宋紅艷，何東杰，石少琦，崔天薇，衛(wèi)愛武

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000

近年來，隨著輔助生殖技術(shù)的不斷完善和提高，胚胎移植手術(shù)中，胚胎質(zhì)量得到明顯改善，但臨床工作中，許多移植優(yōu)質(zhì)胚胎的患者仍不能獲得成功妊娠，胚胎反復(fù)種植失敗（RIF）已成為影響輔助生殖技術(shù)妊娠結(jié)局的重要因素。2018 年，我國《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識》將RIF 定義為移植3 次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數(shù)4～6 個或高評分囊胚數(shù)3 個及以上[1]。RIF 的確切病因尚不明確，大多數(shù)RIF 與母體子宮內(nèi)膜異常等因素有關(guān)[2-3]。RIF 歸屬于中醫(yī)學(xué)不孕、滑胎等范疇。衛(wèi)愛武教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)顯示，RIF 患者多表現(xiàn)為腎虛血瘀證。衛(wèi)教授以滋腎活血、養(yǎng)血填精為法，擬定滋腎養(yǎng)血活血湯，其能有效改善腎虛血瘀型RIF患者的臨床妊娠率和胚胎種植率，然而滋腎養(yǎng)血活血湯治療RIF 的作用機(jī)制尚不明確。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選滋腎養(yǎng)血活血湯治療RIF的作用靶點(diǎn)，并結(jié)合分子對接技術(shù)對相關(guān)作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期探討滋腎養(yǎng)血活血湯治療RIF的作用機(jī)制。

1 研究方法

1.1 滋腎養(yǎng)血活血湯活性成分與靶點(diǎn)篩選 在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，https：//tcmspe.com）檢索滋腎養(yǎng)血活血湯藥物組成（菟絲子、女貞子、金櫻子、熟地黃、當(dāng)歸、枸杞子、丹參）有效活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30% 和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件進(jìn)行篩選，然后在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行蛋白與基因轉(zhuǎn)化，最終獲得滋腎養(yǎng)血活血湯的有效活性成分與潛在基因靶點(diǎn)。

1.2 RIF疾病靶點(diǎn)篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）以“recurrent implantation failure”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索并篩選RIF的疾病靶點(diǎn)，設(shè)定物種為人，以相關(guān)度的中位數(shù)＞6.0 為標(biāo)準(zhǔn)篩選靶點(diǎn)，將以上2 個數(shù)據(jù)庫檢索獲得的信息去重匯總后建立RIF 疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.3 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny2.1.0在線工具對藥物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，將獲取的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，然后利用Cytoscape3.9.1 軟件中的CytoNCA 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的拓?fù)浞治?，以獲取交集核心靶點(diǎn)，并繪制“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 通過DAVID 在線數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 與KEGG 富集分析。設(shè)置物種類型為“Homo sapiens”，下載GO 與KEGG 富集分析結(jié)果，利用微生信在線平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制氣泡圖及條形圖進(jìn)行可視化。

1.5 分子對接驗(yàn)證 基于交集靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，篩選出度（degree）值排名前9的靶點(diǎn)，同時根據(jù)“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出degree 值排名前5 的活性成分。將篩選出的靶標(biāo)和活性成分進(jìn)行分子對接。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選并下載核心化合物的二維結(jié)構(gòu)，在PDB（https：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點(diǎn)受體蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，使用Pymol 軟件精簡冗雜結(jié)構(gòu)，再利用AutoDock Vina1.5.7 對PDB 蛋白分子進(jìn)行處理；使用AutoDock Vina 對關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，并計(jì)算結(jié)合能，結(jié)合能越小則對接越緊密。最后利用Pymol 軟件對結(jié)合緊密的部分進(jìn)行可視化構(gòu)圖。

2 研究結(jié)果

2.1 滋腎養(yǎng)血活血湯有效成分 通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共獲得滋腎養(yǎng)血活血湯787個化學(xué)成分。其中菟絲子29 個、熟地黃76 個、當(dāng)歸125 個、女貞子119個、金櫻子48個、枸杞子188個、丹參202個。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為有效性篩選條件，共篩選獲得146 個有效活性成分。其中菟絲子11 個、熟地黃2 個、當(dāng)歸2 個、女貞子13 個、金櫻子8 個、枸杞子45個、丹參65個。

2.2 滋腎養(yǎng)血活血湯有效成分潛在靶點(diǎn) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對146個藥物有效活性成分相關(guān)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行搜索，共計(jì)獲得2 227 個潛在靶點(diǎn)。其中菟絲子314 個、熟地黃33 個、當(dāng)歸34 個、女貞子332 個、金櫻子277 個、枸杞子349 個、丹參888 個。其中部分中藥具有相同的活性成分，去除重復(fù)成分及靶點(diǎn)后共得到122 個藥物有效活性成分和256 個潛在靶點(diǎn)。利用Cytoscape3.9.1 軟件構(gòu)建滋腎養(yǎng)血活血湯中藥-活性成分-靶點(diǎn)圖，見圖1。圖中節(jié)點(diǎn)大小與degree 值大小相對應(yīng)，節(jié)點(diǎn)越大則degree 值越大，共得到372 個節(jié)點(diǎn)，1 548 條邊。其中degree 值排名前5 的活性成分分別是：MOL000098（槲皮素），degree值154； MOL000422（山柰酚）， degree 值63；MOL000006（木犀草素），degree值57；MOL000358（β-谷甾醇），degree 值40；MOL007154（丹參酮ⅡA），degree值39。

圖1 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 RIF 疾病靶點(diǎn) OMIM 數(shù)據(jù)庫共獲得545 個RIF疾病靶點(diǎn)，GeneCards 數(shù)據(jù)庫共獲得到6 944個RIF 疾病靶點(diǎn)，以相關(guān)度的中位數(shù)＞6.0 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選獲得1 735 個RIF 疾病靶點(diǎn)，合并OMIM 數(shù)據(jù)庫與GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得的RIF 疾病靶點(diǎn)，并刪除重復(fù)部分，最終獲得RIF疾病靶點(diǎn)2 215個。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 滋腎養(yǎng)血活血湯藥物潛在靶點(diǎn)及RIF 疾病靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，見圖2。將獲取的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，共獲得140 個節(jié)點(diǎn)和2 861 個邊，平均點(diǎn)值為40.9，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。然后利用Cytoscape3.9.1軟件中的Centiscape2.2插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的拓?fù)浞治?，以degree 值＞40.8、Betweenness＞107.4、Closeness＞0.004 為標(biāo)準(zhǔn)，獲得核心靶點(diǎn)36個，見圖4。其中包含36個節(jié)點(diǎn)和568個邊，degree 值排在前9 的核心靶點(diǎn)分別為白細(xì)胞介素（IL）-6、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1A、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、IL-1B、β-谷甾醇與蛋白激酶B1（AKT1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、腫瘤壞死因子（TNF）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、TP53。

圖2 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶點(diǎn)篩選過程圖

2.5 GO 富集分析 將獲得的交集核心靶點(diǎn)錄入DAVID 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO 富集分析，取P＜0.05，其中生物過程（BP）340條，包括基因表達(dá)調(diào)控、血管生成、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等，細(xì)胞組分（CC）21 條，涉及大分子復(fù)合物、細(xì)胞外空間、胞外區(qū)、染色質(zhì)等，分子功能（MF）54 條主要涉及蛋白激酶/蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白結(jié)合及酶結(jié)合等。利用微生信在線平臺導(dǎo)入BP、CC、MF 排名前10的條目，制作生物過程富集氣泡圖，見圖5。

圖5 GO富集分析

2.6 KEGG 富集分析 在DAVID 數(shù)據(jù)庫對滋腎養(yǎng)血活血湯和RIF 的36 個核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析，取P＜0.05，篩選獲得117 個信號通路。取前20 個顯著富集的信號通路進(jìn)行可視化分析，見圖6。KEGG富集分析的通路主要分布在癌癥通路、炎癥系統(tǒng)及疾病相關(guān)通路及信號傳導(dǎo)通路中，其中信號傳導(dǎo)通路有34 個，如HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、Toll 樣受體信號通路、叉頭框蛋白O（FoxO）信號通路、p53 信號通路、VEGF信號通路等，均與RIF的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，見圖7。將信號傳導(dǎo)通路和對應(yīng)基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，進(jìn)行藥物-活性成分-核心靶點(diǎn)-信號傳導(dǎo)通路可視化分析，見圖8。其中包含186 個節(jié)點(diǎn)，488條邊。

圖6 KEGG富集分析

圖7 KEGG富集分析中信號傳導(dǎo)通路分析結(jié)果

圖8 藥物-活性成分-核心靶點(diǎn)-信號傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對接驗(yàn)證 對中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前5 的主要藥物有效活性成分（木犀草素、β-谷甾醇、丹參酮ⅡA、槲皮素、山柰酚）與degree 值排名前9 的疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)（IL-6、HIF-1A、VEGFA、 IL-1B、 AKT1、 PTGS2、 TNF、 STAT3、TP53）進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，并計(jì)算結(jié)合能，對結(jié)合能最低的4對組合進(jìn)行可視化構(gòu)圖。滋腎養(yǎng)血活血湯的主要活性成分與RIF的疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均小于-2 kcal/mol，見表1。其中β-谷甾醇與AKT1、丹參酮ⅡA與HIF-1A、丹參酮ⅡA與TNF、槲皮素與HIF-1A對接活性較好，見圖9。

表1 藥物主要活性成分與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能 kcal/mol

圖9 藥物主要活性成分與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)對接示意圖

3 討論

滋腎養(yǎng)血活血湯由菟絲子、丹參、熟地黃、枸杞子、女貞子、金櫻子、當(dāng)歸組成。方中菟絲子滋補(bǔ)肝腎，益精養(yǎng)血安胎。丹參活血調(diào)經(jīng)，《本草綱目》謂其“能破宿血，補(bǔ)新血”，《日華子本草》指出丹參能“安生胎，落死胎，止血崩、帶下，調(diào)婦人經(jīng)脈不勻”。丹參與菟絲子合用，一補(bǔ)一瀉，滋腎與活血同調(diào)，共為君藥。熟地黃補(bǔ)陰益精以養(yǎng)血，為臣藥。枸杞子與女貞子滋補(bǔ)肝腎。金櫻子固精秘氣，與菟絲子合用有固精斂胎之效。當(dāng)歸養(yǎng)血活血，助丹參逐瘀安胎。諸藥合用，共奏滋腎填精、養(yǎng)血活血、逐瘀養(yǎng)胎之效。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出滋腎養(yǎng)血活血湯有效活性成分及有效活性成分與RIF疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用基因生物過程富集分析及通路預(yù)測等方法，獲得槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、丹參酮ⅡA 這5 種核心活性成分。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，能夠調(diào)節(jié)多種靶點(diǎn)和信號通路，起到一定的妊娠保護(hù)作用[4]。有研究指出，槲皮素可降低IL-6、IL-8 等炎性因子水平，升高血紅素氧合酶1（HO-1）水平，恢復(fù)母胎界面免疫動態(tài)平衡[5]。槲皮素還能增加妊娠小鼠的雌二醇水平，并可通過多途徑、多基因的基因表達(dá)，下調(diào)半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性，從而提高子宮容受性，發(fā)揮抗妊娠丟失的作用[6]。木犀草素能影響多條信號通路發(fā)揮藥理作用，如抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)等[7-8]。β-谷甾醇是一種天然植物甾醇，具有顯著的抗氧化作用，研究發(fā)現(xiàn)其可抑制脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等炎性介質(zhì)的釋放[9-11]。丹參酮ⅡA 可能通過抑制TRL4/髓樣分化因子88（MyD88）/核因子-κB（NF-κB）信號通路，增加子宮內(nèi)膜胞飲突的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性[12]。山柰酚具有抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤等功效[13]。菟絲子的有效成分可能通過激活STAT3 信號通路改善大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜容受性[14]。丹參酮是丹參的主要提取物，丹參酮ⅡA 可以提升小鼠VEGF 和血管形成素-1（Ang-1）陽性細(xì)胞數(shù)及同源盒A10（HOXA10）、白血病抑制因子（LIF）水平，促進(jìn)血管生成，從而改善子宮內(nèi)膜容受性，有助于小鼠胚泡植入[15]。由此推測，滋腎養(yǎng)血活血湯可能通過藥物主要活性成分調(diào)節(jié)RIF 患者母胎界面免疫耐受、血管重塑、子宮內(nèi)膜容受性等以促進(jìn)胚胎著床。

KEGG 富集分析顯示，滋腎養(yǎng)血活血湯治療RIF的核心靶點(diǎn)主要涉及的信號通路有HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、VEGF 信號通路等，而RIF 的發(fā)生與胚胎質(zhì)量、母胎界面接受程度、免疫細(xì)胞有密切的關(guān)系，涉及炎癥細(xì)胞、免疫耐受、血管生成等多種因素的參與與調(diào)控[16-19]。其中HIF-1 信號通路為富集程度較高的信號傳導(dǎo)通路，HIF-1 信號通路中涉及的靶基因有IL-6、HIF-1A 及VEGF 等，廣泛參與炎癥反應(yīng)、血管形成、細(xì)胞增殖和遷移。研究顯示，RIF 患者分泌中期孕酮誘導(dǎo)阻斷因子1（PIBF1）呈顯著低表達(dá)，而低表達(dá)的PIBF1 可通過下調(diào)IL-6 抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖及蛻膜化，提示這可能是RIF 發(fā)生的主要原因之一[20]。且在體外受精-胚胎移植（IVF）中已證明IL-6 可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分裂和附著，加速其侵襲和遷移，有助于胚胎著床和妊娠維持[21]。缺氧的子宮內(nèi)環(huán)境可誘導(dǎo)合成HIF-1A，提高子宮內(nèi)膜容受性，有助于胚胎的植入[22]。RIF 患者子宮內(nèi)膜中的HIF-1A 表達(dá)下調(diào)，微血管密度明顯降低，表明子宮內(nèi)膜HIF-1A 表達(dá)和血管生成量的降低可能導(dǎo)致植入失敗[23]。VEGF 家族是已知的調(diào)控血管構(gòu)造及生成的重要因子，VEGF 表達(dá)降低可導(dǎo)致血管生成不足，可能是導(dǎo)致RIF 的原因[24]。綜上，推測滋腎養(yǎng)血活血湯可能通過多成分、多靶點(diǎn)調(diào)控HIF-1 信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、血管形成、細(xì)胞增殖與遷移，發(fā)揮治療RIF的作用。

分子對接中，受體和配體之間的結(jié)合能越低則結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，其互作的可能性隨著結(jié)合能的降低而增加[25]。而當(dāng)結(jié)合能小于-5 kcal/mol 時，兩者具有較強(qiáng)的結(jié)合活性[26]。本研究中分子對接發(fā)現(xiàn)，藥物主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)間結(jié)合能均為負(fù)值，且主要以氫鍵結(jié)合方式進(jìn)行相互作用，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測得到的滋腎養(yǎng)血活血湯主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均具有一定的結(jié)合能力的結(jié)論，尤其是β-谷甾醇與AKT1、丹參酮ⅡA 與HIF-1A、丹參酮ⅡA 與TNF、槲皮素與HIF-1A。

綜上所述，滋腎養(yǎng)血活血湯治療RIF的作用機(jī)制可能通過其活性成分β-谷甾醇、丹參酮ⅡA 等與靶蛋白（IL-6、HIF-1A、VEGFA、IL-1B、AKT1 等）相互結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控多種信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。同時，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法已經(jīng)篩選出HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、VEGF 信號通路等，在后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞水平體外實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步驗(yàn)證。因此希望通過繼續(xù)挖掘相關(guān)內(nèi)容，并進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對滋腎養(yǎng)血活血湯治療RIF的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的闡釋。