嚴(yán)憲才 李亮 吳志光 劉錦文 馮勁立 楊宇琦 周耀輝

摘要：目的 觀察分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（Sfrp1）調(diào)控?zé)o翼相關(guān)整合位點(diǎn)（Wnt）信號(hào)通路對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞損傷的影響。方法：體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9c2，設(shè)置空白對(duì)照組（control組）、9型腺相關(guān)病毒載體組（aav9-Sfrp1組）和無(wú)Sfrp1基因組（aav9-NC組）；control組僅進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，aav9-Sfrp1組和aav9-NC細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染aav9-Sfrp1和aav9-NC后，使用AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大模型。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫熒光對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)LC3進(jìn)行染色，蛋白免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白（Sfrp1、p62、atg5、Beclin1、LC3）和Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白（β-catenin、Dvl-1、Wisp1）表達(dá)。結(jié)果：aav9-Sfrp1組Sfrp1 mRNA表達(dá)水平高于aav9-NC組（P＜0.01）。aav9-NC組細(xì)胞存活率低于control組，aav9-Sfrp1組細(xì)胞存活率高于aav9-NC組（P＜0.01）。aav9-NC組細(xì)胞凋亡率高于control組，aav9-Sfrp1組細(xì)胞凋亡率低于aav9-NC組（P＜0.01）。aav9-NC組LC3熒光染色強(qiáng)度低于control組，aav9-Sfrp1組LC3熒光染色強(qiáng)度高于aav9-NC組。aav9-NC組p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)高于control組，atg5、Beclin1表達(dá)低于control組（P＜0.05）；aav9-Sfrp1組p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)低于aav9-NC組，atg5、Beclin1表達(dá)高于aav9-NC組（P＜0.01）。aav9-NC組β-catenin、Dvl-1和Wisp1表達(dá)高于control組（P＜0.001），aav9-Sfrp1組β-catenin、Dvl-1和Wisp1表達(dá)低于aav9-NC組（P＜0.001）。結(jié)論：Sfrp1通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，減輕心肌肥大，發(fā)揮保護(hù)心肌損傷的作用。

關(guān)鍵詞 心肌肥大；心肌損傷；分泌型卷曲相關(guān)蛋白1；Wnt/β-catenin信號(hào)通路；細(xì)胞自噬；血管緊張素Ⅱ；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.05.007

Effect of Sfrp-1 on Angiotensin Ⅱ-related Myocardial Injury by Down-regulating Wnt Signaling

YAN Xiancai， LI Liang， WU Zhiguang， LIU Jinwen， FENG Jinli， YANG Yuqi， ZHOU Yaohui

Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine of Guangzhou University of Chinese Medicine， Zhongshan 528400， Guangdong， China， E-mail： yanvec210@yeah.net

Abstract Objective：To observe the effect of secreted frizzled related protein-1（Sfrp1） regulating wingless-related MMTV integration site （Wnt） on angiotensin Ⅱ（AngⅡ）-induced cardiomyocyte injury in vitro.Methods：Rat cardiomyocytes H9c2 were cultured in vitro，and blank control group（control group），type 9 adeno-associated virus vector group（aav9-Sfrp1 group） and non-Sfrp1 gene group（aav9-NC group） were set up.The control group was only cultured routinely，aav9-Sfrp1 group and aav9-NC cells were respectively transfected with aav9-Sfrp1 and aav9-NC cells，and the myocardial hypertrophy model was induced by AngⅡ.Cell activity was detected by cell counting kit 8，cell apoptosis was detected by flow cytometry，LC3 in cardiomyocytes was stained by immunofluorescence.The expression of autophagy associated proteins（Sfrp1，p62，atg5，Beclin1，LC3） and Wnt/β-catenin pathway-associated proteins（β-catenin，Dvl-1，Wisp1） were detected by protein imprinting.Results：The mRNA expression level of Sfrp1 in aav9-Sfrp1 group was higher than that in aav9-NC group（P＜0.01）.The cell survival rate of aav9-NC group was lower than that of control group，and that of aav9-Sfrp1 group was higher than that of aav9-NC group（P＜0.01）.The apoptosis rate of aav9-NC group was higher than that of control group，and that of aav9-Sfrp1 group was lower than that of aav9-NC group（P＜0.01）.The LC3 fluorescence staining intensity of aav9-NC group was lower than that of control group，and the LC3 fluorescence staining intensity of aav9-Sfrp1 group was higher than that of aav9-NC group.The expressions of p62，LC3Ⅰ/Ⅱ in aav9-NC group were higher than those in control group，while the expressions of atg5，Beclin1 in AAV9-NC group were lower than those in control group（P＜0.05）.The expressions of p62，LC3Ⅰ/Ⅱ in aav9-Sfrp1 group were lower than those in aav9-NC group，and the expressions of atg5，Beclin1 in aav9-NC group were higher than those in AAV9-NC group（P＜0.01）.The expressions of β-catenin，Dvl-1 and Wisp1 in aav9-NC group were higher than those in control group（P＜0.001），and the expressions of β-catenin，Dvl-1 and Wisp1 in aav9-Sfrp1 group were lower than those in aav9-NC group（P＜0.001）.Conclusion：Sfrp1 could induce the cell autophagy，alleviate myocardial hypertrophy，and protect myocardium injury by inhibiting the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway.

Keywords myocardial hypertrophy; myocardial injury; secreted frizzled related protein 1; Wnt/β-catenin signaling pathway; autophagy; angiotensin Ⅱ; experimental study

基金項(xiàng)目 中山市科學(xué)技術(shù)局2021年第一批社會(huì)公益（醫(yī)療衛(wèi)生一般項(xiàng)目）（No.2021B1057）

作者單位 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院（廣東中山? 528400），E-mail：yanvec210@yeah.net

引用信息 嚴(yán)憲才，李亮，吳志光，等.Sfrp-1通過(guò)下調(diào)Wnt信號(hào)對(duì)血管緊張素Ⅱ相關(guān)心肌損傷的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（5）：811-816.

急性心肌梗死是致死率極高的心血管疾病之一，是由冠狀動(dòng)脈急性阻塞、心肌缺血壞死引起的，多發(fā)生于45歲以上的中老年人群，若不及時(shí)治療，可使心臟結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)而發(fā)展為急性心力衰竭，在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致死亡［1］，嚴(yán)重威脅病人生命安全?，F(xiàn)階段臨床多通過(guò)再灌注方式進(jìn)行治療，可能發(fā)生缺血再灌注損傷，影響治療效果及預(yù)后［2］。心肌細(xì)胞凋亡是心肌重塑的重要標(biāo)志，清除凋亡的細(xì)胞是治療心力衰竭的重要過(guò)程［3］。隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，細(xì)胞凋亡和自噬證實(shí)參與了心肌損傷過(guò)程，與細(xì)胞損傷修復(fù)和心功能保護(hù)作用有關(guān)［4］。無(wú)翼相關(guān)整合位點(diǎn)（wingless-related MMTV integration site，Wnt）信號(hào)通路與心血管疾病有關(guān)，參與心肌細(xì)胞肥大、主動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化等心臟生理病理改變［5］。分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（secreted frizzled related protein 1，Sfrp1）與Wnt配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合負(fù)調(diào)控Wnt信號(hào)通路，與心肌梗死等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6］。既往研究報(bào)道，Sfrp1具有較強(qiáng)的促血管新生作用，過(guò)表達(dá)Sfrp1的骨髓干細(xì)胞可抑制心肌梗死區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，拮抗炎癥反應(yīng)，從而抑制心肌缺血損傷［7］?；诖耍狙芯坎捎醚芫o張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）體外誘導(dǎo)大鼠H9c2細(xì)胞構(gòu)建心肌肥大模型，將9型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染Sfrp-1至H9c2細(xì)胞中，探討Sfrp-1調(diào)控Wnt信號(hào)通路影響細(xì)胞自噬對(duì)心肌損傷的影響，為臨床治療心肌肥厚、心肌損傷和心力衰竭提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌細(xì)胞系H9c2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，將H9c2細(xì)胞置于含10%胎牛血清和青霉素鏈霉素混合物的改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每日更換新的培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化后傳代。設(shè)置空白對(duì)照組（control組）、9型腺相關(guān)病毒載體組（aav9-Sfrp1組）和無(wú)Sfrp1基因組（aav9-NC組），control組僅進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，aav9-Sfrp1組和aav9-NC組按相關(guān)操作構(gòu)建心肌肥大模型。

1.2 心肌肥大模型的建立

取培養(yǎng)后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠H9c2細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)置每孔細(xì)胞密度為5×105個(gè)，分別以重組9型腺相關(guān)病毒載體（aav9-Sfrp1）、無(wú)Sfrp1基因（aav9-NC）轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為6×105（v.g.）/細(xì)胞。將病毒液完整覆蓋于培養(yǎng)基中的細(xì)胞表面，保持37 ℃、5%CO2條件，每隔30 min搖晃培養(yǎng)基，使病毒充分接觸細(xì)胞。轉(zhuǎn)染5 d后，以10－6 mmol/L AngⅡ刺激H9c2細(xì)胞48 h，誘導(dǎo)心肌肥大模型。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative reverse transcription，qRT-PCR）檢測(cè)H9c2細(xì)胞內(nèi)Sfrp1 mRNA表達(dá)

采用TRIzol試劑提取H9c2細(xì)胞內(nèi)的總RNA，之后用PrimeScriptTMRT試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR GreenPCR試劑進(jìn)行顯色，ABI7500FAST Real-Time PCR儀進(jìn)行qRT-PCR。采用2－△△Ct方法評(píng)估，以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參校正后Sfrp1 mRNA表達(dá)水平。Sfrp1正向引物：5′-ATGCAGTTCTTCGGCTTCTACT-3′；反向引物：5′-CAGCTTCTTCAGCTCCTTCTTC-3′。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）檢測(cè)細(xì)胞活力

采用CCK8（上海語(yǔ)純生物科技有限公司）檢測(cè)各組心肌細(xì)胞H9c2的細(xì)胞活力，將細(xì)胞按每孔1×105個(gè)密度接種于96孔板中培養(yǎng)48 h，加入CCK8溶液再次培養(yǎng)2 h，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處各組細(xì)胞的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞存活率（%）＝（試驗(yàn)井平均吸光度）/（對(duì)照井平均吸光度）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞重懸于緩沖區(qū)中，加入膜聯(lián)蛋白V（Annexin V-FITC）試劑（上海博湖生物科技有限公司）和碘化丙啶（PI）染液（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），避光孵育15 min后，采用流式細(xì)胞儀（上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司）按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分析細(xì)胞凋亡情況。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

將各組細(xì)胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞溶解液中，收集細(xì)胞提取物，4 ℃條件下離心15 min，二喹啉甲酸（BCA）蛋白測(cè)定試劑盒（福州奧研實(shí)驗(yàn)器材有限責(zé)任公司）檢測(cè)蛋白濃度，凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至膜后室溫下封閉，4 ℃條件下，與一抗Sfrp1、p62、atg5、Beclin1、LC3、β-catenin、Dishevelled-1（Dvl-1）、WNT1誘導(dǎo)信號(hào)通道蛋白1（Wnt1-inducible signaling pathway protein 1，Wisp1）、β-actin（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）孵育過(guò)夜，室溫下與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 min，采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技有限公司）顯影，Image J軟件進(jìn)行蛋白定量分析。

1.7 免疫熒光分析

將上述處理的各組細(xì)胞室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，用0.4%Triton X-100滲透1 h，37 ℃下以山羊血清阻斷1 h，與LC3一抗（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）和硫氰酸熒光素標(biāo)記的IgG二抗連續(xù)培養(yǎng)，奧林巴斯ckx53熒光顯微鏡（上海迪圖生物科技有限公司）觀察細(xì)胞免疫熒光情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Sfrp1 mRNA表達(dá)水平比較

aav9-Sfrp1組Sfrp1 mRNA表達(dá)水平高于aav9-NC組（P＜0.05）。提示轉(zhuǎn)染成功。詳見(jiàn)表1、圖1。

2.2 各組細(xì)胞存活率比較

aav9-NC組細(xì)胞存活率低于control組，aav9-Sfrp1組高于aav9-NC組（P＜0.01）。詳見(jiàn)表2、圖2。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

aav9-NC組細(xì)胞凋亡率高于control組，aav9-Sfrp1組低于aav9-NC組（P＜0.01）。詳見(jiàn)表3、圖3及圖4。

2.4 各組細(xì)胞免疫熒光強(qiáng)度比較

aav9-NC組LC3熒光染色強(qiáng)度低于control組，aav9-Sfrp1組LC3熒光染色強(qiáng)度高于aav9-NC組。詳見(jiàn)圖5。

2.5 各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較

aav9-NC組p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)高于control組，atg5、Beclin1表達(dá)低于control組（P＜0.05）；aav9-Sfrp1組p62、LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)低于aav9-NC組，atg5、Beclin1表達(dá)高于aav9-NC組（P＜0.01）。詳見(jiàn)表4、圖6。

2.6 各組細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin通路表達(dá)比較

aav9-NC組β-catenin、Dvl-1和Wisp1表達(dá)高于control組（P＜0.001），aav9-Sfrp1組β-catenin、Dvl-1和Wisp1表達(dá)低于aav9-NC組（P＜0.001）。提示Sfrp1可抑制Wnt/β-catenin通路活化。詳見(jiàn)表5、圖7。

3 討 論

心力衰竭是心肌肥大等心肌損傷疾病的終末期表現(xiàn)，從分子角度分析，細(xì)胞凋亡與心肌肥大等心肌損傷密切相關(guān)，清除凋亡細(xì)胞是心肌肥大水平治療的重要靶點(diǎn)［8］。AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮誘導(dǎo)心肌肥大和心肌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)肽，是誘導(dǎo)心肌肥大損傷模型的常用方式，通過(guò)刺激細(xì)胞間的分子轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)通路失活及活化，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表型改變［9］。本研究采用AngⅡ誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞建立心肌肥大模型，轉(zhuǎn)染aav9-Sfrp1，探討Sfrp1調(diào)控Wnt/β-catenin通路對(duì)心肌細(xì)胞損傷的影響。

Sfrp1基因是Sfrp分泌糖蛋白家族的一員，在宮頸癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤組織中基因表達(dá)缺失［10］，通過(guò)調(diào)控DNA甲基化和microRNA轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致基因表觀遺傳沉默，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，發(fā)揮顯著的抑癌作用［11］。有研究顯示，Sfrp1在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，可保護(hù)因心肌梗死等造成的心臟損傷［12］。Sklepkiewicz等［13］研究顯示，Sfrp1基因敲除小鼠隨著年齡增長(zhǎng)，心功能逐漸惡化，心肌纖維化水平加劇，可觀察到明顯的擴(kuò)張型心肌病特征。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Sfrp1可顯著增強(qiáng)AngⅡ誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞增殖活性，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，發(fā)揮顯著的保護(hù)心肌損傷作用。與Pan等［14］研究結(jié)果一致。Sfrp1對(duì)心肌細(xì)胞的調(diào)控作用可能通過(guò)影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，Sfrp1是Wnt/β-catenin通路的重要抑制劑，Sfrp1通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路的活化，抑制α平滑肌肌動(dòng)蛋白水平、膠原合成能力及心肌纖維化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的激活［15］，進(jìn)而促進(jìn)正常心肌細(xì)胞存活，增強(qiáng)細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡并影響自噬。

細(xì)胞自噬不同于凋亡的代謝過(guò)程，通過(guò)將細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)傳送至溶酶體中進(jìn)行動(dòng)態(tài)分解，清除受損、破裂及癌變的細(xì)胞，維持正常細(xì)胞和組織的穩(wěn)態(tài)平衡。p62、Beclin1、atg5和LC3是細(xì)胞自噬的重要標(biāo)志物［16］。LC3是由LC3Ⅰ和LC3Ⅱ組成的自噬相關(guān)蛋白，細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，p62表達(dá)下調(diào)，Beclin1、atg5表達(dá)上調(diào)，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ。Wnt/β-catenin通路是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分化的重要信號(hào)通路，與心肌肥大、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［17］。有研究顯示，Wnt/β-catenin不僅與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡過(guò)程有關(guān)，還可激活下游效應(yīng)分子Dvl-1、Wisp1，參與細(xì)胞自噬過(guò)程［18］。本研究結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin通路被Sfrp1基因抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，增強(qiáng)細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡，在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞模型中發(fā)揮著保護(hù)作用。Tao等［19］研究顯示，Wnt/β-catenin通路是老年小鼠心肌梗死的重要靶點(diǎn)，Sfrp1可靶向抑制Wnt/β-catenin通路活化，有效降低心肌纖維化程度，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善老年小鼠的心功能，保護(hù)心臟免受急性心肌梗死損傷。分析原因，可能與Wnt/β-catenin通路的生物特性有關(guān)，Sfrp1與Wnt的配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和活化被抑制，下游效應(yīng)分子Dvl-1、Wisp1的表達(dá)顯著下調(diào)，失活的Wnt/β-catenin通路可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)心肌細(xì)胞活性，并通過(guò)線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及死亡受體等途徑抑制細(xì)胞凋亡［20］，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而緩解心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，Sfrp1通過(guò)使Wnt/β-catenin信號(hào)通路失活，降低了大鼠心肌細(xì)胞H9c2的體外凋亡，促進(jìn)正常心肌細(xì)胞存活，增強(qiáng)細(xì)胞活性，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞免受AngⅡ刺激引起的損傷。本研究揭示了Wnt/β-catenin通路在心肌損傷中的重要作用，并提出Sfrp1基因是保護(hù)心肌細(xì)胞免受AngⅡ誘導(dǎo)造成損傷的關(guān)鍵分子，為心肌梗死等心血管疾病的治療提供了新的分子靶點(diǎn)和治療策略。本研究存在一定的局限性，未驗(yàn)證Sfrp1調(diào)控Wnt/β-catenin通路是否發(fā)揮同樣效應(yīng)，今后需深入探索。

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（收稿日期：2022-06-22）

（本文編輯薛妮）