摘" " 要：為了明確西瓜雄性不育材料的不育類型和花藥敗育時期，以西瓜雄性不育系GMS4為材料，對花蕾不育性狀進(jìn)行田間觀察統(tǒng)計，利用石蠟切片法觀察西瓜花藥發(fā)育過程。結(jié)果表明，該材料不育性狀由1對隱性基因控制，為細(xì)胞核雄性不育類型?？捎晷廴锇l(fā)育正常，不育株雄蕊較小，花藥干癟無花粉，可育株和不育株雌蕊發(fā)育無明顯差異，均可正常結(jié)瓜。從花藥發(fā)育的整個過程來看，在花藥發(fā)育早期，可育株和不育株花藥結(jié)構(gòu)形態(tài)差別不大，在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期，不育株異常絨氈層細(xì)胞過度增殖，體積小，排列不整齊，擠壓藥室，無二分體和四分體形成，在花藥發(fā)育后期，無花粉粒形成，最終導(dǎo)致西瓜雄性不育發(fā)生。據(jù)此認(rèn)為，花藥敗育發(fā)生時期在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 細(xì)胞核雄性不育； 減數(shù)分裂； 絨氈層

中圖分類號：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）02-015-06

Genetic identification and embryological observation of male sterile watermelon

GAO Ningning， LI Xiaohui， KANG Liyun， WANG Yan， CHANG Gaozheng， LIANG Shen， LI Hailun， WANG Huiying， ZHAO Weixing

（Horticulture Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to determine the sterility type and anther sterilization period of male sterile watermelon， the male sterile line GMS4 was used as the material to observe the sterility characters of flower buds in the field， and the development process of watermelon anther was observed by the paraffin section method. The results showed that the sterile material was controlled by a pair of recessive genes， which was the type of nuclear male sterility. The stamen of fertile plant was normal while that of sterile plant was small， with shripped auther and no pollen. There was no difference in pistil development between fertile strain and sterile plant， and both of them could bear fruit normally. In the early anther development， there was little difference in anther structure and morphology between fertile and sterile plants. In the meiotic phase of microspore mother cells， the abnormal tapetum cells proliferate excessively， were small in size， irregular in arrangement， squeezed drug chamber， and no dyad and tetrad were formed. No pollen grains were formed at the late anther development stage， which resulted in male sterility. It concluded that anther abortion occurred during the meiosis stage of microspore mother cells.

Key words： Watermelon; Nuclear male sterility; Meiosis; Tapetal layer

雜種優(yōu)勢在提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等方面發(fā)揮著重要作用，是目前生產(chǎn)實踐中重要的作物改良途徑，培育作物雜交新品種已成為國內(nèi)外種業(yè)發(fā)展的主要方向[1]。西瓜屬于異花授粉植物，雜種優(yōu)勢強(qiáng)，但在制種時需要人工授粉、套袋處理，制種成本高、工作量大且純度難以保證[2-3]。雄性不育一直是育種研究的熱點(diǎn)，在小麥[4]、玉米[5]、水稻[6]、辣椒[7]、黃瓜[8]等作物上已有大量研究，但有關(guān)西瓜雄性不育的研究較少[9-10]。在大豆[11]、辣椒[12]、甘藍(lán)[13]等作物上對花藥敗育的細(xì)胞學(xué)鑒定研究已有相關(guān)報道，而關(guān)于西瓜雄性不育系花藥細(xì)胞學(xué)觀察和敗育時期的研究鮮有報道。雄性不育遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，分為兩種類型，一是核基因控制的細(xì)胞核雄性不育，其遺傳規(guī)律符合孟德爾遺傳定律；二是核基因與線粒體基因共同控制的核質(zhì)互作雄性不育，表現(xiàn)為母系遺傳[14]。根據(jù)雄性不育的表型和細(xì)胞學(xué)形態(tài)，花藥敗育的表現(xiàn)有以下幾種：雄蕊畸形或退化；孢子囊退化，花藥表型正常但沒有花粉；小孢子退化，產(chǎn)生畸形敗育的花粉；花粉功能缺陷，花粉表型正常但無萌發(fā)能力；花藥不開裂，花粉有活力但開裂異常[15-16]。

GMS4西瓜材料在田間選育過程中發(fā)現(xiàn)部分植株雄花開放后花藥無花粉。利用雄性不育材料進(jìn)行育種能夠提高制種效率，但小孢子敗育原因較為復(fù)雜，且敗育時期從造孢細(xì)胞以后的每個發(fā)育階段都有可能發(fā)生[17]，明確敗育發(fā)生的原因及時期對雄性不育系在雜種優(yōu)勢利用和生產(chǎn)實踐中具有重要意義。因此，筆者以雄性不育系GMS4為材料，鑒定其雄性不育性狀、采用細(xì)胞學(xué)方法觀察花藥發(fā)育時期，明確其敗育時期，初步解析敗育原因，以期為深入研究雄性不育分子調(diào)控機(jī)制和不育性狀育種應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為西瓜雄性不育系GMS4，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西甜瓜課題組提供。2020年3月至2022年7月在河南省農(nóng)科院原陽基地進(jìn)行試驗，采用基質(zhì)穴盤育苗，定植行株距為1.1 m×0.4 m。

1.2 方法

1.2.1 取樣 在盛花期調(diào)查西瓜植株育性，通過田間觀察、鏡檢等，統(tǒng)計雄性可育株和不育株，并分別進(jìn)行標(biāo)記。采集雄性可育和不育植株雄花花蕾，按照不同發(fā)育時期花蕾長度進(jìn)行取樣，參考前人研究[18]，分別為造孢細(xì)胞期＜0.5 mm、花粉母細(xì)胞期0.5～1.5 mm、減數(shù)分裂期2～3 mm、單-雙核小孢子期4～5 mm和當(dāng)天開放的雄花，雄花花蕾的長度為花托底部至花蕾頂部，每個時期取3個花蕾，3次重復(fù)。利用Nikon Eclipse E100顯微鏡進(jìn)行鏡檢和圖像采集分析。

1.2.2 石蠟制片 將花蕾放入盛有FAA溶液的離心管中進(jìn)行花藥固定，石蠟切片制作參考高俊鳳[19]的方法。植物組織切片浸入染液2～5 min后水洗，鏡檢，觀察著色情況，用自來水沖洗后，將切片置于烤箱內(nèi)烘干；透明封片：切片放入干凈的二甲苯透明10 min，采用中性樹膠封片。將切片置于顯微鏡下，觀察花藥發(fā)育過程。

1.2.3 遺傳學(xué)鑒定 對雄性不育材料F2代523個植株和測交群體460個植株進(jìn)行田間觀察，分別統(tǒng)計可育株和不育株，并計算可育株和不育株的分離比。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄性不育材料性狀鑒定

通過田間觀察鑒定，該材料雄性不育性狀穩(wěn)定，F(xiàn)2代（396∶127）和測交群體（239∶221）中（圖1），雄性可育和不育的分離比穩(wěn)定在3∶1和1∶1，遺傳規(guī)律符合孟德爾遺傳定律，不育性狀由1對隱性基因控制，為細(xì)胞核雄性不育類型。

2.2 雄性不育和可育材料花器官特征

通過田間鑒定，GMS4不育系的不育性狀穩(wěn)定，不同發(fā)育時期雄性可育株與不育株的雄花形態(tài)差異較大，雄性可育株的花瓣顏色為深黃色，而不育株的花瓣顏色為淺黃色（圖2-A～B），可育株的雄花花藥較飽滿（圖2-D），開花以后有黃色花粉散出（圖2-E、G），顯微鏡下可觀察到有活性的花粉粒（圖2-I），雄性不育株的雄花花蕾在減數(shù)分裂期以后，花藥發(fā)育緩慢，花藥明顯小于可育株（圖2-D），開花以后沒有花粉散出（圖2-F、H），顯微鏡下觀察不到花粉粒的存在。雄性不育株雌花發(fā)育與可育株無明顯差異，授粉后可以正常結(jié)瓜（圖2-C）。

2.3 雄性不育和可育材料花藥發(fā)育特征

通過切片觀察，發(fā)現(xiàn)在造孢細(xì)胞時期，雄性可育株和不育株的花藥細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)差異不明顯（圖3-A～B）；花粉母細(xì)胞時期，花藥細(xì)胞開始分化形成不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)，雄性可育株花藥壁分化為由外到內(nèi)的表皮層、藥室內(nèi)壁層、中層和絨氈層，絨氈層在藥室最內(nèi)層，呈長方形，排列整齊，為花粉母細(xì)胞提供營養(yǎng)。小孢子母細(xì)胞呈圓形，較大且排列松散（圖3-C）。與可育株相比，雄性不育株花藥的藥室壁和絨氈層的界限模糊不清，絨氈層細(xì)胞多層、不規(guī)則且細(xì)胞體積小，花粉囊受擠壓，花粉囊較小，小孢子母細(xì)胞較小且排列緊密（圖3-D）；減數(shù)分裂期，能明顯觀察到雄性可育株的二分體和四分體，絨氈層細(xì)胞排列整齊（圖4-A），而雄性不育株花藥絨氈層細(xì)胞過度增殖，排列不整齊，擠壓藥室，無二分體和四分體形成，異常小孢子母細(xì)胞在藥室中聚集成團(tuán)（圖4-B）；單-雙核小孢子時期，雄性可育株花藥絨氈層細(xì)胞增大，形成空泡，小孢子產(chǎn)生（圖4-C），雄性不育株花藥絨氈層增殖膨大，花粉囊受擠壓變得狹小，不能形成正常的小孢子，僅形成了空泡的異常小孢子，著色較淺（圖4-D）；花粉粒成熟期，可育株花粉粒圓形且著色深，絨氈層細(xì)胞降解，花藥開裂，成熟花粉粒散出（圖5-A），而不育株花藥觀察不到成熟花粉粒，整個藥室呈干癟狀，粘連在一起，形成著色深的條帶（圖5-B）。從切片觀察發(fā)現(xiàn)，西瓜雄性可育株花藥在各個時期的發(fā)育均正常。而不育株花藥除前期造孢細(xì)胞時期發(fā)育正常，后期發(fā)育均存在異常。

3 討論與結(jié)論

花藥是雄蕊的重要組成部分，花粉在花藥中發(fā)育產(chǎn)生成熟花粉粒，之后進(jìn)行傳播授粉?；ǚ郯l(fā)育是一個復(fù)雜的過程，任何階段發(fā)生異常均會引起雄性不育，敗育形成的時期和原因多種多樣，且依作物不同而異[20-21]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，西瓜細(xì)胞核雄性不育系GMS4在不同的環(huán)境條件下性狀穩(wěn)定，其遺傳規(guī)律符合孟德爾遺傳定律，由一對隱性基因控制細(xì)胞核雄性不育。這與張顯等[22]對西瓜雄性不育材料Se18的遺傳特性研究結(jié)果相同。前人研究發(fā)現(xiàn)，雄花花蕾及花藥的色澤、縱橫徑等外觀特征與小孢子發(fā)育時期關(guān)系密切[23]。筆者的研究對GMS4可育和不育花蕾的表型特征進(jìn)行了觀察比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雄性可育的花瓣顏色比不育的深，雄性不育株的花蕾縱徑長至2～3 mm以后，花藥大小明顯小于可育株，開花以后，不育株雄花花藥干癟，無花粉產(chǎn)生。這與馬建祥等[24]利用電鏡掃描觀察的西瓜雄性不育兩用系結(jié)果一致。花蕾大小與花藥發(fā)育時期之間的關(guān)系不僅受基因型的影響，同時受環(huán)境的影響也較大，因此，在深入研究之前需明確供試材料的花藥敗育時期。

Laser等[20]對被子植物花藥發(fā)育過程的研究發(fā)現(xiàn)，雙子葉植物花藥敗育時期多在四分體形成前，而單子葉植物的花藥敗育關(guān)鍵時期則主要是雙核期。植物花藥敗育在花粉母細(xì)胞時期、減數(shù)分裂期、單-雙核期等均有發(fā)生[12]，葉紈芝等[25]對白菜細(xì)胞核雄性不育系進(jìn)行了花藥細(xì)胞學(xué)觀察，結(jié)果表明，不育系敗育在減數(shù)分裂期，無法形成四分體。盛云燕等[26]利用電鏡觀察了甜瓜核雄性不育材料的花蕾發(fā)育結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)花藥敗育發(fā)生在四分體期至單核期。張建奎等[27]研究發(fā)現(xiàn)，小麥核雄性不育敗育發(fā)生在小孢子單核期，敗育類型為圓敗型。而在筆者的研究中，西瓜雄性不育系GMS4的花藥敗育發(fā)生在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期，不育株的花藥不能形成二分體、四分體，這可能與所研究的作物種類不同有關(guān)。

諸多報道表明，小孢子敗育與絨氈層的異常發(fā)育有關(guān)。絨氈層細(xì)胞位于花藥壁內(nèi)側(cè)與小孢子母細(xì)胞接觸，花藥發(fā)育初期為小孢子提供所需的營養(yǎng)元素，四分體時期分泌特異性胼胝質(zhì)酶，將包裹小孢子的胼胝體壁降解，花藥發(fā)育后期提供孢粉素和脂類等[28]。研究表明，絨氈層發(fā)生任何異常如絨氈層細(xì)胞液泡化、提前退化或降解等都可能引起雄性不育。唐鑫等[13]對油菜溫敏細(xì)胞核雄性不育系160S花藥進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)不育花藥絨氈層形態(tài)異常，細(xì)胞空泡化并提前解體。雷剛等[12]研究辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系B351A小孢子敗育細(xì)胞學(xué)機(jī)制，表明敗育花藥絨氈層細(xì)胞高度液泡化，擠壓藥室產(chǎn)生畸形的花粉母細(xì)胞導(dǎo)致敗育。與雷剛等[12]、唐鑫等[13]的細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果不同，這可能與研究的不育類型不同有關(guān)。許明等[29]對大白菜核雄性不育兩用系的研究發(fā)現(xiàn)，不育株花藥進(jìn)入減數(shù)分裂期后，四分體形成異常，在藥室中央聚成團(tuán)，絨氈層細(xì)胞異常呈液泡化，膨大后擠壓藥室，小孢子得不到充足營養(yǎng)而無法形成花粉粒。王永琦等[30]對西瓜細(xì)胞核雄性不育兩用系Se18的研究同樣表明，異常絨氈層細(xì)胞過度增殖，無法分泌胼胝質(zhì)酶，被胼胝質(zhì)包裹的小孢子只進(jìn)行了細(xì)胞核分裂，細(xì)胞質(zhì)未分裂，四分體無法形成，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂異常導(dǎo)致雄性不育發(fā)生。許明等[29]和王永琦等[30]的報道與本研究結(jié)果一致。在筆者的研究中，不育花藥絨氈層細(xì)胞在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期發(fā)生異常，絨氈層細(xì)胞數(shù)量多、體積小且層數(shù)多，花粉囊受擠壓，無法形成二分體和四分體，異常的絨氈層細(xì)胞無法給小孢子正常發(fā)育提供營養(yǎng)而導(dǎo)致敗育。

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