摘" " 要：辣椒（Capsicum annuum L.）是世界上重要的蔬菜作物之一，雜種優(yōu)勢明顯。利用雄性不育系制種可有效解決人工去雄的難題，簡化制種工序，降低生產(chǎn)成本。而辣椒雄性不育是一個快速發(fā)展的研究領域。綜述了近幾年在辣椒雄性不育的類型與特點、細胞學特征、細胞核雄性不育的分子機制，以及細胞質(zhì)雄性不育的機制解析等方面所取得的重要進展，并對辣椒雄性不育中存在的問題以及未來發(fā)展方向進行了討論和展望，旨在為辣椒三系配套制種提供理論參考。

關鍵詞：辣椒；細胞核雄性不育；細胞質(zhì)雄性不育；細胞學特征

中圖分類號：S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）02-001-07

Molecular research progress of male infertility in Capsicum annuum L.

ZHANG Yiwen1， 2， XU Lanting1， 2， WANG Fei2， 3， LIU Yiqing1， 2， YAO Minghua1， 2， 3， XU Kai2

（1. Spice Crops Research Institute， Yangtze University/College of Horticulture and Gardening， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China; 2. Hubei Province Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation and Genetic Improvement/Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 3. Hubei Hongshan Laboratory， Wuhan 430070， Hubei， China）

Abstract： Pepper （Capsicum annuum L.） is one of the important vegetable crops in the world， with obvious heterosis. Using the male sterile line to produce hybrids can effectively replace manual emasculation， thereby simplifying the seed production process and reducing production costs. The research on male infertility in pepper is a rapidly developing field. We reviewed the important progress in the types， characteristics and cytological features of male infertility， the molecular mechanism of genic male sterile and cytoplasm male sterility in pepper. Further， the problems and development directions of male infertility in pepper were discussed and prospected， aiming to provide a theoretical reference for the three-line system of hybrid seed production for pepper.

Key words： Capsicum annuum L.; Genic male sterile; Cytoplasm male sterility; Cytological features

辣椒為茄科辣椒屬園藝植物，是全球規(guī)模最大的香料作物和調(diào)味品，也是我國栽培面積最大的蔬菜之一，常年栽培面積達3200萬hm2，年產(chǎn)值逾2500億元，栽培面積和總產(chǎn)量居世界首位，且有繼續(xù)增加的趨勢[1]。雜交品種被廣泛應用于辣椒生產(chǎn)，可顯著提高辣椒的產(chǎn)量、抗性和品質(zhì)。然而，目前辣椒雜交種的生產(chǎn)仍以人工去雄為主，授粉過程技術性強且勞動密集，成本巨大，種子純度難以保證。因此，利用雄性不育系可有效解決人工去雄的難題，簡化制種工序，降低生產(chǎn)成本，進而應用于辣椒雜交種的商業(yè)化高效生產(chǎn)[2]。

1 辣椒雄性不育的類型與特點

辣椒雄性不育主要包括兩種類型，細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasm male sterility，CMS）和細胞核雄性不育（genic male sterile，GMS）[3-4]。GMS只由細胞核基因控制，不受細胞質(zhì)影響，且育性遺傳符合孟德爾遺傳定律；而CMS是一種母系遺傳性狀，雄性不育由細胞核和線粒體基因共同決定[5]。CMS通常是由線粒體基因組開放閱讀框的重排引起的，來自核基因組的育性恢復基因Rf可抑制不育表型，促使育性恢復[6]。

CMS和GMS均已應用于辣椒的雜交種生產(chǎn)，帶來了巨大的經(jīng)濟和社會效益[7]。其中，GMS的選育和轉(zhuǎn)育較為簡單，育性穩(wěn)定、恢復源廣，制種過程中母本通常需要拔除50%的可育株，但第三代雜交水稻育種技術[8]的推出為GMS的應用提供了新的思路。CMS/Rf系統(tǒng)可提供100%的雄性不育株用于雜交制種，在生產(chǎn)上具備獨特優(yōu)勢，是植物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一[9]。但CMS/Rf系統(tǒng)的恢復源較少，在大多數(shù)大果型甜椒和少量微辣甜椒中較難選配到合適的恢復系，需通過轉(zhuǎn)育恢復基因的方式來人工創(chuàng)制恢復系[10]。

2 辣椒雄性不育的細胞學特征

育性與植物復雜的花藥和花粉發(fā)育過程緊密相關，該過程的終止或異常都可能引起雄蕊發(fā)育不良，最終導致雄性不育。一般而言，不育系、恢復系和保持系三者花藥的形態(tài)存在明顯差異。辣椒不育系的花藥瘦小、干癟、無花粉或花粉粒極少，花粉粒碘化反應不著色或著色極淡，恢復系和保持系的花藥大而飽滿，成熟花粉中充滿淀粉粒。不同作物發(fā)生敗育的時期和形態(tài)學變化都有較大的差異，但雄性不育通常是由花藥組織特別是絨氈層細胞的提前降解或過早細胞程序性死亡所導致的[11]?；ǚ墼诎l(fā)育過程中從小孢子母細胞到四分體，經(jīng)歷單核期、雙核期和三核期的整個過程都可能導致花粉發(fā)育異常[6]。其中，辣椒CMS不育系HZ1A的雄性不育開始于小孢子發(fā)育的四分體階段，不育系中僅能觀察到極少數(shù)異常和不規(guī)則的小孢子[12]。CMS不育系A-line的絨氈層細胞表現(xiàn)出空泡化和過早死亡，緊緊包圍并擠壓小孢子，從而抑制胼胝體降解和小孢子釋放，最終導致小孢子在單核晚期破裂和死亡[13]。辣椒GMS不育系16C1369A花粉敗育的關鍵階段發(fā)生在四分體時期，也是由于絨氈層過度空泡化并發(fā)生過早死亡，抑制胼胝體降解和小孢子在四分體時期的正常釋放[14]。通過石蠟切片觀察GMS不育系18Q5431A，發(fā)現(xiàn)絨氈層細胞過度空泡化并擠壓小孢子，抑制胼胝體降解和小孢子釋放，最終導致絨氈層細胞塌陷[15]。核不育突變體msc-3的花粉敗育發(fā)生在小孢子發(fā)育的早期階段，主要發(fā)生在第3～6期，由于絨氈層的發(fā)育異常，致使四分體的形成延遲和胼胝質(zhì)壁殘留，最終導致小孢子敗育[4]。由此可見，辣椒雄性不育的發(fā)生通常與絨氈層和胼胝體的異常發(fā)育緊密相關，但小孢子敗育的時期不盡相同。

3 辣椒細胞核雄性不育的分子機制

辣椒細胞核雄性不育的研究相對深入，大多數(shù)辣椒GMS突變體的不育表型由單隱性基因控制，目前已對多個候選基因進行精細定位和功能驗證。等位關系測驗表明，ms1到ms4、ms6到ms8均為非等位基因，ms1、ms3和ms10彼此之間為非等位基因，ms12與ms1和ms2為非等位基因，ms3與msw為非等位基因，msc-2與msc-1為非等位基因，但很可能與ms1為等位基因[4，15-17]。對核不育基因進行精細定位與克隆，篩選與GMS表型共分離或基于不育基因序列差異的分子標記，可以在苗期對不育株進行鑒別以減少定植株數(shù)，降低生產(chǎn)成本和縮短育種年限[18]。

Jeong等[16]利用1118個單株的F2群體結(jié)合HRM標記，將ms1基因縮小至CM334基因組869.9 kb的物理區(qū)間內(nèi)，包含11個開放閱讀框，其中編碼PHD型轉(zhuǎn)錄因子、可能參與花粉和絨氈層發(fā)育調(diào)節(jié)的CA05g06780基因被確定為ms1候選基因，并開發(fā)了1個共分離標記32187928-HRM。Cheng等[19]利用BSA測序結(jié)合1110個單株群體的標記進行共分離檢測后，Capana02g002096（CaDYT1）被確定為msc-1基因的候選基因，且通過VIGS（virus induced gene silencing）技術降低該基因的表達量后出現(xiàn)了雄性不育的表型，該基因編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，可能參與了辣椒絨氈層的早期發(fā)育，外顯子7 bp的缺失導致該轉(zhuǎn)錄過程提前終止和功能喪失。Guo等[20]通過RNA原位雜交試驗，發(fā)現(xiàn)CaAMS（CaAMS1和CaAMS2-2）在四分體時期和單核期在絨氈層中高表達，CaAMS的下調(diào)會導致辣椒花絲縮短、雄蕊萎縮和花粉敗育。因此推測CaAMS可能通過調(diào)節(jié)復雜的遺傳網(wǎng)絡在辣椒絨氈層和花粉發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

Cheng等[15]利用BSA結(jié)合圖位克隆，將msc-2基因精細定位至Zunla-1基因組336 kb的候選區(qū)間內(nèi)，其中Capana05g000766（CaMS1）基因在辣椒花藥中特異表達，推測該基因T堿基的缺失導致轉(zhuǎn)錄提前終止，致使不育系18Q5431A出現(xiàn)不育表型，并通過VIGS驗證了msc-2候選基因的功能。對等位基因檢測的結(jié)果表明msc-1和msc-2為非等位基因，且通過雙分子熒光互補證實了這2個基因在蛋白質(zhì)水平上沒有發(fā)生直接互作。Dong等[4]發(fā)現(xiàn)了1個新的隱性核不育突變體msc-3，并利用改進的MutMap方法和分子標記連鎖分析對msc-3位點進行精細定位，將其鎖定在Zunla-1基因組10號染色體139.91 kb的區(qū)間內(nèi)，共包含10個注釋基因。比較測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不育系Capana10g000198基因的第三外顯子存在163 bp的LTR轉(zhuǎn)座子插入，并據(jù)此開發(fā)了Ind198功能標記，且該基因在保持系和不育系花蕾的第3～7階段差異表達，因此Capana10g000198（CaMYB80）被確定為msc-3位點的候選基因。筆者通過10個組織的qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因只在花藥中特異性表達。通過VIGS技術使Capana10g000198表達量下調(diào)后，出現(xiàn)明顯的雄性不育表型，且沉默單株中無法觀察到花粉粒。綜上所述，目前已在辣椒中圖位克隆和功能驗證了3個細胞核雄性不育基因（msc-1、msc-2和msc-3）。3個基因均在辣椒花藥中特異表達，通過編碼轉(zhuǎn)錄因子（bHLH、MYB）或PHD-finger蛋白，參與了辣椒絨氈層發(fā)育和育性調(diào)控的整個過程，因外顯子區(qū)的序列缺失或轉(zhuǎn)座子插入，最終導致了突變體的雄性不育表型。

4 辣椒細胞質(zhì)雄性不育的分子機制

4.1 辣椒細胞質(zhì)雄性不育基因

細胞質(zhì)雄性不育是高等植物雜種優(yōu)勢利用的主要途徑之一，因其母系遺傳的特點在雜交制種上具備獨特優(yōu)勢。CMS不育基因通常編碼具有細胞毒性的跨膜蛋白，導致線粒體功能改變從而出現(xiàn)雄性不育[21]。例如，WA352與COX11互作影響過氧化物代謝，引發(fā)水稻絨氈層細胞程序性死亡和花粉敗育，從而使水稻呈現(xiàn)野敗型CMS表型[11]（圖1）。ORFH79可與復合物III結(jié)合，并通過與P61亞基的相互作用降低其活性，引起線粒體能量代謝障礙和氧化應激，導致水稻紅蓮型CMS的花粉敗育[22]。辣椒不育表型的產(chǎn)生主要來源于自然突變。迄今為止，國內(nèi)外研究人員圍繞辣椒CMS突變體開展了大量研究[23]。1958年，Peterson[24]首次在引進材料PI 164835中發(fā)現(xiàn)了辣椒的CMS現(xiàn)象。在國內(nèi)，楊世周等[25]率先從品種向陽椒中分離到雄性不育株，并選育出不育系8021A及保持系8021B，成功實現(xiàn)辣椒的三系配套制種。

辣椒CMS不育基因的研究相對滯后，前期通過線粒體測序、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化等技術手段，鑒定到2個不育基因atp6-2和orf456，并據(jù)此開發(fā)出了4個特異性SCAR標記CoxII、atp6、orf456-SCAR和SCAR130[26-27]。Kim等[27]通過Southern Blot和Northern Blot技術，在線粒體基因組coxII基因的3’末端鑒定到1個新的ORF，命名為orf456。該基因編碼產(chǎn)生1個約17 kDa的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，且不育系的蛋白表達量明顯高于恢復系。為了研究orf456蛋白在辣椒線粒體中的功能，Kim等[27]利用線粒體靶向的orf456基因載體轉(zhuǎn)化擬南芥后，出現(xiàn)了雄性不育表型且無法正常結(jié)實。orf507是orf456基因的變異轉(zhuǎn)錄本，在保持系中轉(zhuǎn)入orf507會導致辣椒出現(xiàn)雄性不育的表型[28]。進一步研究表明，含有線粒體信號肽（MtATP6）的ATP合酶6 kDa亞基與orf507存在特異性的相互作用，ATP合成酶的活性和含量可能會影響辣椒CMS植株的花粉發(fā)育[29]。

Ji等[26]研究發(fā)現(xiàn)不育系HW203A中atp6-2基因的表達下調(diào)降低了F1F0-ATP酶的活性。線粒體中的orf507和atp6-2基因可能分別參與細胞色素C氧化酶和F1Fo-ATP酶的合成調(diào)控，從而影響CMS不育系的花藥敗育過程。orf165基因可能也參與了辣椒CMS表型的產(chǎn)生，在保持系ML-14B中過表達orf165會出現(xiàn)雄性不育的表型，而不育系CMS-14A中該基因的沉默則會導致育性恢復[30]。Wang等[31]通過對不育系138A及其保持系138B的線粒體基因組測序組裝，在138A和138B中分別鑒定出超過214個和215個長度超過100個氨基酸的開放閱讀框。其中orf300a和orf314a被預測為不育系138A不育表型的候選基因，并開發(fā)了1個新的共分離標記orf300a，已成功應用于CMS材料的篩選。開發(fā)不育基因相關的分子標記為快速篩選不育株、保持株及轉(zhuǎn)育新的不育系創(chuàng)造了條件，提高了育種的準確性和選擇效率，為進一步探索細胞質(zhì)雄性不育的敗育機制及不育基因的克隆提供幫助。

4.2 辣椒細胞質(zhì)雄性不育恢復基因

恢復CMS育性在雜交生產(chǎn)中至關重要，Rf基因通常會影響CMS相關基因的蛋白質(zhì)表達，促使育性恢復，因此被認為可減少或消除CMS相關基因所造成的不利影響[32]。CMS/Rf系統(tǒng)為研究核質(zhì)互作信號交流提供了理想材料，同時也廣泛應用于水稻、油菜、玉米等作物的商業(yè)雜交種生產(chǎn)。近10年來，隨著植物參考基因組的陸續(xù)公布，CMS恢復基因的研究成為熱點之一。目前已從水稻、玉米、油菜、小麥和大豆等作物中鑒定報道了10多個Rf基因。Rf基因通常影響線粒體中不育基因的轉(zhuǎn)錄，從而恢復不育系的育性。例如，Rf4基因通過降低WA352的轉(zhuǎn)錄本水平，促使水稻野敗型CMS花粉育性恢復[33]；Rf6蛋白與HXK6互作，降低了紅蓮型CMS中atp6-orfH79轉(zhuǎn)錄本的積累，從而保證水稻花粉的正常發(fā)育[34]；玉米Rf3（PPRK2）基因通過抑制線粒體orf77基因的編輯和降解，加速不育基因orf355的降解，從而恢復CMS-S的育性[35]。

目前克隆的大多數(shù)Rf基因編碼包含多個五肽重復序列結(jié)構(gòu)域的PPR蛋白，包括水稻中的Rf4、Rf1a、Rf1b（Rf5）與Rf6，油菜中的Rfn、Rfp與Rfh，玉米中的Rf1和Rf3，蘿卜中的Rfo，小麥中的RFL79與RFL29a，以及大豆中的GmPPR576等[36]。PPR蛋白是陸生植物最大的蛋白家族之一，在大多數(shù)物種中擁有400多個成員。PPR蛋白在植物轉(zhuǎn)錄后mRNA加工中發(fā)揮重要作用，包括RNA編輯、剪接、切割和降解。PPR蛋白通常由多個PPR基序串聯(lián)組成，根據(jù)所含重復基序的不同可將PPR蛋白劃分為P亞家族和PLS亞家族[37]。大多數(shù)恢復基因?qū)儆赑亞家族的RFL（restorer-of-fertility-like）家族分支，具有P亞家族的典型結(jié)構(gòu)特征。RFL家族基因常以基因簇的形式存在，例如，水稻恢復基因Rf4、Rf1a與Rf1b位于同一基因簇內(nèi)[33]。

在辣椒CMS的相關研究中，大多報道認為育性恢復是1個基因控制的顯性性狀[38]，也有研究者發(fā)現(xiàn)，育性恢復是1個主效QTL和4個微效QTL控制的數(shù)量性狀[39]，不育表型也可能受到溫度的影響[40]。在CM334和Zunla-1參考基因組發(fā)布前，CMS恢復基因的研究以QTL定位和標記開發(fā)為主。Zhang等[41]、Min等[42]利用F2群體結(jié)合BSA開發(fā)出2個與Rf基因連鎖的RAPD標記OP131400和OW19800，遺傳距離分別為0.37和8.12 cM，其中OP131400被廣泛應用于后續(xù)研究。Lin等[9]、Gulyas等[38]報道了1個高精度的SCAR標記CRF-SCAR，并成功應用于甜椒恢復系的MAS轉(zhuǎn)育。Jo等[43]在恢復基因CaPPR6附近開發(fā)標記Co1Mod1-CAPS，與Ortega等[44]開發(fā)的標記CaRf648均顯示出90%以上的鑒定準確度。

隨著生物信息學的發(fā)展和辣椒全基因組測序的完成，多個辣椒恢復基因被相繼克隆和報道（表1），包括CaPPR6、Capana06g003028、CaRf032（CA00g82510）、CA00g30080、Capana06g002968、Capana06g002967和Capana06g2002969[3，36，45-47]。其中，Jo等[43]利用BAC 文庫篩選結(jié)合BSA-AFLP技術，將恢復基因定位在821 kb區(qū)間，根據(jù)轉(zhuǎn)錄本表達分析和序列特征，最終確定CaPPR6為Rf候選基因。Wu等[47]基于SLAF-seq測序技術結(jié)合GWAS分析，鑒定到2個Rf候選基因Capana06g002967和Capana06g002969。Cheng等[46]通過構(gòu)建辣椒高密度SNP遺傳圖譜，成功將恢復基因精細定位至Zunla-1基因組270.10 kb的物理區(qū)間內(nèi)，并將Capana06g003028確定為候選基因。Zhang等[3]利用KASP標記將恢復基因定位到Zunla-1基因組6號染色體148.05 kb的區(qū)間內(nèi)，并推測是候選基因CaRf032（CA00g82510）的變異導致了轉(zhuǎn)錄提前終止。Kang等[45]將恢復基因Rfu精細定位至UCD10X基因組6號染色體398 kb的區(qū)間內(nèi)，編碼PPR蛋白的CA00g30080基因被確定為Rfu候選基因。Nie等[36]基于BSA結(jié)合圖位克隆的手段，將恢復基因CaRfHZ精細定位至Zunla-1基因組533.81 kb的區(qū)間內(nèi)，并將Capana06g002968確定為候選基因。然而，因二代參考基因組的局限性，CaPPR6、CaRf032、Rfu的候選基因均不能比對到參考基因組6號染色體。辣椒CMS恢復基因的研究仍停留在精細定位階段，國內(nèi)外尚未見CMS恢復基因功能驗證的研究報道，且育性調(diào)控機制有待進一步研究。

5 展 望

隨著現(xiàn)代分子生物學的快速發(fā)展，分子標記輔助選擇極大地縮短了育種時間并提高了轉(zhuǎn)育效率，但是依舊需要5～6代的轉(zhuǎn)育和自交純化，導致辣椒分子育種發(fā)展緩慢。目前而言，辣椒雄性不育在生產(chǎn)實踐和理論研究方面都取得了較大的進展，CMS和GMS均已應用于辣椒的雜交種生產(chǎn)，但仍然面臨著許多挑戰(zhàn)和未知領域。

5.1 應用生物工程創(chuàng)制辣椒雄性不育系

現(xiàn)有辣椒CMS/Rf 系統(tǒng)具有技術復雜性高、所需條件苛刻的特點，不育表型易受到基因型和環(huán)境條件的干擾且恢復源少。部分辣椒尤其是甜椒CMS不育系很難找到恢復系，有些能找到恢復系但難以測出強優(yōu)組合，不育和恢復基因的轉(zhuǎn)育受限于輪回親本的遺傳背景[48]。同時，國內(nèi)胞質(zhì)不育材料的同質(zhì)性較高，造成了基礎研究的部分重復和資源浪費。而利用基因工程手段創(chuàng)制新的不育系，可有效避免自然突變和人工篩選費時費力的缺點。通過基因編輯、遠緣雜交和原生質(zhì)體融合等生物技術創(chuàng)制雄性不育系，挖掘新的不育基因和恢復基因，明確恢復基因在自然群體中的分布規(guī)律，可進一步拓展辣椒雜種優(yōu)勢利用的胞質(zhì)類型，為三系配套制種奠定堅實的理論基礎。

與此同時，辣椒GMS育性控制新基因的挖掘與功能研究，逐漸成為近幾年雄性不育研究的熱點之一[4]。第三代雜交水稻育種技術[8]和玉米SPT（seed production technology）技術[49]的推出為辣椒隱性核不育系的生產(chǎn)應用提供了新的思路，可通過轉(zhuǎn)基因等技術手段建立非轉(zhuǎn)基因遺傳背景的辣椒隱性核不育三系配套制種體系，有效解決拔除50%可育株的技術難題。但前提是建立簡單高效的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時遺傳轉(zhuǎn)化效率低也極大地限制了CRISPR/Cas9技術在辣椒中的應用。

5.2 結(jié)合新技術進一步加強雄性不育機制研究

近幾年隨著現(xiàn)代分子生物學技術的快速發(fā)展，多個作物中Rf基因的圖位克隆和功能研究取得了較大進展，不育基因與Rf基因間的互作機制也逐漸明晰[36]。辣椒CMS/Rf 系統(tǒng)的育性是由線粒體基因所控制的，但控制這種性狀的基因及其調(diào)控花器官發(fā)育的分子機制仍然不明確。不育性在不同環(huán)境中的不穩(wěn)定也是限制辣椒CMS/Rf 系統(tǒng)應用的一大障礙，需對辣椒CMS不育系的溫敏特性進行系統(tǒng)研究，尤其是溫度調(diào)節(jié)育性改變的分子機制[50]。

育性恢復是由多因素在多個維度共同精細調(diào)控的復雜過程，需要從基因、mRNA、蛋白質(zhì)、小分子代謝物和表觀修飾等多個層面，深入解析辣椒細胞核Rf基因與線粒體不育基因間的相互作用關系，揭示育性恢復的調(diào)控機制。同時，因二代參考基因組的局限性，CMS恢復基因位點CaPPR6、CaRf032、Rfu的候選基因均不能比對到辣椒6號染色體，而T2T基因組測序為辣椒高質(zhì)量基因組的組裝提供了可能。未來可以通過辣椒線粒體和細胞核基因組的T2T測序，結(jié)合泛基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白組和表觀基因組等前沿技術共同探究CMS育性調(diào)控的分子機制[51-52]。

因此，在辣椒雄性不育工作中，CRISPR/Cas9、VIGS、T2T基因組測序和多組學聯(lián)合分析等新技術新方法的廣泛應用，勢必會加快辣椒雄性不育的研究進程，使得辣椒雄性不育研究取得新的突破和進展，為三系配套制種提供遺傳資源、奠定理論基礎，進一步推動辣椒雄性不育商業(yè)雜交種的生產(chǎn)。

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