菌群在OTU 水平上的PCoA 分析如圖9 所示。

圖9 各組小鼠腸道菌群Beta 多樣性主坐標(biāo)分析Fig.9 PCoA diagram of Beta diversity of the intestinal microflora in mice of each group

由圖9 可知,空白對(duì)照組與陽性對(duì)照組、PFTJ 低劑量組和高劑量組均產(chǎn)生分離,而PFTJ 高劑量組與低劑量組距離靠近,說明PFTJ 可以改變小鼠腸道菌群的組成。PFTJ 高、低劑量組的分布更為集中,且PFTJ 劑量越高各組樣本之間距離越小,個(gè)體差異越小,說明給予PFTJ 可以提高小鼠腸道菌群的進(jìn)化相似性,通過PFTJ 干預(yù)能夠使小鼠建立新的腸道菌群環(huán)境。馮瑞方等[24]利用牛骨膠原蛋白肽干預(yù)Balb/c 小鼠4 周以提高小鼠抗疲勞能力,發(fā)現(xiàn)主成分分析在PC2 軸（解釋度為15.45%）上,對(duì)照組和肽干預(yù)組間菌群無交叉,這與本研究結(jié)果相似。

2.8 小鼠腸道菌群的科、屬水平物種組成分析

小鼠腸道菌群的科、屬水平物種組成分析見圖10、圖11。

圖10 PFTJ 對(duì)小鼠腸道菌群科水平物種組成的影響Fig.10 Effect of PFTJ on the species composition of the intestinal microflora in mice at family level

圖11 PFTJ 對(duì)小鼠腸道菌群屬水平物種組成的影響Fig.11 Effect of PFTJ on the species composition of the intestinal microflora in mice at genus level

由圖10、圖11 可知,利用PFTJ 進(jìn)行干預(yù)后小鼠腸道菌群發(fā)生了變化。在科水平上乳桿菌科（Lactobacillaceae）和Muribaculaceae 科的相對(duì)豐度上調(diào),丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）的相對(duì)豐度下調(diào)。在屬水平上,乳酸桿菌屬（Lɑctobɑcillus）和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe相對(duì)豐度上調(diào),而糞桿菌屬（Fɑecɑlibɑculum）和雙歧桿菌屬（Bifidobɑcterium）則下調(diào)。有研究表明,增加腸道微生物群乳酸桿菌屬的豐度可以提高腸道內(nèi)短鏈脂肪酸（short chain fat acid,SCFA）的濃度[25],對(duì)于調(diào)節(jié)腸道菌群起到了積極作用。牛骨膠原蛋白肽能夠明顯上調(diào)小鼠腸道菌群中norank_f_Muribɑculɑceɑe的相對(duì)豐度,提高小鼠疲勞能力[24]。norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe的豐度與健康小鼠糞便中富集的代謝產(chǎn)物呈正相關(guān),可能是一種富含于健康腸道環(huán)境中的細(xì)菌[26]。在PFTJ 干預(yù)后,小鼠腸道中乳酸桿菌屬和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe相對(duì)豐度上調(diào),由于這兩種有益菌對(duì)增加SCFA 和腸道健康有積極作用,推測(cè)其相對(duì)豐度的提高可能與PFTJ 的抗疲勞作用有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

機(jī)體疲勞的產(chǎn)生機(jī)制主要包括代謝產(chǎn)物積累理論、能量消耗理論和自由基理論[27]。細(xì)胞無氧呼吸過程中糖代謝會(huì)產(chǎn)生LA,蛋白質(zhì)代謝水解加強(qiáng)則會(huì)產(chǎn)生氨,經(jīng)肝循環(huán)形成尿素,最后形成BUN,體內(nèi)LA 和BUN 這兩種產(chǎn)物積累越多越容易產(chǎn)生疲勞。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFTJ 可以降低LA 和BUN 含量,提高機(jī)體的疲勞耐受。根據(jù)“能量消耗理論”,運(yùn)動(dòng)開始時(shí)消耗細(xì)胞中的葡萄糖,血糖降低,肌糖原分解進(jìn)行有氧呼吸,當(dāng)肌糖原大量消耗而得不到及時(shí)補(bǔ)充,便會(huì)導(dǎo)致機(jī)體疲勞。PFTJ 能夠提高小鼠肌糖原水平,且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。自由基被認(rèn)為是導(dǎo)致機(jī)體疲勞的主要因素,過量的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生過量的自由基,破壞蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu),攻擊生物膜致使脂質(zhì)過氧化生成MDA,造成氧化應(yīng)激損傷,引發(fā)肌肉疲勞。細(xì)胞的抗氧酶包括SOD、GSH-Px 等,能清除過多的自由基以維持機(jī)體氧化抗氧化平衡。高劑量PFTJ 能夠顯著提高SOD 和GSH-Px 的活性以清除自由基避免細(xì)胞受損,同時(shí)降低MDA 含量。AMPK/PGC-1α 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)缺氧和能量代謝過程中起著非常重要的作用。激活此通路可促進(jìn)線粒體生物合成緩解細(xì)胞缺氧,修復(fù)氧化損傷。在本研究中發(fā)現(xiàn)高劑量PFTJ 能顯著提高小鼠骨骼肌中AMPK和PGC-1α的mRNA 表達(dá)水平,進(jìn)而提高PGC-1α的轉(zhuǎn)錄活性,為細(xì)胞提供能量。

腸道菌群被稱為機(jī)體的“第二基因組”,腸道菌群多樣性分析已成為近年來研究健康與疾病的新視角[20]。劇烈運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生過量自由基造成運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激損傷,增加有害代謝物沉積,誘發(fā)疲勞加重,可能還會(huì)導(dǎo)致腸道菌群多樣性降低,致病菌相對(duì)豐度升高。本研究發(fā)現(xiàn)PFTJ 能夠提高腸道菌群多樣性,促進(jìn)乳酸桿菌屬和norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe生長(zhǎng),抑制丹毒絲菌科。在屬水平上,PFTJ 促進(jìn)了產(chǎn)SCFA 的乳桿菌屬的大量增殖,而短鏈脂肪酸可以改善葡萄糖的代謝、吸收和轉(zhuǎn)移,并有助于緩解疲勞[28]；同時(shí)PFTJ 提高了腸道有益菌屬norɑnk_f_Muribɑculɑceɑe的豐度。

綜上所述,PFTJ 通過減少疲勞相關(guān)代謝物的堆積,抑制糖原消耗增強(qiáng)能量?jī)?chǔ)備,還可以調(diào)節(jié)氧化相關(guān)酶以減緩氧化應(yīng)激,激活A(yù)MPK/PGC-1α 通路來緩解疲勞。PFTJ 干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),有助于產(chǎn)SCFA 腸道微生物群直接獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),以達(dá)到更好的抗疲勞效果。PFTJ 有望成為抗疲勞、調(diào)節(jié)腸道菌群的新型保健功能性飲料原料,但其抗疲勞與腸道菌群的關(guān)系有待進(jìn)一步通過代謝組學(xué)和宏基因組學(xué)的方法進(jìn)行深入研究。