吳改萍，余涵，張向東，劉海鳳，朱曉謙，任芳芳

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院眼科，河南 新鄉(xiāng) 453000

干眼是由淚膜穩(wěn)態(tài)失衡和眼表刺激癥狀組成的多因素眼表疾病，可伴有眼表炎癥和損傷以及神經(jīng)感覺異常[1]。世界范圍內(nèi)干眼病發(fā)病率大約在5.5%～33.7%，我國干眼的發(fā)病率為21%～30%，女性和老年人群是干眼多發(fā)人群[2]。干眼常見的眼部癥狀有干澀感、異物感、燒灼感、眼紅、畏光、疲勞感和視物模糊等，嚴(yán)重影響人們的正常生活。目前，西醫(yī)采用藥物及手術(shù)治療干眼，如人工淚液、免疫抑制劑、激素、淚點封閉術(shù)[3]、角結(jié)膜移植[4]、頜下腺移植等[5-7]，但均具有相關(guān)風(fēng)險，治療不穩(wěn)定、作用不持久。近年來，隨著對中醫(yī)藥的深入研究，中藥外治、內(nèi)服及針灸治療等在改善干眼患者淚膜穩(wěn)定、減輕眼部不適癥狀方面發(fā)揮重要作用。

干眼屬中醫(yī)白澀癥、干澀昏花、神水將枯癥[8]等疾病范疇。《靈樞·大惑論》曰：“五臟六腑之精氣，皆上注于目而為之精?！币庠谥赋鋈梭w五臟六腑化生之精微物質(zhì)通過經(jīng)絡(luò)到達(dá)目珠并濡養(yǎng)之。干眼的病因病機(jī)主要為肝郁氣滯、肝經(jīng)郁熱、肺陰不足、氣陰兩虛等，致津液不得正常輸布于目，久則目珠干澀乏澤，與肝、肺密切相關(guān)[3-4，9]。金珍滴眼液可疏風(fēng)、清熱、明目，調(diào)暢氣機(jī)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，其治療干眼、視頻終端視疲勞等方面均有較好療效[10-11]，但其具體作用機(jī)制尚不明了。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接，研究金珍滴眼液治療干眼的藥物有效成分及作用靶點，分析其調(diào)控通路信息等，為深入研究提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 金珍滴眼液化學(xué)成分和作用靶點篩選 金珍滴眼液（Jinzhen Eye Drops，JZED）由金銀花、密蒙花、野菊花、薄荷、珍珠、冰片組成，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）和中藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID），使用關(guān)鍵參數(shù)口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18 作為藥物篩選的條件，記錄符合要求的相關(guān)化學(xué)成分及對應(yīng)靶點。使用Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，檢索干眼名稱，得到目標(biāo)藥物-人源靶標(biāo)蛋白-基因名的相互關(guān)系。

1.2 干眼靶點基因獲取 通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以“dry eye”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到干眼相關(guān)的基因靶點。

1.3 藥物-干眼-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用RGUI軟件Venn 庫繪制得到藥物-干眼-靶點韋恩圖，通過Cytoscape V3.8.2 構(gòu)建有效成分-干眼-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在STRING（https：//cn. string-db. org/）數(shù)據(jù)庫， 以interaction score ＞0.95 為作用閾值，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，再利用Cytoscape 獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點。

1.4 關(guān)鍵靶點的基因本體（GO）和KEGG 通路富集分析 利用RGUI軟件的Cluster Profiler 庫，以人類基因數(shù)據(jù)庫（org.Hs.eg.db）和KEGG 數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)源，設(shè)置P＜0.05 進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析和可視化顯示，根據(jù)富集分析結(jié)果篩選靶基因，說明金珍滴眼液中的有效靶蛋白在基因功能表達(dá)以及相關(guān)信號通路中所起的重要作用。

1.5 分子對接驗證 根據(jù)PPI 篩選出的關(guān)鍵靶點，在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)（Pubchem）得到核心蛋白結(jié)構(gòu)，將水分子以及結(jié)合的配體利用PyMOL V2.4 軟件去除，將配體和受體文件導(dǎo)入AutoDockTools、Vina 軟件對金珍滴眼液的主要活性成分和核心靶點進(jìn)行分子對接實驗，獲得對接評分，驗證其相互作用的活性。

2 結(jié)果

2.1 藥物有效成分及作用靶點篩選結(jié)果 以O(shè)B ≥30%和DL ≥0.18 為條件，在TCMSP 和TCMID 數(shù)據(jù)庫中對金珍滴眼液中藥活性成分進(jìn)行檢索，得到59 種化合物，其中冰片3 種，薄荷10 種，金銀花23 種，密蒙花4種，野菊花12種，珍珠7種。根據(jù)化合物相關(guān)靶點，結(jié)合UniProt 數(shù)據(jù)庫，共涉及257 個人類基因Symbol。

2.2 藥物有效成分和干眼共同靶點篩選結(jié)果 利用GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫，以Relevance score＞1 為條件，共獲取干眼相關(guān)疾病靶點3 603 個。將目標(biāo)藥物中的成分靶點與干眼靶點相交，取共同交集，獲得221 個共同作用靶點，見圖1；利用Cytoscape V3.8軟件構(gòu)建有效成分-干眼-靶點互作網(wǎng)絡(luò)，見圖2；其中薄荷為藍(lán)色（#0040ff），金銀花為綠色（#80ff00），密蒙花為紫色（#9900cc），野菊花為青色（#00ffff），珍珠為黃色（#ffbf00），冰片為紅色（#ff0000）。根據(jù)連接度，quercetin、luteolin、kaempferol、naringenin、beta-sitosterol等化合物可能是金珍滴眼液治療干眼的關(guān)鍵活性成分，見表1。

表1 金珍滴眼液治療干眼的關(guān)鍵活性成分

圖1 藥物有效成分靶點和干眼靶點韋恩圖

圖2 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)核心構(gòu)建 利用STRING 數(shù)據(jù)庫，獲取221 個交集靶點的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋽?shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，經(jīng)2次過濾，得到金珍滴眼液作用于干眼的PPI 核心網(wǎng)絡(luò)圖，得到221 個靶點，573 條邊，節(jié)點平均連接度5.19，見圖3。推測AKT1、TP53、HSP90AA1、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、ESR1、腫瘤壞死因子（TNF）、CTNNB1、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、生長因子受體結(jié)合蛋白（GRB2）、表皮生長因子受體（EGFR）、PTPN11 為金珍滴眼液治療干眼的關(guān)鍵靶點。

圖3 金珍滴眼液治療干眼相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析 使用RGUI軟件Cluster Profiler 庫中Enrich GO 富集功能函數(shù)，以P＜0.05 和q＜0.05 為閾值，得到3 045 個條目，其中生物過程（BP）2 664 條，細(xì)胞組成（CC）149 條，分子功能（MF）232 條。根據(jù)P值排序，取前30 條繪制可視化圖形，見圖4。

圖4 金珍滴眼液治療干眼的GO富集分析

使用RGUI 軟件clusterProfiler 庫中enrichKEGG 富集功能函數(shù)，以閾值P＜0.05和q＜0.05進(jìn)行分析，得到190條信號通路，取前30條繪制可視化圖形，見圖5。

圖5 金珍滴眼液治療干眼的KEGG富集分析

2.5 關(guān)鍵靶點的分子對接 根據(jù)有效成分和疾病共同靶點網(wǎng)絡(luò)中活性成分，將Degree 較高的10 個活性成分與查閱文獻(xiàn)后保留的AKT1、TP53、HSP90AA1、MAPK3、TNF、IL-6、EGFR 共7 個密切度高的關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接。一般認(rèn)為結(jié)合能數(shù)值小于-7 kcal/mol 表明受體和配體具有較好的親和力，見表2、圖6。

表2 核心蛋白與活性成分對接結(jié)合能結(jié)果 kcal/mol

圖6 分子對接結(jié)果

3 討論

干眼是一種由于淚液不足或淚液過度蒸發(fā)而導(dǎo)致淚膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失、眼表受損及眼部不適癥狀有關(guān)的眼表疾病[12]，眼表淚膜不穩(wěn)定、炎癥和損傷、淚液高滲透性、神經(jīng)感覺異常以及眼表微環(huán)境失衡等是導(dǎo)致干眼的主要病因[1，13]。干眼誘導(dǎo)的淚膜高滲性抑制PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)，PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)是角膜上皮細(xì)胞（CECs）炎癥、自噬和細(xì)胞凋亡發(fā)生和發(fā)展的部分原因，在體內(nèi)和體外實驗中，高滲透壓可能通過抑制CECs中PI3K/AKT信號傳導(dǎo)，以劑量依賴的方式增加HMGB1、腫瘤壞死因子（TNF-α）和IL-1β 的表達(dá)[14]，因此，PI3K/AKT 信號的再激活可能是治療干眼的有效方法。

中藥復(fù)方常按君臣佐使配伍規(guī)律以增效祛邪。金珍滴眼液中金銀花歸肺經(jīng)，可清熱解毒、疏散風(fēng)熱，密蒙花歸肝膽經(jīng)，可清熱瀉火、養(yǎng)肝明目、退翳，共為君藥；野菊花味苦入肝，清瀉肝火，兼散風(fēng)熱，為臣藥；冰片、珍珠共為佐藥，主散郁火，可清熱止痛、瀉火解毒、明目退翳；薄荷為使藥，疏散風(fēng)熱，調(diào)和諸藥，全方具有疏風(fēng)、清熱、明目之功效。

本研究結(jié)果顯示，金珍滴眼液包含34 個有效化合物，具有較高連接度的化合物包括天然黃酮類以及強(qiáng)抗氧化類成分等。

Quercetin 存在于金銀花、野菊花，具有抗炎作用，可調(diào)節(jié)NO、IL-6 和TNF-α 等炎癥介質(zhì)的釋放[15-16]，從而減輕組織中的氧化損傷，并抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的延遲自發(fā)細(xì)胞凋亡和中性粒細(xì)胞活化。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是染色質(zhì)結(jié)合因子，警報素家族成員之一，在核穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，各種眼表疾病，如結(jié)膜炎和干眼的患者淚液中發(fā)現(xiàn)了HMGB1，在靜止?fàn)顟B(tài)下，它可以定位細(xì)胞內(nèi)的炎癥介質(zhì)，但釋放到外部可以激活先天免疫反應(yīng)，引起炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)，參與組織損傷[17-20]。研究表明，槲皮素可抑制NLRP3 炎癥小體的激活及MAPKs、JAK/STAT、NF-κB 和細(xì)胞凋亡通路，以及激活Nrf2、AMPK、BDNF/CREB、Wnt/β-Catenin、PI3k/Akt 通路和SIRT1 介導(dǎo)的HMGB1 脫乙?；痆21]。在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)中，槲皮素抑制HMGB1的釋放和細(xì)胞因子活性，包括限制MAPKs 和NF-κB的激活，這兩種信號通路對HMGB1 誘導(dǎo)的后續(xù)細(xì)胞因子釋放至關(guān)重要。Li H 等[22]證實，激活PI3K/Akt通路后，使得HMGB1 的蛋白表達(dá)下調(diào)，眼表炎癥反應(yīng)及高滲性反應(yīng)均減輕，從而有效治療干眼。

Luteolin 存在于金銀花、密蒙花、野菊花及薄荷中，是最具生物活性的黃酮類化合物之一[23]，在各種炎癥和神經(jīng)退行性疾病模型中，已證明其具有細(xì)胞保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)原性活性等有益作用[24-26]。研究表明，luteolin 可減少角膜組織中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-18、皮質(zhì)酮、IL-17和IL-23和TNF-α 的分泌，上調(diào)SIRT1 表達(dá)，下調(diào)Ac-NF-κB、NLRP3、Ac-Caspase-1、 GSDMD-N、 Cleaved IL-1β 和Cleaved IL-18 表達(dá)，還可調(diào)節(jié)Notch、FOXO、TNF、P53、Hippo、多巴胺能神經(jīng)突觸和神經(jīng)營養(yǎng)因子通路，減輕抑郁相關(guān)性干眼癥模型的抑郁樣行為，增加結(jié)膜上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量，減輕干眼癥狀[27]。在大鼠靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中的結(jié)果表明，luteolin 可有效降低活性氧（ROS），從而改善靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮的利用率[28]。

Acacetin 存在于密蒙花、野菊花、薄荷中，具有抗炎、抗氧化、抗癌等多種生物活性，研究顯示，acacetin可抑制TLR4表達(dá)，從而減輕角膜氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，保護(hù)干眼模型大鼠眼表穩(wěn)態(tài)和淚腺功能[29]。

Asiatic acid 存在與冰片中，具有抗氧化、抗炎、抗自由基、細(xì)胞保護(hù)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、受體和酶調(diào)節(jié)活性等生物活性[30]。在各種體外和體內(nèi)研究中，asiatic acid 也被發(fā)現(xiàn)影響生長因子、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞信號傳導(dǎo)，具有抗癌、降壓、保心、抗梗死、抗中風(fēng)、降血脂、降糖、保肝、保胃、保腎、利尿、免疫刺激、神經(jīng)保護(hù)、抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒等作用[31]。

金珍滴眼液有效成分中包含的naringenin、betacarotene 等強(qiáng)抗氧化類成分，可通過上調(diào)PI3K/AKT/Nrf2 通路，促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的表達(dá)水平和ROS 等氧化物質(zhì)的清除[32]。研究表明，高滲透壓和ROS積累會抑制干眼中的PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)，角膜上皮細(xì)胞（CEC）各種生長因子，包括EGFR 配體、IGF1、神經(jīng)激肽（NK-1）和胰島素，通過結(jié)合其受體激活PI3K/AKT 信號通路，促進(jìn)角膜上皮（CE）的抗凋亡、抗炎、增殖、遷移功能和傷口愈合[14]。ROS 以濃度依賴性方式調(diào)節(jié)CEC 中的細(xì)胞凋亡和炎癥。極端環(huán)境會導(dǎo)致ROS 過量積累，抑制PI3K/AKT，導(dǎo)致CEC 細(xì)胞凋亡和炎癥。在低或中等水平時，ROS 會激活PI3K/AKT信號傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞凋亡并刺激健康CEC的增殖。

根據(jù)PPI核心網(wǎng)絡(luò)，得到金珍滴眼液治療干眼的潛在重要靶點有AKT1、TP53、HSP90AA1、MAPK3、TNF、IL-6、EGFR 等。AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，在細(xì)胞增殖、免疫、血管生成、炎癥、抑制凋亡、能量代謝等信號通路中起著重要作用。TP53 是一種包含轉(zhuǎn)錄激活、DNA 結(jié)合和寡聚結(jié)構(gòu)域的抑癌蛋白，可通過編碼蛋白參與調(diào)節(jié)靶基因，誘導(dǎo)諸多細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA 修復(fù)、衰老、凋亡等。HSP90AA1是高度保守的分子伴侶，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)降解和形態(tài)學(xué)進(jìn)化中起著關(guān)鍵作用。MAPK3 基因編碼的蛋白質(zhì)是MAP 激酶家族的一員，作用于一個信號級聯(lián)，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程，如增殖、分化和細(xì)胞周期進(jìn)程。TNF是健康生物體和患病條件下哺乳動物免疫反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)和調(diào)節(jié)劑，控制免疫系統(tǒng)的發(fā)育、細(xì)胞生存信號通路、增殖并調(diào)節(jié)代謝過程[33]。IL-6是重要的炎癥細(xì)胞因子之一，在眼表疾病，特別是干眼、角膜病變、葡萄膜病變、玻璃體視網(wǎng)膜異常中均有表達(dá)，并在結(jié)膜、角膜、虹膜、視網(wǎng)膜和眼眶的眼部炎癥和血管生成中發(fā)揮重要作用[34]。EGFR是一種表皮生長因子受體，通過結(jié)合PI3K/AKT 受體可激活其信號通路，促進(jìn)CE的抗凋亡、抗炎、增殖和傷口愈合。

GO 和KEGG 富集分析結(jié)果顯示，金珍滴眼液治療干眼涉及外源性刺激反應(yīng)、營養(yǎng)水平反應(yīng)、細(xì)菌來源分子反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)及氧化應(yīng)激的反應(yīng)、活性氧反應(yīng)等與生物過程相關(guān)；與膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔、神經(jīng)細(xì)胞體、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、管腔顆粒分泌因子、突觸后膜等細(xì)胞組成相關(guān)；并涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、信號受體激活劑活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等分子功能。關(guān)鍵靶點主要集中在PI3K-Akt、TNF、IL-17、MAPK、EGFR 等信號通路上。分子對接結(jié)果顯示，金珍滴眼液的活性成分與TP53、HSP90AA1、MAPK3、TNF、IL-6 的結(jié)合活性較強(qiáng)，證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對預(yù)測藥物金珍滴眼液成分與干眼靶點之間的可靠性。綜上所述，金珍滴眼液的活性成分可經(jīng)由多途徑發(fā)揮治療干眼的作用，這些靶點-通路間的相互作用關(guān)系可為后續(xù)研究提供方向，也為金珍滴眼液治療干眼的臨床應(yīng)用和發(fā)展提供更廣闊的前景。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，對金珍滴眼液治療干眼進(jìn)行靶點預(yù)測，構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、PPI 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金珍滴眼液治療干眼可能的活性成分主要包括acacetin、quercetin、luteolin、beta-carotene、asiatic acid 等，這些活性成分通過作用于TP53、HSP90AA1、MAPK3、TNF、IL-6 等靶點和PI3K-Akt、 TNF、 IL-17、 MAPK、EGFR 等信號通路，進(jìn)而從抗炎、抗細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激以及細(xì)胞保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)等方面增加結(jié)膜上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)角膜上皮修復(fù)，減輕高滲反應(yīng)，改善淚膜穩(wěn)態(tài)等途徑達(dá)到治療干眼的作用。