摘要： 為驗(yàn)證玉米黑粉菌單倍體菌株平板交配現(xiàn)象可以明確不同交配型菌株的可行性，運(yùn)用稀釋純化法分離純化玉米黑粉菌單倍體菌株10個(gè)，將單倍體菌株兩兩混合后，運(yùn)用劃線法在固體培養(yǎng)基YPDA上培養(yǎng)7 d，選取菌落表面形成白色菌絲、鏡檢明確平板交配的菌株。通過(guò)注射接種玉米植株幼苗，分析各菌株組合對(duì)玉米植株的致病性。結(jié)果表明，在45組菌株組合中出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象的菌株組合有9種，因與同一單倍體菌株產(chǎn)生平板交配現(xiàn)象的菌株為相同交配型菌株，由此可知3號(hào)菌株、5號(hào)菌株、8號(hào)菌株及9號(hào)菌株為相同交配型菌株；1號(hào)菌株、4號(hào)菌株、6號(hào)菌株、7號(hào)菌株及10號(hào)菌株為相同交配型菌株。通過(guò)玉米侵染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在45組菌株組合中有26種組合可以引起玉米植株腫瘤，26種組合中每組中的2個(gè)單倍體菌株為不同型單倍體菌株，進(jìn)而明確2號(hào)菌株、3號(hào)菌株、5號(hào)菌株、8號(hào)菌株及9號(hào)菌株為相同交配型菌株；1號(hào)菌株、4號(hào)菌株、6號(hào)菌株、7號(hào)菌株及10號(hào)菌株為相同交配型菌株。除2號(hào)菌株外，通過(guò)平板交配現(xiàn)象推導(dǎo)結(jié)果與玉米侵染試驗(yàn)獲得的結(jié)果完全一致。本研究表明通過(guò)玉米黑粉菌單倍體菌株平板交配現(xiàn)象可以進(jìn)行菌株的不同交配型鑒定。

關(guān)鍵詞： 玉米黑粉菌；平板交配；交配型鑒定；致病性

中圖分類號(hào)：S435.131.4+1 "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）01-0123-05

玉米黑粉菌（Ustilago maydis）屬黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌科（Ustilaginaceae），可以侵染玉米植株的所有地上組織，并迅速引起玉米植物組織膨大，造成玉米植株特異性生長(zhǎng)，并最終在玉米地上組織形成黑粉瘤［1-2］。U. maydis的整個(gè)生活史包含腐生生活的酵母型和寄生生活的菌絲型2種型態(tài)，由酵母型向菌絲型的轉(zhuǎn)化是U. maydis成功侵染寄主植物的關(guān)鍵［3-5］。U. maydis侵染玉米植物組織的典型癥狀是誘導(dǎo)植物地上部分各類組織膨大形成含有黑色冬孢子的植物腫瘤［6-7］。當(dāng)膨大的植物組織破裂后，黑色冬孢子也會(huì)隨之被釋放，隨風(fēng)和水流擴(kuò)散，在遇到合適條件后萌發(fā)，重新形成酵母型單倍體細(xì)胞［8］。

雖然黑粉菌的有性生殖需要寄主，但在人工培養(yǎng)基上也能獲得快速生長(zhǎng)。玉米黑粉菌的生命周期可分為單倍體孢子和雙核菌絲體2個(gè)階段［9-10］。單倍體孢子可在特定的培養(yǎng)基上芽殖，菌體形態(tài)類似酵母狀，但這種形式的單倍體孢子不具有致病力。只有當(dāng)2個(gè)不同交配型的單倍體孢子通過(guò)a雙等位基因座編碼的信息素-受體體系相互識(shí)別并發(fā)生單倍體細(xì)胞間的融合形成雙核菌絲體后，b多等位基因座的bE/bW（ bEast/bWest） 異源二聚體觸發(fā)包括多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因和38個(gè)潛在效應(yīng)基因在內(nèi)的調(diào)控級(jí)聯(lián)，從而調(diào)控雙核菌絲的維持、致病性及有性生殖的完成［11-13］。只有2個(gè)不同交配型的單倍體菌株交配結(jié)合形成雙核菌絲體，才能形成玉米黑粉病的典型癥狀，因此篩選不同交配型的單倍體菌株對(duì)玉米黑粉菌與玉米互作研究至關(guān)重要。

最早在1932年的Sleumer以及之后的Bowman（1946）、Rowell（1955）均認(rèn)為2個(gè)不同交配型的單倍體的交配反應(yīng)可以在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行，他們?cè)陲@微鏡下觀察到了親和的單倍體細(xì)胞的融合，然而，這個(gè)融合產(chǎn)物沒(méi)有進(jìn)一步的發(fā)展，未形成冬孢子［14-16］。也是在1932年，Bauch報(bào)道了顯微鏡下的交配跡象［17］。在麥芽培養(yǎng)基上，2個(gè)親和菌株的單菌落疊加在一起，便可以在菌落表面形成一層厚重的菌絲；非親和的2個(gè)單倍體菌株保持著酵母狀生長(zhǎng)，并保持著正常的人工培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)模式。同時(shí)Bauch把這一現(xiàn)象叫作平板交配［17］。在本研究中，將獲得的2個(gè)單倍體菌株混合后在固體培養(yǎng)基YPDA上培養(yǎng)，出現(xiàn)了平板交配的現(xiàn)象，且國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象的2個(gè)單倍體一定為不同型單倍體菌株。同時(shí)本研究對(duì)出現(xiàn)和未出現(xiàn)平板交配的2個(gè)單倍體菌株進(jìn)行玉米致病性分析，從而明確菌株的不同交配型，驗(yàn)證了通過(guò)平板交配現(xiàn)象篩選菌株的不同交配型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米黑粉菌菌瘤于2020年8月分別從吉林省雙陽(yáng)、公主嶺2個(gè)地點(diǎn)采集，所采集樣品由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 樣品處理

將田間采集的玉米黑粉菌菌瘤用70%無(wú)水乙醇進(jìn)行表面消毒2次，每次3 min。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌牙簽刺入菌瘤內(nèi)，挑取少量菌粉置于3 mL含有Amp抗生素的 YEPS液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。取接近試管底部的1.5 mL過(guò)夜培養(yǎng)液于2 mL離心管內(nèi)進(jìn)行菌體收集，倒掉上清，取沉淀進(jìn)行冬孢子萌發(fā)觀察。

1.3 單胞分離

根據(jù)上述冬孢子的萌發(fā)情況，采用稀釋純化法［18］分離純化單倍體菌株。準(zhǔn)備適量潔凈的硬瓊脂膠培養(yǎng)基（瓊脂占比為3%），倒在培養(yǎng)皿中，待凝固后在培養(yǎng)皿的背面用記號(hào)筆畫(huà)4～5 mm的小格；接著將菌體沉淀用1 mL無(wú)菌水回溶鏡檢觀察其孢子濃度，直至稀釋至1個(gè)視野內(nèi)擔(dān)孢子的個(gè)數(shù)在30個(gè)左右時(shí)，用無(wú)菌牙簽蘸取濃度適當(dāng)?shù)逆咦討腋∫?，移在瓊脂平板表面上所?huà)的小格范圍內(nèi)，稍向下壓，使培養(yǎng)基表面稍微下凹，但勿使表面破碎。而后，從培養(yǎng)皿的背面，用低倍鏡檢視小格內(nèi)孢子數(shù)目，如格內(nèi)只有1個(gè)孢子，就用無(wú)菌接種鏟將這一小塊培養(yǎng)皿取下，移植在YPDA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。待形成菌落后再進(jìn)行劃線取單菌落搖菌進(jìn)行菌種保存。分別從雙陽(yáng)、公主嶺2個(gè)地點(diǎn)的玉米黑粉菌菌瘤內(nèi)獲得10株單倍體菌株。

1.4 單倍體菌株的平板交配

將獲得的10株單倍體菌株進(jìn)行搖菌過(guò)夜培養(yǎng)，按照表1方式選取2個(gè)單倍體菌株培養(yǎng)液按1 ∶ 1的比例混合，并收集菌體，用無(wú)菌牙簽蘸取沉淀進(jìn)行劃線培養(yǎng)。于28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，劃線培養(yǎng)基為YPDA。待菌落長(zhǎng)出后，進(jìn)行顯微鏡觀察，約7 d后，菌落平板表面長(zhǎng)出透明菌絲或者白色菌絲，再次進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.5 不同菌株組合致病性分析

將獲得的10株單倍體菌株進(jìn)行搖菌過(guò)夜培養(yǎng)，菌液D 600 nm為2.0時(shí)，按照表1方式選取2個(gè)單倍體菌株再次按1 ∶ 1的比例混合，收集菌體，并用無(wú)菌水進(jìn)行回溶，D 600 nm為2.0，注射接種玉米植株幼苗，觀察發(fā)病情況并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微鏡觀察

經(jīng)無(wú)菌牙簽刺入菌瘤內(nèi)取菌粉過(guò)夜培養(yǎng)后，取沉淀進(jìn)行顯微鏡觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)此時(shí)冬孢子萌發(fā)形成擔(dān)子及擔(dān)孢子（圖1）。

2.2 單倍體菌株的平板交配

將經(jīng)單胞分離獲得的單倍體菌株兩兩混合進(jìn)行搖菌，收集菌體進(jìn)行劃線培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，進(jìn)行顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，有的擔(dān)孢子出現(xiàn)分隔并伸長(zhǎng)（圖2），而有的擔(dān)孢子則未出現(xiàn)分隔（圖3）；培養(yǎng) 7 d 后，可見(jiàn)平板內(nèi)菌落表面有的形成白色菌絲（圖4），有的未形成白色菌絲，此時(shí)鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，同時(shí)分隔的擔(dān)孢子形成芽管（圖5），芽管結(jié)合形成菌絲，出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象（圖6）。當(dāng)2個(gè)單倍體出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象時(shí)，說(shuō)明2個(gè)單倍體是親和的，屬于真正意義上的細(xì)胞融合，因此這種互作叫作平板交配［11］。鏡檢發(fā)現(xiàn)有的菌絲有分隔（圖7），有的菌絲沒(méi)有分隔（圖8），均未觀察到鎖狀聯(lián)合。

各菌株與其他菌株的45種組合中有9種組合觀察到平板交配現(xiàn)象（表2），1號(hào)菌株與5號(hào)菌株、8號(hào)菌株；3號(hào)菌株與7號(hào)菌株、10號(hào)菌株；4號(hào)菌株與5號(hào)菌株、8號(hào)菌株；5號(hào)菌株與1號(hào)菌株、4號(hào)菌株、10號(hào)菌株；6號(hào)菌與8號(hào)菌株、9號(hào)菌株；7號(hào)菌株與3號(hào)菌株；8號(hào)菌株與1號(hào)菌株、4號(hào)菌株、6號(hào)菌株；9號(hào)菌株與6號(hào)菌株；10號(hào)菌株與3號(hào)菌株、5號(hào)菌株。而2號(hào)菌株和其他菌株未出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象。

從菌株交配型關(guān)系可以推斷，3號(hào)菌株、5號(hào)菌株、8號(hào)菌株及9號(hào)菌株為相同交配型菌株；1號(hào)菌株、4號(hào)菌株、6號(hào)菌株、7號(hào)菌株及10號(hào)菌株為相同交配型菌株。

2.3 不同菌株組合致病性分析

將不同組合的菌株注射接種玉米植株幼苗，分析各菌株組合致病性（圖9）。通常接種后 3 d 出現(xiàn)褪綠病斑，6 d出現(xiàn)腫瘤。各菌株與其他菌株的45種組合中有26種組合可以引起玉米葉片腫瘤（表3）。筆者發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)平板交配的組合菌株，在玉米植株內(nèi)一定會(huì)發(fā)生交配，并在玉米葉片上形成腫瘤，即這2個(gè)單倍體菌株為不同型的單倍體菌株；但未出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象的組合菌株，在玉米植株內(nèi)可能出現(xiàn)交配現(xiàn)象，在玉米葉片上形成腫瘤（表3）。由表3可知，2號(hào)菌株、3號(hào)菌株、5號(hào)菌株、8號(hào)菌株及9號(hào)菌株為相同交配型菌株，1號(hào)菌株、4號(hào)菌株、6號(hào)菌株、7號(hào)菌株及10號(hào)菌株為相同交配型菌株，與平板交配結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

本研究取玉米黑粉菌的菌包內(nèi)菌粉培養(yǎng)，并進(jìn)行單胞分離獲得單倍體菌株，兩兩組合培養(yǎng)，出現(xiàn)平板交配的現(xiàn)象，該結(jié)果與Sleumer等的研究結(jié)果［14-16］一致。同時(shí)，平板交配現(xiàn)象的出現(xiàn)也說(shuō)明玉蜀黍黑粉菌的交配能夠發(fā)生于體外。冬孢子萌發(fā)形成擔(dān)孢子，2個(gè)相互兼容的擔(dān)孢子相遇后停止芽殖，細(xì)胞形成相向的結(jié)合管；單倍體細(xì)胞融合后，U. maydis的細(xì)胞周期受到阻滯，形成具有侵染能力的雙核的菌絲型；不斷延伸的雙核菌絲遇到植物表面合適位置后在末端膨大形成附著胞，幫助雙核菌絲穿透植物表皮；穿透植物表皮后雙核菌絲進(jìn)一步在植物細(xì)胞間延伸并大量增殖，引起植物組織膨大。侵染晚期，植物營(yíng)養(yǎng)逐漸被消耗，膨大組織內(nèi)的部分雙核菌絲開(kāi)始出現(xiàn)核融合現(xiàn)象，形成雙倍體菌絲。雙倍體菌絲斷裂、聚合后分化形成冬孢子，冬孢子在植物組織破裂后被釋放。冬孢子遇到合適條件后又開(kāi)始萌發(fā)，首先經(jīng)減數(shù)分裂形成先菌絲，然后先菌絲經(jīng)有絲分裂形成酵母型單倍體擔(dān)孢子［19］。

本研究平板交配現(xiàn)象是在菌落長(zhǎng)出后約7 d，平板內(nèi)菌落表面長(zhǎng)出透明菌絲或者白色菌絲時(shí)觀察到的平板交配。張修軍等研究表明，擔(dān)抱子向菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化的決定因素是水分，即在環(huán)境變干、水分逐漸喪失的過(guò)程中轉(zhuǎn)變?yōu)榫z形態(tài)［20］。本研究結(jié)果與之相一致，培養(yǎng)7 d的平板內(nèi)培養(yǎng)基水分逐漸消失，平板內(nèi)環(huán)境變干，擔(dān)孢子完成了向菌絲形態(tài)的轉(zhuǎn)化，故此平板內(nèi)菌落表面長(zhǎng)出透明菌絲或者白色菌絲。由于平板交配現(xiàn)象的出現(xiàn)說(shuō)明玉蜀黍黑粉菌的交配能夠發(fā)生于體外，因此本研究推測(cè)玉米黑粉菌侵入玉米植株存在2種侵染方式，一種為冬孢子萌發(fā)形成擔(dān)孢子，當(dāng)2個(gè)相互兼容的擔(dān)孢子相遇后停止芽殖，細(xì)胞形成相向的結(jié)合管，單倍體細(xì)胞融合后形成具有侵染能力的雙核菌絲，雙核菌絲侵入玉米植株；另外一種為冬孢子萌發(fā)形成擔(dān)孢子，擔(dān)孢子萌發(fā)形成單核菌絲，單核菌絲侵入玉米植株，玉米植株內(nèi)的單核菌絲交配形成雙核菌絲，雙核菌絲進(jìn)一步在植物細(xì)胞間延伸并大量增殖，引起植物組織膨大，形成腫瘤。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，平板交配獲得的同型單倍體菌株與玉米植株侵染試驗(yàn)獲得的同型交配菌株結(jié)果基本一致。出現(xiàn)平板交配的2個(gè)單倍體菌株，在玉米植株內(nèi)一定發(fā)生交配現(xiàn)象，并在葉片形成腫瘤，2個(gè)單倍體菌株為不同型單倍體菌株；而未出現(xiàn)平板交配的2個(gè)單倍體菌株，部分組合菌株會(huì)在玉米植株內(nèi)發(fā)生交配現(xiàn)象，在葉片上形成腫瘤。也就是說(shuō)能夠進(jìn)行平板交配的一對(duì)菌株一定能夠在玉米植株上形成腫瘤。該現(xiàn)象與Puhalla的研究結(jié)果［21］相一致，盡管不能確定平板交配與在玉米植株內(nèi)的真實(shí)交配的關(guān)系，但平板交配可以作為一種遺傳工具，便于統(tǒng)計(jì)交配類型，并且節(jié)省時(shí)間和人力，同時(shí)，平板交配也可以用于研究不相容位點(diǎn)的基因研究中。Puhalla在研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基內(nèi)加入0.5%的酪蛋白水解物或者均等氨基酸混合物會(huì)增加平板交配出現(xiàn)的頻率［21］。但在本研究中未加入該氨基酸，培養(yǎng)基為普通的固體培養(yǎng)基YPDA。因此若想快速獲得玉米黑粉菌不同型單倍體菌株可以在固體培養(yǎng)基內(nèi)加入0.5%的酪蛋白水解物，增加平板交配現(xiàn)象的頻率，進(jìn)而獲得不同交配型的單倍體菌株。

綜上所述，本研究可得出如下結(jié)論：取玉米黑粉菌的菌包內(nèi)菌粉培養(yǎng)，并進(jìn)行單胞分離獲得單倍體菌株，兩兩組合培養(yǎng)，采用普通的固體培養(yǎng)基YPDA培養(yǎng)，出現(xiàn)平板交配的現(xiàn)象。出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象的2個(gè)單倍體一定為不同型單倍體菌株。玉米植株接種試驗(yàn)表明，出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象的菌株可以引起玉米葉片腫瘤，而部分未出現(xiàn)平板交配現(xiàn)象的單倍體菌株組合也可使玉米葉片形成腫瘤，說(shuō)明這2個(gè)單倍體菌株為不同型單倍體菌株。平板交配現(xiàn)象可以明確2個(gè)不同單倍體菌株為不同型單倍體菌株，但對(duì)于不存在平板交配型的菌株只能通過(guò)接種玉米植株才能夠確定他們是否為不同型單倍體菌株。本研究表明，通過(guò)玉米黑粉菌單倍體菌株平板交配現(xiàn)象可以進(jìn)行菌株的不同交配型鑒定。

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收 稿日期：2023-02-20

基金項(xiàng)目：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（編號(hào)：KYJF2021ZR105）；吉林省科技廳中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金（編號(hào)：202002064JC）。

作者簡(jiǎn)介：鄒曉威（1983—），女，吉林松原人，碩士，副研究員，從事玉米真菌病害研究，E-mail：zouxiaowei2008@126.com；共同第一作者：夏 蕾（1982—），女，吉林松原人，博士，副研究員，從事微生物研究，E-mail：fushun1020@yeah.net。

通信作者：鄭 巖，博士，研究員，從事玉米真菌病害研究，E-mail：jlzhengyan@163.com。