摘要： 植物病原真菌和卵菌產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白在促進病原菌侵染、操縱寄主免疫方面有關(guān)鍵作用，這些效應(yīng)蛋白在與寄主作用之前必須被分泌出去，SNARE蛋白家族作為真核細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運及膜融合的關(guān)鍵組分，在分子轉(zhuǎn)運中有核心調(diào)控作用。隨著許多植物絲狀病原菌基因組被破譯，對SNAREs基因參與病原菌致病機制的研究取得了可喜進展。本研究簡要概述了真核生物中SNARE蛋白的組成及分類和植物病原真菌及卵菌中SNARE蛋白基因的功能研究進展，并據(jù)此提出進一步開展SNARE蛋白基因功能分析的研究建議，以期為全面、深入研究植物病原真菌和卵菌中SNARE基因的功能、理解病原菌致病、效應(yīng)蛋白分泌提供新的視野，為植物-病原物互作的分子機制研究提供參考。

關(guān)鍵詞： 植物病原菌；真菌；卵菌；效應(yīng)分子；SNARE蛋白

中圖分類號：S432.4+4 "文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）01-0001-09

為成功侵染并定殖于寄主植物，植物病絲狀病原菌（真菌和卵菌）通過各種分泌蛋白（效應(yīng)物）來破壞宿主細胞成分，調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)并引發(fā)寄主壞死［1-2］。根據(jù)分泌的效應(yīng)分子在寄主植物中作用的位置，可以將它們分為質(zhì)外體效應(yīng)分子（apoplastic effector）和細胞質(zhì)效應(yīng)分子（cytoplasmic effector）2類［1，3］。其中質(zhì)外體效應(yīng)分子位于病原菌與寄主之間的界面上，在寄主細胞外發(fā)揮作用，而細胞質(zhì)效應(yīng)子不同于質(zhì)外體效應(yīng)子，它們被分泌并轉(zhuǎn)移到寄主細胞內(nèi)發(fā)揮作用，其中卵菌中已鑒定出的RXLR、Crinkler（CRN）為細胞質(zhì)效應(yīng)物［1］。植物絲狀病原菌分泌的效應(yīng)分子能以多種方式干擾寄主植物的免疫反應(yīng)，并在幫助病原菌侵染的過程中發(fā)揮毒性。在植物病原細菌中，效應(yīng)蛋白通過一種保守的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）直接以注射的方式被送入寄主細胞內(nèi)［4］。然而，人們對植物絲狀病原菌效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)運、分泌機制和途徑知之甚少。真核細胞蛋白質(zhì)在合成后通過傳統(tǒng)分泌途徑轉(zhuǎn)運，最后階段的分泌涉及胞吐作用。植物絲狀病原菌效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)運可能也是借助傳統(tǒng)囊泡運輸分泌途徑，最后以可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體蛋白（SNAREs）介導(dǎo)的囊泡與質(zhì)膜融合分泌運往細胞器或質(zhì)膜。研究者發(fā)現(xiàn)，玉米黑粉病病菌（Ustilago maydis）中的 "Yup1 "可介導(dǎo)早期核內(nèi)體的內(nèi)吞循環(huán)，對菌絲形態(tài)發(fā)生和發(fā)病機制至關(guān)重要［5］。在稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）中，效應(yīng)蛋白在轉(zhuǎn)運前被包裝在BIC的動態(tài)囊狀膜效應(yīng)區(qū)（MECs）中，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用參與MEC的形成和致?。?］。最近Wang等對致病疫霉（Phytophthora infestans）的研究也證明了RXLR效應(yīng)蛋白通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）被吸收到植物細胞中［7］。

在真核細胞中，蛋白質(zhì)、脂類在不同細胞器間的運輸由運輸囊泡定向轉(zhuǎn)運來介導(dǎo)完成，沿著高度有組織的定向路線流動，使細胞能夠分泌、進食和重塑質(zhì)膜和細胞器。囊泡運輸是一個極復(fù)雜的動態(tài)過程，主要包括囊泡出芽、運輸、束縛和膜融合4個基本步驟，在最后的融合步驟中，運輸囊泡必須高度準(zhǔn)確地識別要與之融合的正確靶膜，離不開核心調(diào)控蛋白家族可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白附著蛋白受體蛋白（SNAREs）的介導(dǎo)［8-9］。無論是在酵母中還是人體中，大量SNARE蛋白復(fù)合體已被揭示在運輸囊泡靶向和與靶膜融合中發(fā)揮重要作用，并有研究發(fā)現(xiàn)許多與分泌和內(nèi)吞途徑密切相關(guān)的蛋白。在細胞內(nèi)，不同功能的SNARE蛋白參與不同的轉(zhuǎn)運步驟，只有隨著分泌型SNARE蛋白數(shù)量的增加，組織內(nèi)的單個細胞才能將物質(zhì)輸送到其質(zhì)膜的不同區(qū)域。此外，不同物種間可能重復(fù)了許多SNARE蛋白，隨后進一步多樣化［10-11］。SNARE蛋白參與分泌囊泡與質(zhì)膜融合的機制，及其在調(diào)節(jié)真核細胞生長發(fā)育中的重要作用一直備受關(guān)注［9，12］。隨著基因組不斷被破譯，在真菌和卵菌的研究中，不同物種的SNARE蛋白不斷被鑒定出來，但SNARE在病原真菌與卵菌的致病過程中發(fā)揮的重要作用還未完全被解析。

近年來，國內(nèi)外研究人員對植物病原真菌如稻瘟病病菌、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、金黃殼囊孢菌（Cytospora chrysosperma）、炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、番茄枯萎病病菌（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici，F(xiàn)ol）、小麥赤霉病病菌（Gibberella zeae）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、玉米黑粉病病菌和卵菌如大豆疫霉（P. sojae）SNARE蛋白編碼基因 "PsYkt6、PsVamp7、PsTlg1、PsSso1/Sso2 "等開展了研究，并揭示了這些SNARE基因在參與植物病原菌的發(fā)育和毒力相關(guān)蛋白的運輸中起著重要作用。本研究簡要對真核生物中SNAREs蛋白的組成及結(jié)構(gòu)功能、植物病原真菌及卵菌中SNARE蛋白基因的功能研究進行了綜述，并據(jù)此提出了進一步開展SNARE蛋白基因功能分析的建議，以期為全面、深入研究植物病原真菌和卵菌中SNARE基因的功能、理解病原菌致病性、效應(yīng)蛋白分泌提供新的視野，為寄主-病原物相互作用機制研究提供科學(xué)參考。

1 真核生物中SNARE蛋白的組成及結(jié)構(gòu)功能

1.1 SNARE結(jié)構(gòu)與分類

在真核細胞中，內(nèi)膜系統(tǒng)不同部分之間的定向轉(zhuǎn)運是由囊泡介導(dǎo)的，這些囊泡從供體細胞器中出芽，然后與受體細胞器融合。目前普遍認為，SNAREs是對接的最后階段和隨后融合的各種囊泡介導(dǎo)的運輸事件的主要參與者，是一個超基因蛋白家族，通常是長度為100～300個氨基酸的小蛋白，參與了運輸小泡與靶膜的錨定并催化了配送中間體，促進其與靶膜相互融合［13-14］。目前，已報道的膜融合過程在所有真核生物中都是高度保守的，在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了多達24種已知的SNARE蛋白，在人類中發(fā)現(xiàn)36個成員，在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus oryzae）中發(fā)現(xiàn)21個成員，在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)64個成員［15-18］。SNAREs有1個簡單的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，并具有1個特征的SNAREs基序——1個進化上保守的長度，由60～70個氨基酸組成，以七肽重復(fù)的形式排列。在它們的C末端，大多數(shù)SNAREs都有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過1個短接頭與SNARE基序相連。許多SNAREs具有獨立的折疊結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域位于SNARE基序的N端，并且在SNARE的亞組之間變化［9］。最初，SNARE在功能上被歸類為運輸囊泡相關(guān)蛋白或靶膜相關(guān)蛋白（分別為v-、t-SNARE），兩者相互配對在細胞內(nèi)膜融合中起著核心作用［19］。然而，由于需要進一步對SNARE蛋白介導(dǎo)的膜融合機制進行詮釋，且該分類在酵母液泡的同型融合中不適用，因此后來SNARE蛋白形成了更加嚴謹?shù)姆诸愊到y(tǒng)［9］。轉(zhuǎn)運囊泡和靶膜之間的特異性膜融合確保了轉(zhuǎn)運的準(zhǔn)確性，并由SNARE復(fù)合體介導(dǎo)，該復(fù)合體組裝成1個由4個螺旋組成的緊密簇，該束的中心兼容了16層互作的側(cè)鏈［20］。由圖1可見，基于SNARE結(jié)構(gòu)域四螺旋束中“0”層位置的殘基，SNARE在結(jié)構(gòu)上可以分為 Qa-、Qb-、Qc-和R-SNAREs 4個主要亞家族［9，21］。事實上，對釀酒酵母、擬南芥和哺乳動物SNARE序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，這4個SNARE亞家族在真核進化的早期是高度保守和分化的［17］。

1.2 真核生物中SNARE蛋白的分布及保守性

SNAREs似乎在分泌途徑的所有運輸步驟中都介導(dǎo)了膜融合。目前，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體膜、液泡/溶酶體和質(zhì)膜上及從這些膜上衍生的囊泡上都發(fā)現(xiàn)了SNARE蛋白，圖2為SNAREs蛋白在真核生物胞內(nèi)膜運輸途徑中的排布［9］。真核細胞中包含許多SNARE蛋白，為了使 SNARE在特定的細胞內(nèi)融合步驟中發(fā)揮作用，必須確保每個細胞內(nèi)膜都配備適當(dāng)?shù)腟NARE蛋白組。單個SNARE可以在多個運輸步驟中起作用，也可能需要與幾個不同的SNAREs協(xié)同配合［22］。但不同的運輸步驟可能使用不同組合的Q-和T-SNARE來參與，因此有些膜融合過程也可能會有固定的SNARE蛋白組合。如在釀酒酵母中Sso1p、Sso2p在結(jié)構(gòu)及功能上分別屬于Qa-、t-SNARE蛋白，高度同源，不僅參與囊泡運輸中后期分泌小泡與質(zhì)膜的相互融合，而且介導(dǎo)了產(chǎn)孢時期的囊泡與囊泡間的融合［23-24］。禾谷鐮刀菌中FgVam7-FgVps39-FgSso1作為一個蛋白復(fù)合體，在囊泡運輸、內(nèi)吞和自噬過程中發(fā)揮作用，從而控制植物的發(fā)育、植物感染和脫氧雪腐菌醇（DON）的產(chǎn)生［25］。

在過去的幾十年中，研究者已經(jīng)在各種不同真核生物中分析了分泌和內(nèi)吞途徑的組織，發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜系統(tǒng)的主要組織結(jié)構(gòu)和參與囊泡運輸?shù)姆肿訖C制是保守的。與其他真核生物一樣，絲狀病原菌依賴于傳統(tǒng)的運輸途徑，利用SNAREs促進蛋白質(zhì)分選到它們最終的細胞內(nèi)或細胞外位置。單細胞朝著多細胞生物的變化，一般認為SNARE家族會跟隨著大量增加，如綠色植物與后生動物［10］。只有隨著分泌型SNARE蛋白數(shù)量的增加，組織內(nèi)的單個細胞才能將物質(zhì)輸送到其質(zhì)膜的不同區(qū)域。在真菌中通常包含1組相對簡單的SNARE蛋白，主要由原真核細胞的SNAREs組成，而所有真菌都含有一種新的可溶性SNARE蛋白Vam7［26］。在大量真菌基因組的分泌途徑和內(nèi)吞途徑中存在的 SNARE家族成員，與廣泛研究的釀酒酵母比較，這些家族的大多數(shù)成員（包括參與胞吐作用的成員）都是保守的，出現(xiàn)特殊的SNARE蛋白可能表明，在這些真菌中發(fā)生了特殊的步驟［27］。

1.3 SNARE通常的作用模式

首先，新合成的所有SNAREs蛋白需由分泌途徑轉(zhuǎn)運到特定的膜區(qū)室。v-SNARE與需轉(zhuǎn)運的貨物蛋白一起裝配在剛出芽的分泌囊泡中，產(chǎn)生的配送中間體促進與靶膜相互融合。同時，運輸囊泡的形成可能也與SNAREs蛋白和包被蛋白的直接互作密切相關(guān)，如運輸小泡在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的形成，這需要SNAREs與COPⅡ的相互作用［28-29］。類似的，Vti1b與epsinR的互作也介導(dǎo)了晚期內(nèi)涵體和跨高爾基體間來回運輸囊泡的形成。此外研究發(fā)現(xiàn)，Vamp2在快速內(nèi)吞作用中可以作用于動態(tài)囊泡中，這也證明SNARE蛋白對促進轉(zhuǎn)運小泡的形成有功能作用［30］。

其次，由許多栓系因子參與的?？窟^程中，運輸囊泡可以精準(zhǔn)定位于含有t-SNARE的靶膜上。栓系因子可作用于囊泡與靶膜并長距離的往返，有利于相同v-SNARE和t-SNARE之間的正確而有效的配對。如在早期分泌途徑中，栓系因子 nbsp;P115 "可促進2個SNARE蛋白復(fù)合體的形成［31］。

再次，隨著反式高爾基體的快速形成，位于相對應(yīng)的v-SNARE（運輸囊泡相關(guān)）和t-SNARE（靶膜相關(guān)）互作，它們形成了1個非常穩(wěn)定的四聚體復(fù)合物并在2個膜之間形成合適的連接［32］。四螺旋復(fù)合物裝配前，SNAREs模體可以被認為是沒有結(jié)構(gòu)的。SNARE復(fù)合體在組裝時ATP水解產(chǎn)生的能量，被用于抵消磷脂雙分子層的磷脂基團負電荷斥力，跨膜結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生促進囊泡與靶膜的相互融合。伴隨著融合的完成，反式復(fù)合體在靶膜上松弛形成順式SBARE復(fù)合體（cis-complex）結(jié)構(gòu)。

最后，cis-SNARE復(fù)合體需要被拆散，以便后續(xù)的轉(zhuǎn)運。該過程有3個a-SNAP、六聚體形式的NSF，它們與cis-SBARE復(fù)合體相互作用促進20S的瞬時復(fù)合體的形成。cis-SBARE復(fù)合體在NSF水解ATP提供能量的情況下發(fā)生解離，分離后的SNARE推動后續(xù)循環(huán)的錨定和膜融合［33］。

2 植物病原真菌中SNARE蛋白基因的功能研究

目前，研究者已經(jīng)從植物病原菌真菌稻瘟病病菌、禾谷鐮刀菌、大麗輪枝菌、金黃殼囊孢菌、炭疽病菌、番茄枯萎病病菌、粗糙脈孢菌、小麥赤霉病病菌、玉米黑粉病病菌中鑒定出大量SNARE蛋白編碼基因，并對定位于不同分泌途徑中的SNARE蛋白采用遺傳操作技術(shù)進行功能分析。

2.1 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的SNARE蛋白

在模式真核生物釀酒酵母中，Qa-SNARE蛋白Sed5p在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向早期高爾基體的順運輸中，與其他幾種SNARE蛋白裝配，至少參與組裝了6種預(yù)測的SNARE復(fù)合物，一個復(fù)合體與Qb-SNARE Bos1p、Qc-SNARE Bet1p及R-SNARE Sec22p共同組成［34］。定位于高爾基體的Sed5p可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生膜泡上的所有SNARE形成復(fù)合物，促進膜泡與早期的高爾基器融合［35］。逆向運輸中定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的Qa-SNARE蛋白是必要的， 但這個運輸過程還需R-SNARE （Sec22p）、Qc-SNARE（Bet1p） 和Tip20p/Sec20p蛋白的參與［36-37］。而Ufe1p也被證明通過不涉及其他SNARE 的寡聚相互作用介導(dǎo)ER膜的同型融合［38］。

Sec22是參與真核生物膜融合的重要R-SNARE，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，有助于囊泡的順行和逆行運輸。在釀酒酵母中Sec22是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體復(fù)合體之間囊泡運輸所必需的，人們普遍認為， "Sec22 "突變在順行轉(zhuǎn)運和逆行轉(zhuǎn)運中都會導(dǎo)致缺陷［36，39-40］。然而，后來的研究證明， "Sec22 "突變不能影響順行轉(zhuǎn)運，只能延緩逆行轉(zhuǎn)運。 "Ykt6 "也是酵母分泌途徑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體運輸過程中囊泡相關(guān)SNARE蛋白的必需基因， "Ykt6p "的缺失會導(dǎo)致液泡酶羧肽酶Y的p1前體（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形式）的積累，以及與分泌缺陷一致的形態(tài)異常［41］。在稻瘟病病菌中，通過基因敲除/置換的方法獲得 "ΔMosec22及ΔMotlg2基因敲除突變體，MoSec22 "的缺失導(dǎo)致分生孢子和附著胞形成減少，無法產(chǎn)生分生孢子，菌絲側(cè)壁有異常的幾丁質(zhì)沉積。此外，對氧化應(yīng)激的超敏性與細胞外酶、過氧化物酶和漆酶的表達降低有關(guān)［42］。 "Motlg2 "基因?qū)τ陧敹说男纬珊蛶锥≠|(zhì)的極地分布是重要的， "Motlg2 "基因的缺失會導(dǎo)致營養(yǎng)生長減慢、分生孢子減少，但毒力與野生型相同［43］。在絲狀子囊菌中，使用同源重組的方法敲除 "Sec22 "后，突變體的子囊孢子數(shù)量不僅減少，而且存在著色、萌發(fā)缺陷，但營養(yǎng)生長正常［44］。在大麗輪枝菌中，靶向基因缺失 "VdSec22 "，突變體對棉花的毒力顯著降低， "VdSec22 "基因參與了碳水化合物水解酶的調(diào)節(jié)及胞外蛋白分泌［45］。在禾谷鐮刀菌中， "FgSec22 "基因的丟失會影響正常分生孢子形成和發(fā)病機制，與野生型相比顯著減少了與致病相關(guān)的DON毒素的產(chǎn)生［46］。在金黃殼囊孢菌中敲除 "CcSec22基因后，ΔCcSec22 "突變體的生長速率顯著減慢，且菌絲分枝數(shù)量增多，對楊樹枝條的致病力顯著下降，熒光增白劑（CFW）與剛果紅（CR）脅迫表現(xiàn)出更強的耐受性［47］。在炭疽病病菌中， "Sec22 "基因的替換減少了效應(yīng)子DN3向生物營養(yǎng)界面（BIC）的輸送［48］。以上所有研究結(jié)果表明， "Sec22 "在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)毒力相關(guān)蛋白的運輸中起著重要作用，并在植物病原體的生長、發(fā)育和致病性中發(fā)揮著重要作用。

2.2 定位于質(zhì)膜的SNARE蛋白

在釀酒酵母中，高爾基器衍生的分泌囊泡與質(zhì)膜的錨定和融合過程需要1個三元SNARE復(fù)合物，該復(fù)合物由1個來自重復(fù)的SNARE Sso1p和Sso2p（Qa 螺旋）中的1個螺旋組成，1個來自Snc1p和Snc2p中的1個螺旋（R螺旋）和來自Sec9p的2個螺旋（同時包含Qb和Qc螺旋）。一般而言，Sso1p/2p和Sec9穩(wěn)定的定位在質(zhì)膜上，但Snc1p/2p則遍布質(zhì)膜到高爾基器間，并參與分泌性和胞吞性膜泡轉(zhuǎn)運［49-50］。

在釀酒酵母中，定位在高爾基體和質(zhì)膜之間的Q-SNARE Sso1可以促進運輸小泡與質(zhì)膜的相互融合，過表達Sso1或Sso2蛋白，發(fā)現(xiàn)增加了分泌蛋白的數(shù)量［23，51］。此外，這2種SNAREs蛋白對釀酒酵母正常生長發(fā)育至關(guān)重要［52-53］。Sso1p在釀酒酵母孢子的形成過程中起著重要作用，218位的谷氨酸殘基對于Sso1產(chǎn)孢功能是至關(guān)重要的［54］。粗糙脈孢菌中作用于菌絲頂端及囊泡極化外分泌過程中的 "SSO同源基因NSYN1、NSYN2，NSYN1的缺失突變會導(dǎo)致生長緩慢，菌絲直徑和極性異常，分生孢子缺陷，并且雄性不育。當(dāng)NSYN2 "菌絲生長緩慢、形態(tài)和分枝異常時，不會產(chǎn)生子囊孢子或會萌發(fā)不良的子囊孢子［55］。在白色念珠菌中也得出相似的結(jié)果， "Sso2 "在四環(huán)素調(diào)控下，突變株的分泌囊泡大量積累，出現(xiàn)異常加寬的芽頸細胞，天冬氨酰蛋白酶和脂肪酶的分泌存在缺陷，當(dāng)存在DOX時，生長表現(xiàn)出明顯的絲狀缺陷，菌絲尖端發(fā)育成球狀酵母樣結(jié)構(gòu)［56］。在小麥赤霉病病菌中，靶向基因缺失 "SSO同源基因GzSYN1、GzSYN2，ΔGzSYN1突變體菌絲生長嚴重減慢，能產(chǎn)生子囊孢子正常的子囊壁。而GzSYN2突變體自身及雌性的可育性受到嚴重影響，菌絲能正常生長，ΔGzSYN1、ΔGzSYN2 "對大麥的毒力下降。GFP：：GzSYN1融合蛋白定位于囊泡、液泡、質(zhì)膜和間隔中，而GFP：：GzSYN2融合蛋白僅存在于質(zhì)膜和間隔中［57］。在稻瘟病病菌中，麥角固醇生物合成缺陷破壞了PM中脂筏的形成，導(dǎo)致MoSso1異常分布，抑制了其與v-SNARE蛋白MoSnc1的相互作用，而MoSso1-MoSnc1相互作用對生物營養(yǎng)界面復(fù)合體（BIC）的發(fā)育和細胞質(zhì)效應(yīng)蛋白的分泌是重要的［58］。用基因敲除技術(shù)對 "MoSso1、MoSso2功能進行分析發(fā)現(xiàn)，MoSso1 "的缺失導(dǎo)致BIC發(fā)育缺陷，與野生型菌株相比，致病性顯著下降，細胞質(zhì)效應(yīng)子分泌異常［59］。 "MoSso2 "缺失突變體致病性與野生型一致，但 "MoSso2 "參與菌絲生長、分生孢子和附著胞形成等過程［60］。在禾谷鐮刀菌中分別敲除 "FgSso1與FgSso2基因，發(fā)現(xiàn)FgSso1突變體菌株的菌落變小且不能正常產(chǎn)生茂盛的菌絲，產(chǎn)孢量也出現(xiàn)一定程度下降。FgSso1 "突變體對鹽脅迫更加耐受，滲透脅迫、氧化脅迫和剛果紅細胞壁脅迫更加敏感，DON毒素含量降低，相關(guān)基因的表達量顯著降低［61］。 "ΔFgSso2 "缺失突變體生長改變、對異生物質(zhì)的敏感性增加、基因表達譜改變及DON在體外、體內(nèi)的積累減少，降低了小麥赤霉病的癥狀［62］。在大麗輪枝菌中， "VdSso1 "缺失突變體會減弱多種碳源的分解代謝，并使致病力下降，同時使得棉花葉片上的外蛋白體細胞毒活性喪失［45］。在番茄枯萎病病菌中，敲除 "FolSso1基因后，ΔFolSso1缺失突變體生長速率降低，產(chǎn)孢數(shù)量減少，致病性無顯著變化，另外，ΔFolSso1 "缺失突變體對細胞壁和細胞膜壓力更加敏感［63］。在金黃殼囊孢菌中敲除 "CcSso1 "基因后，突變體顯著降低了對楊樹枝條的致病力，使其生長發(fā)育產(chǎn)生缺陷，對H 2O 2耐受力顯著增強［47］。

在釀酒酵母中，Sec9p穩(wěn)定定位于質(zhì)膜上，在營養(yǎng)生長和孢子形成期間參與蛋白的分泌［26］。Novick等通過同源重組分離到攜帶釀酒酵母 "SEC9 "突變的菌株，發(fā)現(xiàn)這些溫度敏感菌株在蔗糖酶分泌和積累膜結(jié)合分泌細胞器方面存在缺陷［64］。在四環(huán)素調(diào)控下，白色念珠菌 "SEC9 "突變株在DOX存在下生長，積累了晚期分泌囊泡，并且芽頸變寬，菌絲生長速率降低，在天冬氨酰蛋白酶和脂肪酶分泌方面存在缺陷［56］。上述結(jié)果表明，突觸融合蛋白（syntaxins）在真菌的發(fā)育和毒力中起到關(guān)鍵作用。

2.3 胞吞作用通路上的SNARE蛋白

在釀酒酵母中，定位于液泡的SNARE不但介導(dǎo)晚期高爾基體、胞內(nèi)體和自噬體等物質(zhì)輸送到液泡進行降解的過程［37，65-66］，而且干預(yù)同型液泡的融合，需要Q-SNAREs Vam3p（Qa）、Vam7p（Qc）、Vti1p（Qb）和R-SNARE Nyv1p的參與。然而，在高爾基體衍生物的膜泡、胞內(nèi)體或自噬體與液泡的融合過程中，需要相同的Q-SNARE和另一種R-SNARE、Ykt6p［67-69］。SNARE蛋白Tlg1p參與對于酵母生長位點幾丁質(zhì)合成酶的盤活及對維持反面高爾基體網(wǎng)的居家蛋白是重要的，而Sft1p則參與了早期高爾基體的嵴與晚期高爾基體蛋白膜泡的融合［70］。

在酵母中， "Vam3 "基因缺失突變體在多個液泡蛋白的成熟過程中表現(xiàn)出缺陷，并包含大量異常膜封閉腔室［37］。Vam7p蛋白在液泡隔膜與胞漿之間來回運輸，啤酒酵母中 "Vam7p "突變體不能產(chǎn)孢，含有許多不規(guī)則、形態(tài)多樣的液泡，另外， "Vam7p "突變體在酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基上生長的菌絲分叉更少［71-72］。玉米黑粉菌Vam7的同源蛋白Yup1定位于液泡和快速移動的內(nèi)含體，溫度敏感突變體細胞壁成分的極性分布存在缺陷，并表現(xiàn)出異常形態(tài)［5］。在小麥赤霉病病菌中，基于同源重組敲除 "GzVam7基因后，GzVam7 "對液泡的維持和胞吞作用存在缺陷，并影響了赤霉病菌的營養(yǎng)生長和發(fā)育，對小麥麥穗的致病性顯著下降［73］。在稻瘟病病菌中采用基因敲除/置換、插入突變等方法獲得 "ΔMoVam7、ΔMosyn8、ΔMotom/Stor7、ΔMonyv1和ΔMosnc突變體。ΔMoVam7 "敲除突變體存在異常碎裂的空泡，營養(yǎng)生長減慢，分生孢子不良，不能產(chǎn)生侵染結(jié)構(gòu)附著胞，細胞壁變?nèi)?，與野生型相比菌絲頂端的活性氧（ROS）積累減少，不會在水稻上引起病害［74］。 "ΔMosyn8突變體在內(nèi)吞作用、組織、附著胞膨壓產(chǎn)生和寄主穿透等方面存在缺陷，在未受傷的葉片中表現(xiàn)出較低的致病性。此外，ΔMosyn8 "突變體不能闡明對感病寄主的生物營養(yǎng)入侵，也不能分泌無毒因子［75］。 "ΔMosnc突變體的產(chǎn)孢量顯著下降，附著胞的產(chǎn)生異常，然而Monyv1、Motom "基因的缺失對稻瘟病菌生長發(fā)育和致病性無明顯影響［60］。稻瘟病菌中的 "MoRab7 "基因可以將逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合體招募到液泡膜上，能夠識別一批SNARE蛋白，其中MoSnc1的含量最高，MoSnc1被證明主要積累在菌絲生長區(qū)和亞頂端BIC相關(guān)的細胞中［59］。對 "ΔMosnc1 "突變體的營養(yǎng)生長、分生孢子形成和附著胞形成的表型分析表明，與野生型（WT）相比沒有任何重大差異，但 "MoSnc1 "對于通過細胞質(zhì)和質(zhì)外體界面（分別為BIC和EIHM）有效分泌囊泡/效應(yīng)物是關(guān)鍵的，對稻瘟病病菌的致病也是必不可少的［76］。在禾谷鐮刀菌中，利用基因敲除技術(shù)獲得 "ΔFgpep12、ΔFgVAM7缺失突變體，F(xiàn)gPep12 "基因的缺失會導(dǎo)致營養(yǎng)生長、分生孢子發(fā)生、子囊形成和致病力的缺陷［77］。 "FgVAM7 "的缺失顯著影響了無性發(fā)育及有性繁殖，并降低了禾谷鐮刀菌的毒力。 "Fgvam7 "突變體在液泡維持和延遲內(nèi)吞方面也表現(xiàn)出缺陷，對鹽脅迫和滲透脅迫不敏感，對細胞壁應(yīng)激敏感。并且 "FgVam7 "被證明能積極調(diào)控脫氧雪腐菌醇（DON）生物合成基因 "TRI5、 TRI6和TRI101 "的表達和DON的產(chǎn)生［78］。FgVam7- FgVps39-FgSso1作為1個蛋白復(fù)合體在禾谷鐮刀菌的囊泡運輸、內(nèi)吞和自噬過程中發(fā)揮作用，控制植物發(fā)育、植物感染和脫氧雪腐菌醇（DON）的產(chǎn)生［25］。 "FgSnc1在禾谷鐮刀菌中參與調(diào)節(jié)分泌囊泡與質(zhì)膜的融合，在不存在FgSnx41或FgSnx4的情況下，F(xiàn)gSnc1 "在液泡中錯誤分選和降解，并且任一組分的無效缺失會造成真菌極化生長和毒力方面的缺陷［79］。番茄枯萎病病菌中的靶向基因 "FolVam7缺失，表型分析表明，F(xiàn)olVam7 "對植物營養(yǎng)生長、無性發(fā)育、分生孢子形態(tài)和植物侵染具有重要作用。此外， "Folvam7 "突變體對鹽和滲透脅迫不敏感，對細胞壁應(yīng)激源高度敏感［80］。同樣的，在炭疽病病菌中，敲除 "CfVam7基因后發(fā)現(xiàn)，CfVam7在生長、致病性和對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)脅迫的反應(yīng)中具有重要作用，是附著胞形成和同型空泡融合所必需的，對病原菌的入侵至關(guān)重要。CfVam7 "的Phox同源（Px）和SNARE結(jié)構(gòu)域?qū)τ谡５募毎ㄎ缓蜕飳W(xué)功能是必不可少的［81］。綜上所述， "Vam7 "介導(dǎo)的液泡膜融合促進了病原菌的生長、脅迫反應(yīng)和致病性。

3 植物病原卵菌中SNARE蛋白基因的功能研究

目前，研究者在植物病原菌卵菌中開展SNARE蛋白編碼基因研究的只有大豆疫霉，由于疫霉菌同源重組概率較低， 因此傳統(tǒng)同源重組基因敲除技術(shù)在疫霉菌中的應(yīng)用不成功。在基于CRISPR-Cas 系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)出現(xiàn)之前，對疫霉病病菌基因功能的研究均采用RNA干擾技術(shù)。目前報道的植物病原卵菌中的SNARE蛋白編碼基因的功能研究均基于RNA干擾技術(shù)開展。

定位于質(zhì)膜的SNARE蛋白編碼基因 "PsSso1/Sso2 "的沉默顯著降低了大豆疫霉的致病性，表型分析發(fā)現(xiàn)，卵孢子的產(chǎn)生數(shù)量明顯下降，菌絲的生長速率減慢并出現(xiàn)“雞爪”狀分枝，細胞壁的完整性及肌動蛋白的分布異常，液泡的維持及內(nèi)吞作用無顯著影響。滲透脅迫、氧化脅迫、溫度與野生型相比影響各有不同。另外，胞外分泌的漆酶顯著降低，突變體的RXLR效應(yīng)蛋白PsAvr1b分泌也明顯減少［82］。

胞吞作用通路上的SNARE蛋白編碼基因 "Ykt6p、PsVamp7、PsTlg1， "采用基因沉默遺傳操作技術(shù)處理，可以系統(tǒng)研究這些基因在大豆疫霉生長、發(fā)育和致病過程中的作用。 "PsYkt6 "沉默突變體表現(xiàn)出營養(yǎng)生長遲緩和形態(tài)異常，生長嚴重抑制，幾乎不產(chǎn)生孢子或形成極少數(shù)畸形孢子囊，卵孢子產(chǎn)量明顯減少，突變體毒性喪失［83］。 "PsVamp7 "基因的突變顯著降低了致病性，對無性生長發(fā)育無明顯影響，但突變體的卵孢子數(shù)量減少，對維持液泡的大小、內(nèi)吞作用、細胞壁完整性及肌動蛋白分布存在明顯的缺陷，對氧化脅迫和高溫脅迫的反應(yīng)異常。另外 "PsVamp7 "與胞外漆酶、果膠酶等的分泌密切相關(guān)［82］。 "PsTlg1沉默突變體顯著降低了菌株的致病性，表型分析發(fā)現(xiàn)，PsTlg1沉默突變影響了菌絲無性生長發(fā)育和有性生殖，使得肌動蛋白分布異常，液泡的維持及內(nèi)吞作用有明顯缺陷。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，PsTlg1突變體中PsLac4和PsLac5基因顯著下調(diào)表達，進一步證明PsTlg1 "與另外1個SNAREs蛋白 "PsTlg2 "直接互作［82］。

4 展望

相對于酵母菌等真核生物的經(jīng)典分泌途徑，絲狀真菌頂端小泡的高度極化胞吐在一定程度上決定其高效分泌［84］。植物病原菌分泌的效應(yīng)蛋白在幫助病原菌侵染、干擾寄主免疫方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但產(chǎn)生的所有效應(yīng)分子在與寄主作用之前必須被分泌出去。與許多植物病原細菌效應(yīng)蛋白通過Ⅲ型或Ⅳ型分泌系統(tǒng)的方式不同，關(guān)于植物絲狀病原菌效應(yīng)蛋白分泌機制的研究尚不清晰［4，85］。SNARE蛋白家族有助于運輸囊泡與靶器官的有效和可控融合，作為膜融合的關(guān)鍵組分，某些關(guān)鍵的SNARE蛋白在傳遞與致病性相關(guān)的分泌蛋白中起重要作用，對功能的全面剖析、對寄主-病原菌相互作用機制及生物藥劑的創(chuàng)制等有很大幫助。目前，雖然從不同植物絲狀病原菌中鑒定出了許多SNARE蛋白，但已知其具體功能的蛋白所占比例卻還是很低。目前，遺傳轉(zhuǎn)化體系與基因編輯體系的不完善，對基因功能的研究比較困難。另一方面，絲狀病原菌的DNA轉(zhuǎn)化效率低且難挑選問題嚴重限制了致病機制的功能研究。但是，隨著基因組學(xué)、外泌蛋白質(zhì)組學(xué)及囊泡蛋白質(zhì)組學(xué)等先進技術(shù)的發(fā)展，改良和完善的CRISPR/Cas、RNAi和HIGS等分子工具將極大地促進和加速真菌與卵菌功能基因組的研究，對于更深入地闡明植物病原真菌及卵菌的致病機制、新藥物靶標(biāo)篩選及病害綠色防控技術(shù)的發(fā)展具有重要的意義和價值。

為了完全解析植物病原真菌和卵菌效應(yīng)蛋白分子轉(zhuǎn)運機制、病原菌致病機制，還需要進一步開展以下3個方面的研究：（1）結(jié)合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)分析鑒定病原真菌與卵菌中各物種的SNARE蛋白家族組成，對在囊泡轉(zhuǎn)運不同階段發(fā)揮作用的SNAREs蛋白進行深入挖掘，全面分析SNAREs的定位及作用。（2）結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)分析篩選出參與效應(yīng)蛋白分泌的關(guān)鍵SNARE蛋白基因，通過基因敲除或沉默的方法分析SNARE蛋白基因參與效應(yīng)蛋白分泌的作用和程度，進一步解析SNARE蛋白調(diào)控病原菌致病的生物學(xué)機制，為后續(xù)關(guān)鍵藥物靶標(biāo)的挖掘和篩選奠定重要基礎(chǔ)。（3）目前還對SNARE蛋白如何介導(dǎo)囊泡運輸和液泡融合，以及哪些蛋白質(zhì)共同起作用了解得很少，因此在研究單個蛋白的基礎(chǔ)上深入組學(xué)研究，深入研究運輸囊泡過程中與SNARE蛋白協(xié)調(diào)作用的蛋白，有助于闡明它們在不同植物絲狀病原菌效應(yīng)蛋白分泌途徑中的主次關(guān)系，進而揭示病原菌分泌效應(yīng)蛋白的全景機制。

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收 稿日期：2023-02-07

基金項目：國家重點研發(fā)計劃 （編號：2021YFE0109600）；云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項重點基金（編號：2018FG001-001）。

作者簡介：楊明王（1997—），男，云南昭通人，碩士研究生，主要從事疫霉菌功能基因組學(xué)研究。 E-mail：2411313669@qq.com。

通信作者：趙志堅，博士，研究員，主要從事疫霉菌災(zāi)變機制及病害精準(zhǔn)防控研究，E-mail：zhaozj@yaas.org.cn；吳德喜，博士，教授，主要從事植保及微生物資源利用研究，E-mail：163wdx@163.com。