摘" " 要：番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）是瓜類(lèi)作物主要病毒之一，分析了甜瓜分離物HaNHK10的基因組序列和分子變異，構(gòu)建了具有侵染性的全長(zhǎng)cDNA克隆。結(jié)果顯示，HaNHK10分離物基因組全長(zhǎng)為10 332 nt，與其他分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為74.60%～97.80%和85.30%～98.50%?；谌蚪M序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，HaNHK10與來(lái)自中國(guó)的所有分離物均聚集于II組中，并與中國(guó)山東的西葫蘆分離物PRSV-SD親緣關(guān)系最近。接種試驗(yàn)顯示，HaNHK10分離物的全長(zhǎng)cDNA克隆具有侵染性，它能系統(tǒng)侵染甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜6種作物，經(jīng)接種產(chǎn)生的病毒后代也能夠通過(guò)摩擦接種侵染植株。

關(guān)鍵詞：番木瓜環(huán)斑病毒；甜瓜分離物；基因組；侵染性克隆

中圖分類(lèi)號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2024）02-008-07

The genome and infectious clone of papaya ringspot virus melon isolate

LIU Liming1， PENG Bin1， KANG Baoshan1，2， WU Huijie1， LIU Xi1， GU Qinsheng1

（1. Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology/Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453500， Henan， China）

Abstract： Papaya ringspot virus （PRSV） is one of the most important viruses in cucurbits crops. In this study， the genome sequence of melon isolate HaNHK10 was cloned and analyzed， and its full-length cDNA infectious clone was constructed. The results showed that the genome of isolate HaNHK10 was 10 332 nt in length， and the identities of the genome nucleotide sequence and amino acid sequence between HaNHK10 and other isolates were 74.60%-97.80% and 85.30%-98.50%， respectively. Phylogenetic analysis based on genome sequences showed that HaNHK10 and all the isolates from China were clustered in group Ⅱ， and zucchini isolate PRSV-SD from Shandong province was most closely related to HaNHK10. The inoculation showed that the infectious clone was successfully constructed， and it could systematically infect melon， cucumber， watermelon， pumpkin， zucchini and bottle gourd. The progeny produced from the clone was infectious by mechanical inoculation.

Key words： Papaya ringspot virus; Melon isolate; Genome; Infectious clone

番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）是一種單鏈正義RNA病毒，屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），病毒粒子呈彎曲線(xiàn)狀，長(zhǎng)度為700～900 nm，直徑約為12.5 nm，在自然條件下，主要通過(guò)蚜蟲(chóng)以非持久性方式進(jìn)行傳播，也可通過(guò)農(nóng)事操作進(jìn)行傳播。根據(jù)寄主范圍不同，PRSV可分為番木瓜（papaya，P）株系和西瓜（watermelon，W）株系，其中，P株系侵染番木瓜和葫蘆科作物，W株系侵染葫蘆科作物，不能侵染番木瓜。PRSV侵染番木瓜后引起葉片花葉、畸形，莖稈和果實(shí)表面出現(xiàn)環(huán)斑，嚴(yán)重時(shí)葉片脫落、植株死亡；感染葫蘆科作物后會(huì)引起葉片花葉、卷曲和畸形，植株矮化，果實(shí)畸形，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和果實(shí)的商品性。PRSV自20世紀(jì)40年代末在美國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，目前在法國(guó)、巴西、哥倫比亞、厄瓜多爾、墨西哥、中國(guó)、澳大利亞、東帝汶、韓國(guó)、泰國(guó)、越南和印度等國(guó)均有發(fā)生[1-9]。在我國(guó)，自1964年P(guān)RSV在華南地區(qū)開(kāi)始流行成災(zāi)后[10]，目前已在海南、臺(tái)灣、廣東、廣西、福建、山東、河南、云南、四川等地發(fā)生[11-16]，給番木瓜和葫蘆科作物的生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。

目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了許多不同地理來(lái)源的PRSV分離物，并獲得了許多分離物的全基因組序列信息[1，5，7，9，17-21]，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)PRSV不同分離株與其地理來(lái)源有顯著的相關(guān)性[13，15，20-22]，但與其株系劃分并不顯著相關(guān)。通過(guò)分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的PRSV全基因組序列信息，發(fā)現(xiàn)澳大利亞、巴西和東帝汶等國(guó)報(bào)道的均為W株系，分離物數(shù)量分別為13、3、4個(gè)，墨西哥和孟加拉國(guó)報(bào)道的均有2個(gè)分離物，且均為P株系，而我國(guó)報(bào)道的21個(gè)分離物中僅有4個(gè)為W株系，若要進(jìn)一步分析不同株系間的進(jìn)化關(guān)系，仍需更多的全基因組序列數(shù)據(jù)支撐[21]。對(duì)于我國(guó)報(bào)道的4個(gè)W株系，從寄主來(lái)源上來(lái)看，它們分別分離自南瓜、西葫蘆和絲瓜，目前尚無(wú)甜瓜分離物及其全基因組序列信息。為了深入研究病毒與寄主之間的相互關(guān)系，獲得病毒侵染性克隆至關(guān)重要。在PRSV侵染性克隆構(gòu)建方面，目前已有成功構(gòu)建PRSV-P株系HN-1、HN-2和YK分離物以及PRSV-W株系SD和CI分離物的侵染性克隆的報(bào)道[23-27]。從寄主來(lái)源看，PRSV-P株系均分離自番木瓜，PRSV-W株系SD分離物分離自西葫蘆，W-CI分離自絲瓜，目前尚無(wú)PRSV-W甜瓜分離物侵染性克隆構(gòu)建的相關(guān)報(bào)道。

筆者在2017年的葫蘆科作物病毒病調(diào)查時(shí)從海南省海口市采集到一株P(guān)RSV-W甜瓜分離物，將其命名為HaNHK10[28]。以此為基礎(chǔ)，筆者通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得該分離物的全基因組序列，并對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，同時(shí)利用同源重組策略構(gòu)建該分離物的全長(zhǎng)cDNA克隆，通過(guò)接種試驗(yàn)分析其在不同瓜類(lèi)作物上的侵染性，為在瓜類(lèi)作物上開(kāi)展該病毒的進(jìn)化機(jī)制和分子致病性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2021年4—9月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所進(jìn)行，PRSV-W分離物HaNHK10采集于海南省海口市露地甜瓜發(fā)病植株。植物表達(dá)載體pXT1由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陶小榮教授饋贈(zèng)。

1.2 載體構(gòu)建

取約0.1 g甜瓜發(fā)病葉片進(jìn)行總RNA的提取和cDNA的合成，具體操作參照RNAsimple總RNA提取試劑盒和PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書(shū)。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PRSV的全基因組序列，通過(guò)比對(duì)分析序列的保守性，設(shè)計(jì)3對(duì)引物P-1F/P-1R、P-2F/P-2R、P-3F/ P-3R（表1），以合成的cDNA為模板，將分離物HaNHK10的全基因組分成3段進(jìn)行擴(kuò)增，利用NEBuilder高保真DNA組裝預(yù)混液將獲得的3個(gè)PCR產(chǎn)物與經(jīng)Stu I和Sma I雙酶切處理的植物表達(dá)載體pXT1進(jìn)行同源重組、轉(zhuǎn)化、篩選和測(cè)序驗(yàn)證，獲得含有HaNHK10全基因組的cDNA克隆pPRSV-HaNHK10。

1.3 序列分析

對(duì)pPRSV-HaNHK10進(jìn)行測(cè)序分析和拼接，獲得HaNHK10分離物的全基因組序列。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載76條來(lái)自不同國(guó)家的PRSV分離物的全基因組序列，利用ClustalW軟件將它們與HaNHK10分離物進(jìn)行序列比對(duì)，用BioEdit軟件進(jìn)行全基因組核苷酸和氨基酸序列一致性分析[29]。以西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV，AY437609）為外組，基于PRSV不同分離物的全基因組核苷酸序列，利用Mega X軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析[30]，重復(fù)1000次。

1.4 接種試驗(yàn)和病毒檢測(cè)

接種試驗(yàn)于2021年6—8月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所西瓜甜瓜病蟲(chóng)害防控課題組溫室進(jìn)行。其中，甜瓜品種為白玫，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供；黃瓜品種為津研4號(hào)，購(gòu)自天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司；西瓜品種為紅和平，購(gòu)自浙江浙農(nóng)種業(yè)有限公司；南瓜品種為早栗蜜本，購(gòu)自河北茂華種業(yè)有限公司；西葫蘆品種為歐諾，購(gòu)自太谷縣雨潤(rùn)谷禾種業(yè)有限公司；瓠瓜品種為甬砧1號(hào)，由寧波農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；當(dāng)植株培養(yǎng)至子葉完全展開(kāi)時(shí)開(kāi)始試驗(yàn)。將pPRSV-HaNHK10轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式接種甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜植株，以接種誘導(dǎo)緩沖液為陰性對(duì)照（CK），具體方法參照劉莉銘等[31]的報(bào)道。待甜瓜發(fā)病后，采集發(fā)病葉片用1×PBS緩沖液按照葉片與緩沖液1∶10的質(zhì)量/體積比進(jìn)行研磨，通過(guò)摩擦方式接種甜瓜和西瓜健康植株。將接種后的植株置于25～28 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀(guān)察植株發(fā)病情況。在每次試驗(yàn)中每種作物分別接種6株，并設(shè)置3次重復(fù)。待發(fā)病后，采集接種植株的系統(tǒng)發(fā)病葉片，提取葉片總RNA，利用HiScript? II One Step RT-PCR Kit （Dye Plus）以P-5480F/ P-6980R為引物（目的片段長(zhǎng)度約為1500 bp）對(duì)病毒的侵染情況進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以P-9673F/P-T7-10045R為引物，對(duì)HaNHK10基因組9 673～10 045 nt區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記的RNA探針，以利用dot blot方法進(jìn)一步檢測(cè)植株葉片中PRSV的侵染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRSV分離物HaNHK10基因組結(jié)構(gòu)分析

PRSV分離物HaNHK10基因組全長(zhǎng)為10 332 nt，GenBank登錄號(hào)為OK465456，包含5′UTR（1～85 nt）和3′UTR（10 127～10 332 nt），編碼1個(gè)由3346個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白（86～10 126 nt），經(jīng)蛋白酶切割形成11個(gè)成熟的蛋白質(zhì)，包括P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、CP以及P3編碼區(qū)內(nèi)部通過(guò)+2移碼產(chǎn)生的PIPO，具體的基因組結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2 PRSV分離物HaNHK10序列分析

序列一致性分析結(jié)果顯示，分離物HaNHK10與其他PRSV分離物之間的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為74.60%～97.80%、85.30%～98.50%。在這些分離物中，HaNHK10與中國(guó)山東的西葫蘆分離物PRSV-SD（MF085000）一致性最高，核苷酸和氨基酸序列一致性分別達(dá)到97.80%、98.50%，與孟加拉國(guó)的番木瓜分離物（MH444652）一致性最低，核苷酸和氨基酸序列一致性分別僅為74.60%、85.30%。

基于PRSV全基因組核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示（圖2），供試的77個(gè)PRSV分離物可以分為2組，其中，來(lái)自巴西、哥倫比亞、厄瓜多爾、法國(guó)和墨西哥的所有分離物均聚集于Ⅰ組，來(lái)自中國(guó)、東帝汶、韓國(guó)、泰國(guó)和越南的所有分離物均聚集于Ⅱ組，來(lái)自澳大利亞的13個(gè)分離物中有12個(gè)聚集于Ⅰ組，來(lái)自印度的13個(gè)分離物中有12個(gè)聚集于Ⅰ組，說(shuō)明PRSV分離物與其地理來(lái)源有顯著的相關(guān)性。另外，在Ⅰ組和Ⅱ組中，分離自番木瓜的分離物分別聚集在一起，分離自葫蘆科作物的分離物分別聚集在一起，說(shuō)明PRSV分離物與其寄主來(lái)源也有顯著的相關(guān)性。其中，筆者獲得的分離物HaNHK10與來(lái)自中國(guó)山東的西葫蘆分離物PRSV-SD（MF085000）親緣關(guān)系最近，它們均聚于Ⅱ組中。

2.3 分離物HaNHK10全長(zhǎng)cDNA克隆的侵染性

將HaNHK10分離物的cDNA克隆pPRSV-HaNHK10采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法分別接種甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜植株。在接種后7 d左右，甜瓜葉片葉脈開(kāi)始褪綠、產(chǎn)生脈帶，10 d左右所有接種植株葉脈褪綠均較為明顯，此時(shí)黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜接種植株開(kāi)始產(chǎn)生皺縮或花葉癥狀，14 d時(shí)所有接種植株均出現(xiàn)明顯癥狀（圖3-A）。RT-PCR和dot blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了發(fā)病植株均被PRSV所侵染（圖3-B～C）。通過(guò)摩擦接種方式將甜瓜發(fā)病葉片進(jìn)一步接種甜瓜和西瓜植株，發(fā)現(xiàn)在接種后1～2周內(nèi)所有接種植株均可發(fā)病，經(jīng)PCR進(jìn)一步證實(shí)了PRSV的侵染。以上結(jié)果說(shuō)明，PRSV分離物HaNHK10的侵染性克隆構(gòu)建成功，該克隆在6種供試瓜類(lèi)作物上均可系統(tǒng)侵染，并產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀。

3 討論與結(jié)論

目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布76個(gè)PRSV分離物的全基因組序列信息，筆者以從海南?？诓杉降腜RSV甜瓜分離物HaNHK10為研究對(duì)象，對(duì)其全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增和拼接，隨后基于全基因組核苷酸序列對(duì)以上77個(gè)PRSV分離物進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示同一國(guó)家的分離物大多聚集在一起，說(shuō)明PRSV不同分離物與其地理來(lái)源有顯著的相關(guān)性，這與已有報(bào)道[13，15，20-22]結(jié)果一致。另外，PRSV分離物在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中可分為2組，雖然P和W株系所對(duì)應(yīng)的分離物分別分布在這2組中，但在各分組內(nèi)2種株系之間有所分化，且同一地理來(lái)源的相同株系所對(duì)應(yīng)的分離物分別聚集在一起，親緣關(guān)系更近，說(shuō)明在同一地理區(qū)域內(nèi)PRSV分離物與其株系分化有一定的相關(guān)性。由于PRSV-W株系中來(lái)自不同葫蘆科作物的分離物較少，無(wú)法進(jìn)一步判斷PRSV-W分化與其寄主來(lái)源之間的關(guān)系。

病毒侵染性克隆的獲得對(duì)開(kāi)展和推進(jìn)病毒與寄主互作研究至關(guān)重要。對(duì)PRSV來(lái)說(shuō)，目前已有PRSV-P株系HN-1、HN-2和YK分離物以及PRSV-W株系SD和CI分離物侵染性克隆成功構(gòu)建的報(bào)道[23-27]。筆者利用同源重組策略構(gòu)建了PRSV-W株系HaNHK10分離物的侵染性克隆，通過(guò)接種試驗(yàn)證實(shí)了該克隆在甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜中的高侵染性（侵染率可達(dá)100%）。與已報(bào)道的PRSV侵染性克隆相比，構(gòu)建策略、接種對(duì)象及侵染率有所不同，如HN-1分離物侵染性克隆利用Gibson組裝方法構(gòu)建而成，通過(guò)接種番木瓜和南瓜，發(fā)現(xiàn)其在接種后30 d時(shí)侵染率分別為66.7%和60%[24]，利用酵母同源重組系統(tǒng)構(gòu)建的HN-2分離物侵染性克隆在番木瓜中的侵染率僅為8.33%[25]，而利用Gibson組裝構(gòu)建的HN-2分離物侵染性克隆在番木瓜中的侵染率可達(dá)96%[26]，對(duì)PRSV-W株系SD分離物來(lái)說(shuō)，它的侵染性克隆是通過(guò)同源重組策略構(gòu)建而成的，與本試驗(yàn)相比，構(gòu)建策略相同，且均可系統(tǒng)侵染甜瓜、黃瓜、西瓜和西葫蘆4種作物，但它未用于南瓜和瓠瓜接種檢測(cè)，接種寄主較少[27]。在寄主來(lái)源方面，HN-1、HN-2和YK分離物均分離自番木瓜，CI分離自絲瓜，SD分離自西葫蘆，而HaNHK10分離自甜瓜。已有研究證實(shí)NIa-Pro的Lys27決定了PRSV侵染番木瓜的寄主特異性[23]。通過(guò)分析以上6種分離物的序列，發(fā)現(xiàn)PRSV-P株系HN-1、HN-2和YK分離物NIa-Pro的aa27均為L(zhǎng)ys，而PRSV-W株系SD、CI和HaNHK10分離物NIa-Pro的aa27均為Asp，說(shuō)明各分離物NIa-Pro的aa27類(lèi)型與其株系劃分屬性一致，株系劃分結(jié)果較為可信。但對(duì)于分離自番木瓜的BD-2、PM-H、PM-I、PS3-I和Meghalaya分離物來(lái)說(shuō)，該位點(diǎn)分別為Ser、Arg、Arg、Arg、Glu，而對(duì)于分離自葫蘆科作物的E2和16R分離物來(lái)說(shuō)，該位點(diǎn)分別為Glu和Asn，與已有報(bào)道有所不同，說(shuō)明目前尚不能僅依賴(lài)于該位點(diǎn)的氨基酸類(lèi)型對(duì)所有PRSV分離物進(jìn)行明確的株系劃分。該位點(diǎn)對(duì)PRSV的致病性和寄主范圍的具體影響及其作用機(jī)制仍需深入探討，PRSV侵染性克隆的獲得為開(kāi)展該方面的研究提供了有力工具。

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