摘要： 為構(gòu)建高產(chǎn)巨大戟醇的鐵海棠毛狀根培養(yǎng)體系，研究比較了6個(gè)不同品種鐵海棠莖葉部分的巨大戟醇含量，以含量高的鐵海棠原種的花梗及葉盤為外植體，考察不同菌株以及不同侵染條件對(duì)其誘導(dǎo)率的影響，篩選適宜鐵海棠毛狀根生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基，并比較了鐵海棠毛狀根和植株中的巨大戟醇含量差異。結(jié)果表明：（1）鐵海棠6個(gè)品種間巨大戟醇含量存在顯著差異，含量最高的為鐵海棠原種。（2）以鐵海棠原種的花梗為外植體，預(yù)培養(yǎng)7 d，以D 600 nm=0.6的Ar A4菌液侵染6 min，轉(zhuǎn)入1/2MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3 d可獲得最佳轉(zhuǎn)化效果，毛狀根誘導(dǎo)率最高達(dá)68.33%。（3） 毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，長(zhǎng)勢(shì)良好。（4）毛狀根中巨大戟醇的含量顯著高于鐵海棠原種植株中各部位的含量，達(dá)到593.14 mg/kg，鮮質(zhì)量為0.50 g的毛狀根經(jīng)懸浮培養(yǎng)10 d后，可獲得132.27 μg巨大戟醇。 鐵海棠6個(gè)品種中以鐵海棠原種巨大戟醇含量最高，利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4 侵染鐵海棠原種花梗，成功建立了鐵海棠毛狀根的高效誘導(dǎo)及懸浮培養(yǎng)體系，且獲得的毛狀根中巨大戟醇含量高于原植株，為高效獲得巨大戟醇提供了新的途徑。

關(guān)鍵詞： 鐵海棠；巨大戟醇；毛狀根；發(fā)根農(nóng)桿菌；誘導(dǎo)率

中圖分類號(hào)：S567.1+90.43 "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）01-0134-07

巨大戟醇是巨大戟烷型二萜類活性化合物，是合成巨大戟醇甲基丁烯酸酯的主要原料［1-2］，該成分制成的外用凝膠劑（藥品名Picato）已在國(guó)外上市，用于治療日光性角化病和皮膚癌［3］。目前原料巨大戟醇主要是從大戟屬植物植株中分離得到，然而植株中的巨大戟醇含量很低，全合成法獲得巨大戟醇又存在著工藝難度大、成本高等產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)難題［4］，因此原料巨大戟醇來(lái)源匱乏的問(wèn)題一直制約著其衍生物的藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定了大戟科61種植物植株堿水解后的巨大戟醇含量，發(fā)現(xiàn)鐵海棠（Euphorbia milii Ch. des Moulins）中含有相對(duì)較多的巨大戟醇，其植株地上部分巨大戟醇含量為136.17 mg/kg（干質(zhì)量）［5］。因此，鐵海棠可作為巨大戟醇生產(chǎn)研究的理想植物材料。

鐵海棠是大戟科（Euphorbiaceae）大戟屬（Euphorbia）多年生蔓生灌木，別名虎刺梅、麒麟刺等，原產(chǎn)非洲（馬達(dá)加斯加），廣泛栽培于熱帶和溫帶地區(qū)［6］。鐵海棠也是一種藥用植物，以莖葉、根及乳汁入藥，性味苦澀涼，有小毒，入心經(jīng)，具有解毒活血、排膿逐水等功效［7］。研究表明鐵海棠次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分主要為黃酮類、三萜類、二萜類及酚類等［8-10］，其中包括大戟科植物特有的巨大戟醇酯類化合物。巨大戟醇酯類化合物是以巨大戟醇為母核酯化衍生出的一類大戟大環(huán)二萜酯，具有顯著的抗癌、抗病毒及生物農(nóng)藥活性等［11-13］，其經(jīng)堿水解后得到巨大戟醇［5］。

大量研究表明，利用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）對(duì)藥用植物進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)，獲得的毛狀根生長(zhǎng)迅速，無(wú)需添加外源植物激素即可自主持續(xù)生長(zhǎng)，能夠合成原植物所含的次生代謝產(chǎn)物，且得到的次生代謝物產(chǎn)量可能高于原植物［14-15］。利用毛狀根培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)在蒙古黃芪、甘草、鉤藤、王不留行等很多藥用植物中成功應(yīng)用［16-19］。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鐵海棠的研究主要集中于其化學(xué)成分及藥理活性，尚未見(jiàn)關(guān)于鐵海棠毛狀根培養(yǎng)的研究報(bào)道。因此，系統(tǒng)研究鐵海棠毛狀根誘導(dǎo)體系的構(gòu)建，篩選合適的培養(yǎng)條件從而高效地獲得巨大戟醇，為解決巨大戟醇來(lái)源匱乏問(wèn)題提供了新途徑。

本研究選取鐵海棠6個(gè)不同品種植株為試驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定并比較不同品種間巨大戟醇含量差異，篩選出含量最高、最適于進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)的材料后，對(duì)影響鐵海棠毛狀根誘導(dǎo)效率的因素進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)篩選毛狀根液體培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，建立優(yōu)化鐵海棠毛狀根培養(yǎng)體系，并比較鐵海棠毛狀根及原植株中巨大戟醇的總含量，以期獲得高產(chǎn)巨大戟醇的毛狀根培養(yǎng)體系，為高效獲得巨大戟醇提供新的途徑，為鐵海棠藥用資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021—2022年在江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所天然產(chǎn)物化學(xué)研究中心（32°3′32″N，118°49′50″E）進(jìn)行。樣品采自中山植物園南園溫室，經(jīng)田梅助理研究員鑒定為大戟科大戟屬鐵海棠的6個(gè)不同品種，將其編號(hào)為品種A～F（圖1），分別為大基督虎刺梅（A）、鐵海棠原種（B）、凱西虎刺梅（C）、小基督虎刺梅（D）、白花虎刺梅（E）、塔城虎刺梅（F）。發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4、ATCC 15834、MSU 440菌株均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

試驗(yàn)所用的主要儀器設(shè)備有：Agilent 1260 HPLC-DAD-6530 ESI Q-TOF MS液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）、超凈工作臺(tái)SW-CJ-1FD（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、METTLER AE240 電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）等；試驗(yàn)用的對(duì)照品巨大戟醇購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同品種的鐵海棠植株巨大戟醇含量測(cè)定

將以上6個(gè)品種的鐵海棠上部莖葉用清水沖洗后晾干，放入液氮速凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，凍干完成后用打粉機(jī)打成均勻粉末，室溫避光儲(chǔ)存于干燥皿中備用。

稱取上述樣品各50 mg，按照Chen等的方法［5］進(jìn)行甲醇提取及堿水解處理，將其制成濃度為 10 mg/mL 的樣品，按照“1.2.7”節(jié)中的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行巨大戟醇含量測(cè)定。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巨大戟醇含量。

1.2.2 毛狀根的誘導(dǎo)

1.2.2.1 無(wú)菌外植體的制備

取鐵海棠原種的花梗和葉片，用加有適量洗衣粉的水浸泡10～15 min，流動(dòng)自來(lái)水沖洗30 min。將其移至超凈工作臺(tái)中，進(jìn)行無(wú)菌操作。75%乙醇消毒45 s，無(wú)菌水沖洗2次，0.1%氯化汞消毒5 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。將花梗切成長(zhǎng)度為1 cm左右的小段，葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小的葉盤，接種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)7 d。

1.2.2.2 農(nóng)桿菌的活化及菌液制備

從-80 ℃超低溫冰箱中取出保存的菌株Ar A4、ATCC 15834、MSU 440各50 μL，分別加至5 mL YEB液體培養(yǎng)基中，在含發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4和ATCC 15834的培養(yǎng)基中各加入50 mg/L卡那霉素，含MSU 440的培養(yǎng)基中加入50 mg/L鏈霉素，28 ℃、185 r/min快速振蕩培養(yǎng)24 h，復(fù)蘇菌體。每種農(nóng)桿菌各取500 μL復(fù)蘇菌液加入50 mL YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的抗生素濃度與復(fù)蘇菌體時(shí)相同，在28 ℃、185 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，待菌液D 600 nm至0.4～0.8時(shí)，停止振蕩培養(yǎng)。將菌液5 000 r/min離心8 min，棄去上清，隨即加入等體積的MS液體培養(yǎng)基，并加入 100 μmol/L 乙酰丁香酮（AS），重懸菌體后用于侵染轉(zhuǎn)化。

1.2.2.3 毛狀根的誘導(dǎo)

待鐵海棠原種的花梗和葉盤預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，取出外植體放入上述已制備好的侵染菌液中，侵染4～8 min，取出外植體，用無(wú)菌濾紙將表面的菌液吸干，置于1/2MS固體培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗共培養(yǎng)2～4 d。共培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至含有400 mg/L頭孢噻肟鈉（Cef）的1/2MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每7 d換1次培養(yǎng)基，若無(wú)明顯菌斑長(zhǎng)出，則逐步降低Cef濃度，直至不添加Cef。

1.2.3 鐵海棠毛狀根PCR鑒定

分別取鐵海棠的毛狀根和鐵海棠原種植株根，用TIANGEN試劑盒（DP305）提取基因組DNA，以發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，鐵海棠原種植株根為陰性對(duì)照，PCR擴(kuò)增發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA上的rolB和rolC基因序列，所用rolB基因的上游引物為5′- C G A G G G G A T C C G A T T T G C T T T -3′，下游引物為5′- G A C G C C C T C C T C G C C T T C C T -3′；rolC基因的上游引物為5′- C T C C T G A C A T C A A A C T C G T C -3′，下游引物為5′- T G C T T C G A G T T A T G G G T A C A -3′。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 鐵海棠毛狀根液體培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，取長(zhǎng)勢(shì)良好的鐵海棠毛狀根0.50 g，分別轉(zhuǎn)移至不含激素的MS、1/2MS和White 3種液體培養(yǎng)基中，每組3瓶，蔗糖濃度為30 g/L，pH值為5.8，25 ℃、120 r/min 進(jìn)行振蕩暗培養(yǎng)，考察不同液體培養(yǎng)基對(duì)鐵海棠毛狀根生長(zhǎng)的影響。培養(yǎng)10 d后觀察鐵海棠毛狀根的生長(zhǎng)情況及增殖倍數(shù)，篩選出最適液體培養(yǎng)基。

1.2.5 鐵海棠毛狀根中巨大戟醇含量測(cè)定

為了比較鐵海棠毛狀根及鐵海棠原種植株中巨大戟醇及其衍生物的含量，將鐵海棠毛狀根及鐵海棠原種植株的根、莖、葉、花苞及花放入液氮速凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，凍干完成后用打粉機(jī)打成均勻粉末，室溫避光儲(chǔ)存于干燥皿中。分別稱取以上凍干粉末各50 mg，按照Chen等的方法［5］進(jìn)行甲醇提取及堿水解處理，將鐵海棠毛狀根以及鐵海棠原種的根、莖制成濃度為2 mg/mL的樣品，葉、花苞及花制成濃度為50 mg/mL的樣品，按照“1.2.7”節(jié)中的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取巨大戟醇對(duì)照品8.0 mg， 置于25 mL容量瓶中，加色譜甲醇超聲振蕩溶解，定容至25 mL，配制成濃度為0.32 mg/mL 的對(duì)照品母液。取巨大戟醇對(duì)照品母液，采用梯度稀釋法，由高到低用色譜甲醇分別稀釋成5個(gè)濃度梯度：2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/mL。按照“1.2.7”節(jié)中的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 色譜和質(zhì)譜條件

檢測(cè)儀器：安捷倫HPLC- Q-TOF-MS/MS（1260 HPLC + 6530 Q-TOF）；色譜柱：Agilent C18 column（2.7 μm，4.6 mm×100 mm）；流動(dòng)相：水（0.1%甲酸，A相），甲醇（0.1%甲酸，B相），檢測(cè)程序：0～5 min，40%～75% B；5～15 min，75% B；15～30 min，75%～ 100% B；30～40 min，100% B；40～50 min，40% B；流速： 0.5 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

質(zhì)譜離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；氣體流速：10.0 L/min；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3 500 V；毛細(xì)管出口電壓：130 V；錐孔電壓：65 V；八極桿電壓：750 V；霧化器壓力：50 psig；采集范圍：質(zhì)荷比100～1 300；碰撞能量：30 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

探究不同因素對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率的影響時(shí)，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次統(tǒng)計(jì)20個(gè)外植體的數(shù)據(jù)，3次重復(fù)共計(jì)60個(gè)外植體。采用Excel 2016和SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理和方差分析，采用Origin 2022進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照“1.2.7”節(jié)中的色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定各個(gè)濃度梯度的峰面積，以巨大戟醇濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），提取巨大戟醇特征離子（質(zhì)荷比313.00），以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示，巨大戟醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為 y=795 599 x+77 929，r2=0.999 3。線性范圍為0.125～2.000 μg/mL。

2.2 不同品種的鐵海棠植株中巨大戟醇含量

將不同品種的鐵海棠上部莖葉充分堿水解后，進(jìn)行液質(zhì)檢測(cè)。根據(jù)巨大戟醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算出不同品種鐵海棠上部莖葉中總巨大戟醇的含量，結(jié)果如圖3所示。不同品種的鐵海棠上部莖葉中巨大戟醇含量存在顯著差異（Plt;0.05），其中，以鐵海棠原種上部莖葉中巨大戟醇的含量最高，為157.09 mg/kg。因此，后續(xù)毛狀根誘導(dǎo)試驗(yàn)用鐵海棠原種的花梗及葉片進(jìn)行。

2.3 毛狀根的誘導(dǎo)

2.3.1 不同發(fā)根農(nóng)桿菌類型對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率的影響

本試驗(yàn)選用3種發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4、ATCC 15834、MSU 440分別侵染鐵海棠原種花梗。如表1所示，3種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株都可以有效誘導(dǎo)鐵海棠原種花梗產(chǎn)生毛狀根，但不同類型發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的毛狀根誘導(dǎo)率顯著不同，這可能是由于植物細(xì)胞對(duì)不同菌株的敏感性不同。3種菌株的誘導(dǎo)率由大到小依次為Ar A4＞MSU 440＞ATCC 15834，其中Ar A4對(duì)花梗毛狀根的誘導(dǎo)率可達(dá)66.67%，為誘導(dǎo)鐵海棠原種花梗形成毛狀根的最佳發(fā)根農(nóng)桿菌菌株。因此，后續(xù)試驗(yàn)用發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4進(jìn)行。

2.3.2 外植體類型對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率的影響

以發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4分別侵染鐵海棠原種的花梗和葉盤。由表2可知，Ar A4對(duì)花梗和葉盤的誘導(dǎo)能力不同，這說(shuō)明外植體不同，對(duì)毛狀根誘導(dǎo)的影響較大。其中，花梗的誘導(dǎo)率較高，誘導(dǎo)率可達(dá)66.67%。因此，用花梗作為鐵海棠毛狀根的誘導(dǎo)材料更合適。

2.3.3 發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4菌液濃度對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率的影響

發(fā)根農(nóng)桿菌菌液的濃度對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)率也有一定的影響。由表3可知，當(dāng)菌液濃度為D 600 nm=0.6時(shí)，誘導(dǎo)率最高，可達(dá)66.67%。當(dāng)菌液濃度過(guò)低時(shí)，農(nóng)桿菌數(shù)量少，誘導(dǎo)率低，當(dāng)農(nóng)桿菌濃度升高后，誘導(dǎo)率隨之提高，但當(dāng)菌液濃度過(guò)高時(shí)，外植體易褐化且除菌困難，誘導(dǎo)率降低。因此，在本試驗(yàn)中，菌液濃度為D 600 nm=0.6左右時(shí)，是適合誘導(dǎo)鐵海棠花梗產(chǎn)生毛狀根的菌液濃度。

2.3.4 侵染時(shí)間對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率的影響

試驗(yàn)設(shè)置4組不同的侵染時(shí)間，分別為4、6、8、10 min，20 d后分別統(tǒng)計(jì)各組的毛狀根發(fā)根數(shù)量。由表4可知，侵染6 min時(shí)誘導(dǎo)率最高，為68.33%。侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和過(guò)短都不利于毛狀根的誘導(dǎo)，侵染時(shí)間短，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率低，毛狀根誘導(dǎo)率低；隨著侵染時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，對(duì)外植體傷害較大，誘導(dǎo)后出現(xiàn)花梗兩端邊緣變黑且菌體過(guò)度繁殖等情況，毛狀根的誘導(dǎo)率下降。結(jié)果表明，侵染6 min時(shí)誘導(dǎo)率最高，是誘導(dǎo)鐵海棠毛狀根適合的侵染時(shí)間。

2.3.5 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率的影響

共培養(yǎng)時(shí)間是發(fā)根農(nóng)桿菌將T-DNA轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞基因組的時(shí)間，共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)率有重要影響。本試驗(yàn)設(shè)置共培養(yǎng)時(shí)間分別為2、3、4 d，并統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率。從表5可以看出，3個(gè)共培養(yǎng)時(shí)間均能誘導(dǎo)鐵海棠原種花梗產(chǎn)生毛狀根，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鐵海棠毛狀根的誘導(dǎo)率先上升后下降，其中共培養(yǎng)3 d時(shí)毛狀根的誘導(dǎo)率最高，可達(dá)66.67%，共培養(yǎng)4 d時(shí)誘導(dǎo)率降到36.67%，與 3 d 相比，降低了45.00%。因此，選用3 d作為誘導(dǎo)鐵海棠毛狀根的共培養(yǎng)時(shí)間最合適。

2.4 鐵海棠毛狀根液體培養(yǎng)基的篩選

共培養(yǎng)結(jié)束后將外植體轉(zhuǎn)到添加400 mg/L Cef的1/2MS除菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，約10 d后可觀察到花梗兩端長(zhǎng)出白色毛狀根（圖4-A），截取生長(zhǎng)良好的毛狀根在除菌培養(yǎng)基上單獨(dú)培養(yǎng)（圖4-B），待其生長(zhǎng)2周后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)（圖4-C）。毛狀根液體培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)結(jié)果（圖4-D至圖4-F，表6）顯示：1/2MS和MS液體培養(yǎng)基中的毛狀根生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈黃白色，具有很多細(xì)小分枝，增殖倍數(shù)分別為4.66和4.50；White液體培養(yǎng)基中鐵海棠毛狀根呈黃色，生長(zhǎng)狀態(tài)不佳且緩慢，增殖倍數(shù)只有2.18。說(shuō)明培養(yǎng)基不同，對(duì)鐵海棠毛狀根的生長(zhǎng)有較大的影響。結(jié)果表明，與White培養(yǎng)基相比，1/2MS和MS液體培養(yǎng)基更適于鐵海棠毛狀根的生長(zhǎng)。比較這3種培養(yǎng)基的配方發(fā)現(xiàn)，其無(wú)機(jī)鹽的種類和濃度不同，說(shuō)明1/2MS和MS培養(yǎng)基中所含的無(wú)機(jī)鹽可能更適于鐵海棠毛狀根的生長(zhǎng)。鐵海棠毛狀根在1/2MS液體培養(yǎng)基中增殖倍數(shù)高于MS液體培養(yǎng)基，推測(cè)可能是無(wú)機(jī)鹽濃度稍低更適于鐵海棠毛狀根的生長(zhǎng)。因此，篩選出 1/2MS 液體培養(yǎng)基為適宜鐵海棠毛狀根懸浮培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。

2.5 鐵海棠毛狀根PCR鑒定

以鐵海棠原種植株根作為陰性對(duì)照，以發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，PCR擴(kuò)增發(fā)根農(nóng)桿菌rolB和rolC基因。如圖5所示，2個(gè)鐵海棠毛狀根株系DNA均擴(kuò)增出了rolB和rolC基因片段，和發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4質(zhì)粒DNA擴(kuò)增出的rolB和rolC基因片段大小一致（rolB：622 bp；rolC：586 bp），正常植株根DNA未擴(kuò)增出rolB和rolC的基因片段。表明發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4中Ri質(zhì)粒的T-DNA已被成功整合到鐵海棠毛狀根基因中。

2.6 鐵海棠植株及毛狀根中巨大戟醇含量測(cè)定

將鐵海棠原種的根、莖、葉、花苞、花以及發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4誘導(dǎo)的毛狀根進(jìn)行充分堿水解，巨大戟醇酯全部水解為巨大戟醇后， 進(jìn)行液質(zhì)檢測(cè)。根據(jù)巨大戟醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算出鐵海棠毛狀根和鐵海棠原種根、莖、葉、花苞及花中總巨大戟醇的含量，結(jié)果如圖6所示。鐵海棠毛狀根的巨大戟醇含量顯著高于鐵海棠原種植株各組織部位中的巨大戟醇含量，達(dá)到593.14 mg/kg，分別是根、莖、葉、花苞及花中的1.72、3.73、42.61、39.49倍。鮮質(zhì)量為0.50 g的鐵海棠毛狀根在 1/2MS 液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)10 d后，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，由原來(lái)的 0.50 g 增殖到2.33 g，鐵海棠毛狀根含水量約為90%。因此，通過(guò)計(jì)算可以得出，0.50 g鐵海棠毛狀根經(jīng)懸浮培養(yǎng)10 d后，即可獲得 132.27 μg 巨大戟醇。由此可見(jiàn)，通過(guò)建立優(yōu)化鐵海棠毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，獲得的毛狀根能夠生產(chǎn)出高于鐵海棠正常植株中的巨大戟醇積累量，且與植株相比，毛狀根具有生長(zhǎng)迅速、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)。因此，該體系的建立為高效獲得巨大戟醇提供了新的途徑。

3 討論

毛狀根是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物較理想的原材料，具有生長(zhǎng)迅速、無(wú)需外源激素等特點(diǎn)，且能合成與原植物相同甚至更高含量的次生代謝產(chǎn)物［19］。本研究成功獲得了高產(chǎn)巨大戟醇的鐵海棠毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系，為利用鐵海棠毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)巨大戟醇等次生代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)受到許多因素的影響，如外植體類型、發(fā)根農(nóng)桿菌類型、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基種類等。

3.1 外植體的選擇

鐵海棠品種較多，本研究測(cè)定了鐵海棠6個(gè)不同品種莖葉部分的巨大戟醇含量，結(jié)果表明，不同品種的鐵海棠之間巨大戟醇含量存在顯著性差異。為獲得高產(chǎn)巨大戟醇的鐵海棠毛狀根培養(yǎng)體系，本研究以巨大戟醇含量最高的鐵海棠原種為植物材料，進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)試驗(yàn)。

利用發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，根、莖、葉、果實(shí)等均可作為外植體，對(duì)于同一植物，外植體不同，其誘導(dǎo)率也有一定差異。如何鳳發(fā)等以絞股藍(lán)組培苗的葉片、葉柄、莖段作為轉(zhuǎn)化材料時(shí)發(fā)現(xiàn)葉片的誘導(dǎo)率最高［20］。賈春秋等以苦參根、莖和幼芽切段為外植體，發(fā)現(xiàn)幼芽的誘導(dǎo)率較高［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，以鐵海棠原種的花梗和葉盤作為外植體均能誘導(dǎo)出毛狀根，但以花梗為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的誘導(dǎo)率可達(dá)66.67%。

3.2 發(fā)根農(nóng)桿菌類型、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)率的影響

對(duì)于同一植物細(xì)胞，不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株具有不同的毛狀根誘導(dǎo)能力。薛雯心等使用發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4、C58C1和A1476對(duì)黨參進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)，結(jié)果表明Ar A4誘導(dǎo)效果最好［22］。向倩倩等利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1和ATCC 15834誘導(dǎo)三葉青葉片，發(fā)現(xiàn)ATCC 15834在試驗(yàn)條件下不能誘導(dǎo)三葉青產(chǎn)生毛狀根，而C58C1則可以［23］。本研究選用的3種發(fā)根農(nóng)桿菌（Ar A4、ATCC 15834、MSU 440）均為農(nóng)桿堿型菌株，致根能力強(qiáng)，結(jié)果表明這3種菌株均能誘導(dǎo)鐵海棠原種產(chǎn)生毛狀根，但誘導(dǎo)能力不同，其中Ar A4的誘導(dǎo)率最高。

研究表明，菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等都會(huì)對(duì)毛狀根誘導(dǎo)率有一定的影響。王麗等誘導(dǎo)龍葵毛狀根時(shí)發(fā)現(xiàn)菌液濃度為D 600 nm=0.6時(shí)誘導(dǎo)率最高［24］。劉連旺等對(duì)地黃的研究結(jié)果表明侵染時(shí)間為10 min時(shí)，誘導(dǎo)效果最佳［25］。林志豪等研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜中國(guó)龍毛狀根誘導(dǎo)適宜的共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，此時(shí)誘導(dǎo)率較高且受到農(nóng)桿菌的污染較少［26］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌Ar A4在菌液濃度為D 600 nm=0.6，侵染時(shí)間為6 min，共培養(yǎng)時(shí)間為 3 d 時(shí)，對(duì)鐵海棠原種花梗的誘導(dǎo)率最高。菌液濃度低，侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間短時(shí)，毛狀根誘導(dǎo)率低；但當(dāng)菌液濃度過(guò)高，侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致菌體大量繁殖，外植體褐化死亡。因此，合適的菌液濃度、侵染時(shí)間以及共培養(yǎng)時(shí)間能夠提高毛狀根的誘導(dǎo)率。

3.3 培養(yǎng)基種類對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的影響

當(dāng)培養(yǎng)基成分不同時(shí)，毛狀根的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的差異性［27］。李云芳研究發(fā)現(xiàn)，在MS、1/2MS、B5、N6液體培養(yǎng)基中，1/2MS液體培養(yǎng)基最利于三七毛狀根的生長(zhǎng)［28］。高帥等分別用MS、1/2MS、B5、6-7-V和White等5種培養(yǎng)基培養(yǎng)金鐵鎖毛狀根，發(fā)現(xiàn)其在B5培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，而對(duì)于毛狀根總皂苷的積累而言，則是在1/2MS培養(yǎng)基中的積累量最高，在B5培養(yǎng)基中總皂苷的積累最少［29］。在本研究中，與MS、White培養(yǎng)基相比，1/2MS液體培養(yǎng)基更有利于鐵海棠毛狀根的生長(zhǎng)。

3.4 鐵海棠毛狀根體系的價(jià)值

許多研究表明，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)得到的毛狀根可以用于生產(chǎn)原植物所含的次生代謝產(chǎn)物，其含量甚至高于原植株。如張弘弛等對(duì)恒山黃芪毛狀根的總黃酮和總皂苷含量進(jìn)行測(cè)定表明，其含量分別是自然根中的1.72倍和2.31倍［30］。吳順等對(duì)鉤藤帶鉤枝條、幼根和毛狀根的鉤藤堿進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其毛狀根中鉤藤堿含量最高可達(dá)帶鉤枝條的2.06倍［18］。本研究通過(guò)測(cè)定比較鐵海棠毛狀根及鐵海棠原種植株根、莖、葉、花苞及花中巨大戟醇的總含量發(fā)現(xiàn)，鐵海棠毛狀根的巨大戟醇含量高于鐵海棠原種植株各組織部位中的巨大戟醇含量，分別是根、莖、葉、花苞及花中的1.72、3.73、42.61、39.49倍，達(dá)到593.14 mg/kg。0.50 g 鐵海棠毛狀根經(jīng)懸浮培養(yǎng)10 d即可獲得132.27 μg巨大戟醇，利用鐵海棠毛狀根體系生產(chǎn)巨大戟醇，具有生長(zhǎng)速度快、巨大戟醇含量高、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)，這為利用鐵海棠毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)巨大戟醇等次生代謝物奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究首次對(duì)大戟科植物鐵海棠進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)，對(duì)外植體、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、菌液濃度等條件進(jìn)行篩選，成功構(gòu)建了鐵海棠毛狀根的高效誘導(dǎo)及懸浮培養(yǎng)體系。該體系具有生產(chǎn)巨大戟醇等大戟二萜類次生代謝物的應(yīng)用潛力，為高效獲得巨大戟醇提供了新的途徑。后期還可對(duì)鐵海棠毛狀根進(jìn)行目的產(chǎn)物的誘導(dǎo)子篩選、毛狀根植株再生體系及轉(zhuǎn)基因植物培育等研究，充分利用毛狀根技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步開(kāi)展該類活性物質(zhì)生物合成研究和鐵海棠藥用資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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收 稿日期：2023-03-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32270404）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號(hào)：CX（22）3068］。

作者簡(jiǎn)介：孫 茜（1998—），女，江西萍鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事植物化學(xué)研究。E-mail：1063761910@qq.com。

通信作者：陳 雨，博士，研究員，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：ychen@jib.ac.cn。