王迎香，劉金洋，夏 凱，楊宗玲，丁振江，張子陽，曹亞洲，柳 嘉，段盛林,*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，功能主食創(chuàng)制與慢病營養(yǎng)干預(yù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100020；2.西藏金谷農(nóng)業(yè)高科有限公司，西藏拉薩 850000）

全營養(yǎng)配方食品是可作為單一營養(yǎng)來源滿足目標(biāo)人群營養(yǎng)需求的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品，產(chǎn)品形態(tài)以粉劑和乳劑最為常見。其中乳劑使用前無需進(jìn)行沖調(diào)，使用場景更加便捷[1]。全營養(yǎng)乳是由人體所需的宏量營養(yǎng)素（蛋白質(zhì)、碳水化合物、油脂）、微量營養(yǎng)素（礦物質(zhì)、維生素）、以及膳食纖維等可選擇成分通過與水混合、剪切、均質(zhì)和滅菌等工藝制備的乳液[2-3]。全營養(yǎng)乳是針對進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)人群對營養(yǎng)素或膳食的特殊需要，專門加工而成的乳液食品，可有效改善體弱、長期營養(yǎng)不良、長期臥床病人、老年人等人群的營養(yǎng)狀況[4-8]。

全營養(yǎng)乳是水相和油相通過乳化劑而形成的水包油體系[9-12]，其中乳化劑在避免水相和油相之間的相分離方面起著重要作用。乳化劑主要有皮克林乳化劑和傳統(tǒng)乳化劑。皮克林乳化劑是指吸附在油水界面處不溶于水或微溶于水的微米或納米固體顆粒，包括多糖顆粒、蛋白質(zhì)顆粒、脂肪顆粒和無機(jī)顆粒等；傳統(tǒng)乳化劑是指天然或合成的具有兩親性的化合物，包括磷脂（Phospholipid，PL）、蔗糖脂肪酸酯、吐溫和聚甘油酯等。食品中常用的皮克林乳化劑主要有辛烯基琥珀酸淀粉顆粒（Octenyl succinic acid starch，OS）和玉米醇溶蛋白顆粒（Zein）等，它們能不可逆地吸附在油水界面，形成不易受pH、離子強(qiáng)度、溫度等環(huán)境因素影響的乳化穩(wěn)定體系[13-14]。食品中常用的傳統(tǒng)乳化劑主要有PL、單雙脂肪酸甘油酯和檸檬酸脂肪酸酯等，天然PL 乳化劑因具有更好的生物相容性和更高的安全性而受到廣泛的應(yīng)用。

乳化劑因其性質(zhì)不同而使乳液表現(xiàn)出不同的特性。研究表明，不同類型的乳化劑（大豆蛋白分離物、酪蛋白酸鈉、吐溫20 和磷脂）對乳液體外消化程度和營養(yǎng)素生物可及性具有影響[15]。消化主要發(fā)生在胃和小腸中。胃內(nèi)的消化是由胃蛋白酶和胃脂肪酶水解，而在小腸內(nèi)則是由胰蛋白酶和胰脂肪酶水解。其中，脂肪酶必須吸附到液滴表面，以便它能夠接近液滴內(nèi)所含的脂質(zhì)底物[16-18]。乳化劑是一種表面活性化合物，具有親脂性和親水性。因此，最初包裹食物中脂滴的乳化劑分子的性質(zhì)可能會影響乳化劑在胃腸道中的行為[19-25]。此外，乳化劑的性質(zhì)將影響脂滴在胃腸道內(nèi)合并和降解的敏感性，從而改變暴露于脂肪酶的脂的總表面積[26-27]，最終影響脂質(zhì)的消化和吸收。當(dāng)脂質(zhì)被攝入時(shí)，它在通過胃腸道時(shí)可能會發(fā)生化學(xué)和結(jié)構(gòu)組織的變化[28-30]。但目前對于傳統(tǒng)乳化劑和皮克林顆粒乳化的全營養(yǎng)乳的體外消化行為的研究較少。

本研究旨在通過采用不同乳化劑OS、Zein 和PL制備全營養(yǎng)乳，研究其在體外口腔胃腸道中的消化特性（粒徑分布、zeta 電位和微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律）以及全營養(yǎng)乳的脂質(zhì)消化率，為基于Pickering 乳化劑和傳統(tǒng)乳化劑的全營養(yǎng)乳的消化吸收提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糊精、OS 中柏興業(yè)食品科技有限公司；酪蛋白酸鈣 新東康營養(yǎng)科技有限公司；菊粉、低聚半乳糖 云浮市新金山生物科技股份有限公司；大豆膳食纖維 魯發(fā)信德生物科技有限公司；復(fù)合穩(wěn)定劑（結(jié)冷膠、卡拉膠、微晶纖維素） 阿澤雷斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；復(fù)配宏量礦物質(zhì)元素（鈉、鉀、鎂、磷、氯）、復(fù)配微量礦物質(zhì)元素（鐵、銅、碘、鋅、錳、硒）、復(fù)配維生素（維生素A、D、E、K1、B1、B2、B6、B12、煙酸、泛酸、葉酸、維生素C、生物素） 江蘇科倫多食品配料有限公司；葵花籽油、大豆油、PL 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Zein 上海興隆生物科技有限公司；NaCl、KCl、MgCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、HCl、NaOH、NaHCO3、KH2PO4、（NH4）2CO3、CH3COONa 分析純，北京化工廠；唾液淀粉酶（＞5 U/mg）、胃蛋白酶（＞250 U/mg）、胰酶（4×USP）、胰脂肪酶（＞20000 U/mg） 美國Sigma-Aldrich 公司；膽鹽 上海麥克林生化科技有限公司。

AL204 電子天平、FE20 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；D2010W 電動攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；T25 digital ULTRA TURRAX 分散機(jī) 德國IKA 公司；HOMOLAB 2 高壓均質(zhì)機(jī) 意大利FBF 公司；YXQ-LS30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；907 自動電位滴定儀 瑞士萬通中國有限公司；Multistirrer digital 15 水浴循環(huán)磁力攪拌器意大利VELP 公司；S3500 激光粒度分析儀 美國Microtrac 公司；ZEN3700zeta 電位儀 英國馬爾文公司；CKX41 倒置顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 全營養(yǎng)乳的制備 乳液的制備參照武林賀等[31]、Shimokawa 等[32]、Remanan 等[33]和Bao 等[34]的方法，并做相應(yīng)的修改。將12%糊精、5%酪蛋白酸鈣、0.6%菊粉、1.3%低聚半乳糖、1%大豆膳食纖維、0.05%復(fù)合穩(wěn)定劑（結(jié)冷膠、卡拉膠、微晶纖維素）、0.6%復(fù)配礦物質(zhì)和0.05%復(fù)配維生素加入超純水中攪拌均勻形成水相，用1% KOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0。稱取葵花籽油、大豆油（14:11）加熱至60 ℃混勻形成油相。緩慢將3%油相加入水相，高速剪切3 min（7000 r/min）形成粗乳液，用蒸餾水定容至100 mL。將粗乳液在50 MPa 壓力下高壓均質(zhì)1 次后進(jìn)行灌裝，121 ℃滅菌15 min，冷卻制得乳液。其中，將1% Zein 或OS 加入到糊精溶液中制備的乳液分別為Zein 基Pickering 全營養(yǎng)乳和OS 基Pickering 全營養(yǎng)乳，將1% PL 加入到油脂混合液中制備的乳液為PL 傳統(tǒng)全營養(yǎng)乳。

1.2.2 體外消化 體外消化參照INFOGEST 靜態(tài)消化模型[35-37]，并稍加修改。采用體外三個(gè)階段的模擬消化模型（口腔、胃、小腸）來研究各種乳液的消化特性[38-39]。

1.2.2.1 模擬消化液的配制 參考Minekus 等[40]的方法分別制備模擬口腔消化液（Simulated salivary fluid，SSF）、模擬胃消化液（Simulated gastric fluid，SGF）和模擬腸消化液（Simulated intestinal fluid，SIF）。

1.2.2.2 體外靜態(tài)消化模型的構(gòu)建 口腔消化階段：將SSF 與乳液樣品在37 ℃下預(yù)熱10 min，取20 mL預(yù)熱的SSF 和20 mL 乳液樣品以1:1（v:v）混合，然后迅速用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)混合液pH7.0，混合液被放置于37 ℃的恒溫水浴振蕩器中以100 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩2 min，模擬口腔消化階段。本階段，α-淀粉酶在終消化體系的濃度為75 U/mL。

胃消化階段：將SGF 在37 ℃下預(yù)熱10 min，取40 mL 預(yù)熱的SGF 和40 mL 口腔消化液以1:1（v:v）混合，然后迅速用2 mol/L HC1 調(diào)節(jié)混合液pH至2.0，混合液被放置于37 ℃的恒溫水浴振蕩器中以100 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩2 h，模擬胃消化階段。本階段，胃蛋白酶在終消化體系的濃度為2000 U/mL。

小腸消化階段：將SIF 在37 ℃下預(yù)熱10 min，取80 mL 預(yù)熱的SIF 和80 mL 胃消化液以1:1（v:v）混合，然后迅速用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)混合液pH 至7.0，混合液被放置于37 ℃的恒溫水浴振蕩器中以100 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩2 h，模擬小腸消化階段。本階段，胰脂肪酶在終消化體系的濃度為2000 U/mL，膽鹽在終消化體系的濃度為10 mmol/L。

采用上述口腔、胃和小腸的體外靜態(tài)消化模型模擬乳液在體內(nèi)的消化過程，研究乳液的消化特性。實(shí)驗(yàn)過程中始終維持消化體系處于37 ℃。

1.2.3 粒徑測定 用激光粒度分析儀測定乳液原液及各消化階段的粒徑及粒徑分布。采用濕法測定，水的折射率設(shè)置為1.33[33]。

1.2.4 zeta 電位測定 使用zeta 電位儀測定乳劑的電位。在測定之前，乳液分別用蒸餾水、模擬胃液或模擬腸液稀釋10 倍[24]。

1.2.5 微觀結(jié)構(gòu)觀察 使用光學(xué)顯微鏡觀察乳液的微觀形態(tài)[28]。滴一滴樣品在載玻片上，用蓋玻片蓋住，在40×10 放大倍數(shù)下觀察，用數(shù)碼相機(jī)（Olympus DP22）拍攝圖像。

1.2.6 游離脂肪酸釋放率測定 在腸道消化階段，由于脂肪酶的作用，乳液中的油從甘油三酯和甘油二酯轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA）。這些FFA 的釋放是樣品pH 降低的原因，使用pH-stat 法模擬小腸消化，用0.1 mol/L NaOH 溶液滴定小腸消化液，通過計(jì)算小腸消化階段pH 保持在7.0 時(shí)NaOH消耗的總體積[41]，按照以下公式計(jì)算得到乳液脂質(zhì)消化過程中FFA 的釋放率。

式中：FFA 釋放率表示游離脂肪酸的釋放率，%；V 表示腸消化過程中消耗的NaOH 體積，L；c 表示NaOH 溶液的濃度，0.1 mol/L；M 表示油相相對分子質(zhì)量（255.682）；W 表示腸相所含油脂的總質(zhì)量，0.52 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 20 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（P＜0.05 為差異顯著），采用OriginPro 8.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳化劑制備的乳液消化前后的粒徑分布

消化過程中，酶吸附到油水界面水解液滴的能力與液滴大小相關(guān)[42]。液滴越大，油水界面的表面積越小，酶吸附的可能性就越大；液滴越小，油水界面的表面積越大，酶吸附的可能性就越小[43]。因此，液滴大小可影響消化速率。

圖1 為不同乳化劑制備的原液、口腔、胃、小腸消化階段粒徑的變化和粒徑分布。如圖1a 所示，由Zein、OS、PL 制備的乳液的粒徑分別為：29.94、22.95、26.74 μm。模擬消化過程中，三種乳液粒徑的變化趨勢一致，呈先增大后減小的趨勢，這主要是因?yàn)槲钢休^低的pH 和較高離子強(qiáng)度導(dǎo)致乳液的穩(wěn)定性下降，液滴發(fā)生不同程度的絮凝或聚集，粒徑增大。OS 乳液的平均粒徑由22.95 μm 增加到27.65 μm，Zein 乳液由29.94 μm 增加到30.89 μm，PL 乳液由26.74 μm 增加到29.62 μm，說明Zein 乳液和PL 乳液中的液滴與脂肪酶接觸的可能性大于OS 乳液。與Zein 乳液相比，OS 乳液在口腔中的平均粒徑顯著增大（P＜0.05），由22.95 μm 增加到27.72 μm，由圖1c可觀察到相似的結(jié)果，乳液在口腔消化階段粒徑分布的峰向右偏移且出現(xiàn)多峰形式，說明其液滴粒徑變大，這是由于口腔消化階段唾液淀粉酶的存在，淀粉類乳化劑被唾液淀粉酶水解，從而導(dǎo)致乳液粒徑增大[44]。Zein 乳液在胃中的粒徑分布呈現(xiàn)多峰模式（圖1b），說明其液滴發(fā)生了一定程度的聚集，這是由于模擬胃消化過程中胃蛋白酶的消化作用，蛋白類乳化劑可能被胃蛋白酶水解，導(dǎo)致乳液中液滴之間發(fā)生絮凝甚至聚結(jié)[45]；PL 乳液在胃中呈均一單峰模式（圖1d），說明其在胃消化階段后大部分液滴被水解消化，以上結(jié)果說明胃消化階段PL 傳統(tǒng)全營養(yǎng)乳脂質(zhì)消化程度大于Pickering 全營養(yǎng)乳。

圖1 不同乳化劑制備的原液和各個(gè)消化階段的粒徑變化Fig.1 Particle size changes of emulsion prepared with different emulsifiers at initial and various digestion stages

2.2 不同乳化劑制備的乳液消化前后的zeta 電位

zeta 電位是表征乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，液滴表面的高電位值可與臨近液滴產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電斥力，從而防止液滴的絮凝。液滴表面的電位值不僅取決于表面電荷的類型和濃度[46]，還取決于周圍液體中離子的類型和濃度[47]。通過zeta 電位測量評估了乳化劑類型和體外消化階段液滴表面電荷的變化。不同乳化劑因含有不同的表面官能團(tuán)而產(chǎn)生不同的電位值。另外，吸附在液滴界面上的粒子的電荷是皮克林乳液表面電荷形成的主要原因[22]。如圖2 所示，Zein、OS 和PL 原液呈現(xiàn)出不同的負(fù)電荷（分別為-11.53、-18.03、-16.4 mV），這些結(jié)果與之前的研究一致[48-50]。模擬口腔消化階段，與原液相比，Zein 包被液滴上的電荷量幾乎沒有變化，而OS 和PL 包被液滴上的電荷量有明顯的下降，電荷的這種變化可能是由于模擬口腔液中離子的存在而產(chǎn)生的靜電屏蔽效應(yīng)[51]，也可能是由于唾液淀粉酶與液滴表面的相互作用[24]。模擬胃消化階段，三種乳液都由負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾?，這可能是由于胃液中較低的pH 和較高離子強(qiáng)度所致。Zein 乳液和PL 乳液的電位絕對值明顯降低，OS 乳液的電位絕對值有所增加，說明Zein 乳液和PL 乳液在模擬胃消化階段的穩(wěn)定性弱于OS 乳液，這可能是由于胃蛋白酶水解了Zein 乳化劑，使液滴穩(wěn)定性下降甚至發(fā)生聚集，也可能是因?yàn)樗嵝詶l件誘導(dǎo)了Zein 和PL 包被的液滴的橋接絮凝[23]。模擬小腸消化階段，三種乳液都具有相對高的負(fù)電荷，與原液相當(dāng)，這可能是因?yàn)橹|(zhì)消化過程中存在的各種陰離子顆粒（未消化的脂滴、囊泡或膠束）以及這些顆粒表面含有的來自腸液或脂質(zhì)消化產(chǎn)物（膽汁、胰酶、游離脂肪酸），都可能對乳液的zeta 電位產(chǎn)生影響[52]。消化過程中，酶解、新物質(zhì)形成、成分之間的相互作用等也會導(dǎo)致乳液中液滴的界面性質(zhì)發(fā)生變化，改變其電荷[53]。另外，腸液pH為中性，與未消化的原液相近，這可能是獲得相似zeta 電位值的另一個(gè)原因[54]。模擬小腸消化階段，Zein 乳液、OS 乳液、PL 乳液的zeta 電位值分別為：-14.53、-19.90、-18.80 mV，說明Zein 乳液中的液滴被酶水解的程度大于OS 乳液和PL 乳液。

圖2 不同乳化劑制備的原液和各個(gè)消化階段的zeta電位變化Fig.2 Zeta potential changes of emulsion prepared with different emulsifiers at initial and various digestion stages

2.3 不同乳化劑制備的乳液消化前后的微觀形態(tài)

利用光學(xué)顯微鏡對Zein 乳液、OS 乳液、PL 乳液消化前后的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。模擬體外消化過程中，不同乳化劑制備的乳液的微觀結(jié)構(gòu)具有較大差異（圖3）。Zein 乳液、OS 乳液、PL 乳液中的油滴都呈現(xiàn)均勻分散的狀態(tài)。模擬口腔消化階段，Zein 乳液和PL 乳液中的油滴發(fā)生了輕微的聚集現(xiàn)象，而OS 乳液發(fā)生了明顯的聚集，這也和粒徑的變化趨勢一致。模擬胃消化階段，三種乳液中油滴的聚集程度進(jìn)一步加劇，其中Zein 乳液中油滴的聚集最為明顯，說明在胃消化過程中胃蛋白酶對Zein 的水解使其從油水界面脫去，使液滴逐漸聚結(jié)形成大油滴，增大了小腸中胰脂肪酶與油脂的接觸面積[45]。同時(shí)，PL 乳液中油滴的絮凝現(xiàn)象明顯大于OS 乳液，說明在胃消化過程中Zein 乳液和PL 乳液中的油滴比OS 乳液更容易被水解消化。模擬小腸消化階段，三種乳液中觀察到了更大的油滴顆粒，其他關(guān)于乳液體外消化的研究中也觀察到了類似的現(xiàn)象[55]，這可能與乳液被模擬小腸消化液稀釋、甘油三酯被胰脂肪酶水解以及脂質(zhì)消化產(chǎn)物進(jìn)入混合膠束中有關(guān)[38]。

圖3 不同乳化劑制備的原液和各個(gè)消化階段的微觀形態(tài)變化Fig.3 Morphological changes of emulsion prepared with different emulsifiers at initial and various digestion stages

2.4 不同乳化劑對乳液FFA 釋放的影響

采用pH-stat 法模擬乳液在小腸中的消化過程，探究不同乳化劑對乳液FFA 釋放的影響。如圖4 所示，三種乳液之間脂質(zhì)消化的初始速率存在差異。10 min 內(nèi)，Zein 乳液和PL 乳液的FFA 初始釋放速度相似且快于OS 乳液，而PL 乳液在10 min 之后便達(dá)到平衡，說明其表現(xiàn)為快速釋放不利于油脂的持續(xù)消化和吸收。10～30 min，Zein 乳液和OS 乳液的FFA 釋放速度相似且緩慢，而OS 乳液在30 min 之后便達(dá)到平衡。模擬小腸消化過程中，Zein 乳液在2 h 后仍未達(dá)到平衡，說明Zein 穩(wěn)定的乳液表現(xiàn)出持續(xù)釋放的特性，更利于油脂的持續(xù)消化和吸收，其原因可能是胃中的胃蛋白酶和小腸中的胰蛋白酶對Zein 的水解作用導(dǎo)致油滴的聚集和暴露，增加了胰脂肪酶的作用時(shí)間[46,56]，表現(xiàn)為FFA 的持續(xù)釋放。盡管OS 乳液在模擬口腔條件下，有被唾液淀粉酶水解的趨勢，但由于作用時(shí)間太短，導(dǎo)致其水解程度較低，暴露的油滴相比Zein 乳液更少，因此其釋放率更低。與Pickering 全營養(yǎng)乳相比，PL 乳液在模擬胃條件下油滴絮凝聚集的現(xiàn)象更明顯，在胃中的水解程度可能更高，所以其在小腸階段FFA 釋放率表現(xiàn)為最低，也可能與卵磷脂作為乳化劑的陰離子性質(zhì)對脂肪酶的抑制作用有關(guān)[29]。此外，由Zein、OS、PL 乳化劑制備的乳液在模擬小腸消化階段的FFA 釋放率分別為：20.54%、17.21%、14.29%，三種乳液中脂質(zhì)的消化程度依次為Zein 乳液＞OS 乳液＞PL 乳液，說明Pickering 全營養(yǎng)乳較傳統(tǒng)全營養(yǎng)乳的脂質(zhì)消化速率更高。此外，Zein 乳液中的FFA 表現(xiàn)為持續(xù)釋放，更有利于油脂的體外消化和吸收。

圖4 不同乳液在小腸消化過程中FFA 釋放率Fig.4 FFA release rate of different emulsion during intestinal digestion

3 結(jié)論

本研究通過體外模擬消化研究了Pickering（OS 和Zein）全營養(yǎng)乳和傳統(tǒng)（PL）全營養(yǎng)乳消化特性。研究結(jié)果表明，全營養(yǎng)乳的消化速率和消化程度與乳化劑的類型有關(guān)，Zein 全營養(yǎng)乳在模擬消化過程中表現(xiàn)為消化程度最大，這些變化可以從粒徑、粒徑分布、zeta 電位以及微觀結(jié)構(gòu)的變化來證明。脂滴在模擬口腔胃腸道不同區(qū)域的電荷和聚集穩(wěn)定性取決于包裹的乳化劑。小腸內(nèi)脂質(zhì)消化速率和程度也取決于乳化劑類型，Pickering 全營養(yǎng)乳的脂質(zhì)消化速率高于傳統(tǒng)全營養(yǎng)乳，其中Zein 包裹的脂滴的脂質(zhì)消化速率高于OS 乳液且表現(xiàn)為持續(xù)釋放。本研究有助于將Zein、OS 應(yīng)用于具有高生物利用度的親脂性生物活性成分的Pickering 全營養(yǎng)乳化體系的設(shè)計(jì)與開發(fā)。

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