摘要：為初步探究1株分離自蘭坪鉛鋅尾礦的特基拉芽孢桿菌KC 121的防病促生效果及作用機理，將其無菌濾液涂布平板與病原菌共培養(yǎng)以及與發(fā)酵濾液病原菌孢子共孵育來測定菌株KC 121對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢數(shù)量及孢子萌發(fā)的影響；以發(fā)酵液浸種試驗來測定菌株KC 121對玉米種子萌發(fā)的影響；最后利用盆栽灌根的方法研究菌株KC 121對玉米鐮刀菌根腐病的防治效果及對玉米幼苗的促生作用并探究其機理。結(jié)果表明，特基拉芽孢桿菌KC 121無菌濾液可使鐮刀菌菌絲發(fā)生皺縮和凹陷，同時抑制了鐮刀菌孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)；浸種試驗結(jié)果表明，稀釋1×103倍的菌株KC 121發(fā)酵液可以促進玉米種子萌發(fā)時主根增長61%，芽長增加162%；在盆栽試驗中，菌株KC 121發(fā)酵液原液對腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）和擬枝孢鐮刀菌（Fusarium sporotrichioides）引起的玉米根腐病的防治效果分別為66.67%和76.00%，且分別使玉米植株地上部分干質(zhì)量和鮮質(zhì)量提高了130%和90%。促生機理探究發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌KC 121通過產(chǎn)淀粉酶，并產(chǎn)生6.19 ng/ml的吲哚乙酸（IAA）和提高玉米幼苗的總?cè)~綠素含量來促進玉米幼苗生長。研究結(jié)果顯示特基拉芽孢桿菌KC 121對防治玉米鐮刀菌病害及促進玉米生長具有應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：特基拉芽孢桿菌；鐮刀菌；抑菌機理；促生機理

中圖分類號：S435.131文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2024）02-0233-10

Disease prevention against corn Fusarium and growth promotion of Bacillus tequilensis KC 121

WU Ya-jie1，F(xiàn)AN Bing-jun2，ZHU Guo-xing1，JIAO Yu1，ZHANG Xing-li1，WANG Rui-xue1，ZHOU Ping1，CAO Yan-ru1

（1.College of Agriculture and Life Sciences， Kunming University， Kunming 650214， China;2.Lijiang Plant Protection Station， Lijiang 674199， China）

Abstract：The Bacillus tequilensis KC 121 which isolated from the lead-zinc tailings of Lanping， showed strong inhibition activity against Fusarium spp. In this article， its fungal inhibition activity， plant growth promotion effect， and the corresponding mechanism were studied. The sterile filtrate of KC 121 was used to co-culture with pathogenic fungi and co-incubation with pathogenic fungal spores to determine its effects on hyphal growth， conidia production and germination. The maize seeds were soaked with fermentation broth to determine the effects of strain KC 121 on maize seed germination. Finally， the bio-control effect of strain KC 121 against Fusarium and the plant-growth promotion effect on maize seedlings were studied by pot experiment. The results showed that after co-culture with KC 121， the hyphae of Fusarium were wrinkled and sunken， and conidia production and germination were also inhibited. The fermentation broth of strain KC 121 could promote the growth of taproot by 61% and bud growth by 162% during maize seed germination. In the pot experiment， the inhibition effects of KC 121 fermentation broth on root rot caused by Fusarium solani and Fusarium sporotrichioides were 66.67% and 76.00%， respectively， and the dry and fresh weight of maize were increased by 130% and 90%， respectively. The KC 121 strain promoted the growth of maize seedlings by producing amylase， producing 6.19 ng/ml indole acetic acid （IAA） and increasing the total chlorophyll content. The B. tequilensis KC 121 showed important potential in controlling the Fusarium disease of maize and promoting maize growth.

Key words：Bacillus tequilensis;Fusarium;antibacterial mechanism;promoting growth mechanism

鐮刀菌（Fusarium）隸屬叢梗孢目瘤痤孢科鐮刀菌屬，是一類世界性分布的真菌，它可以造成糧食作物、經(jīng)濟作物及藥用植物等多達數(shù)百種植物的根腐病、莖腐病、花腐病和穗腐病等病害。鐮刀菌還會通過孢子對作物進行二次侵染，帶來持續(xù)的農(nóng)業(yè)危害，是生產(chǎn)上最難防治的病原菌之一。鐮刀菌的種類繁多，由其導(dǎo)致的作物減產(chǎn)造成了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的巨大經(jīng)濟損失。研究結(jié)果表明，禾谷鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌及尖孢鐮刀菌是造成玉米根腐病的主要致病菌[1-3]，是玉米生產(chǎn)的重要隱患。由鐮刀菌引起的玉米病害極大地影響了玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前，對于鐮刀菌引起的病害多采用化學(xué)藥劑進行防治，造成了嚴(yán)重的農(nóng)殘超標(biāo)和環(huán)境污染問題，同時對人畜健康存在潛在威脅。因此，迫切需要研究安全有效的生物防治措施來攻克鐮刀菌病害。生物防治具有農(nóng)藥殘留少、環(huán)保、具有靶向性、可以改善土壤微生態(tài)等優(yōu)點[4]，是近年來農(nóng)業(yè)病害防治研究的重點方向。目前應(yīng)用于植物鐮刀菌生物防治的微生物主要有木霉菌、非致病性尖孢鐮刀菌、叢枝菌根真菌、芽孢桿菌、假單胞菌等。其中，芽孢桿菌屬菌株（Bacillus）是一類分布于自然環(huán)境以及動物腸道等處的能產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性菌，由于其能產(chǎn)生酶及多種廣譜殺菌活性物質(zhì)而成為研究熱點[5]。張艷茹等[6]、曹榮耀等[7]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌及禾谷鐮刀菌具有抑制作用；毛咪等[8]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌對茄病鐮刀菌具有良好的拮抗作用；常淑嫻等[9]、吉亞泰[10]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌、皮奧顯亞類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌具有較強的拮抗作用?？梢?，芽孢桿菌在由鐮刀菌引起的植物病害的生物防治研究領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。除了抑制病原菌之外，芽孢桿菌還能促進作物生長，如王華笑[11]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌可以抑制尖孢鐮刀菌，同時有解淀粉、溶解磷、產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）的能力，可以促進鹽堿脅迫下的玉米生長。李安等[12]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌不但能增強玉米的抗旱性，還能有效促進玉米的萌發(fā)及萌發(fā)期幼苗的生長。

目前尚無特基拉芽孢桿菌防治玉米根腐病的報道，本實驗室前期從蘭坪鉛鋅尾礦極端環(huán)境中分離篩選出1株能同時抑制腐皮鐮刀菌（F. solani）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和擬枝孢鐮刀菌（F. sporotrichioides）4種鐮刀病原菌的菌株KC 121并鑒定其為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）[13]。在測定該菌株對鐮刀菌病害防治效果的同時，發(fā)現(xiàn)其還可以促進玉米幼苗生長。本研究將進一步測定特基拉芽孢桿菌對4種玉米鐮刀根腐病原菌的抑制及對玉米種子萌發(fā)和幼苗的促生作用，并探究其防病促生機理，從而為鐮刀菌的生物防治研究提供理論依據(jù)和菌種資源。

1材料與方法

1.1材料和試劑

本研究采用無包衣的玉米種子作為鐮刀菌防效測定及促幼苗生長等試驗的供試材料。本研究中用到的鐮刀病原菌菌株有：腐皮鐮刀菌（F. solani，B6）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum，B7）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum，B8）和擬枝孢鐮刀菌（F. sporotrichioides，B9）。特基拉芽孢桿菌KC 121為本課題組前期分離篩選所得[13]。

以上菌株均在28 ℃條件下培養(yǎng)。特基拉芽孢桿菌KC 121采用改良ISP 2（ISP Medium 2，國際鏈霉菌培養(yǎng)基2號）培養(yǎng)[14]。4種鐮刀病原菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)[15]。蒙金娜無機磷培養(yǎng)基用于測定KC 121菌株解磷能力[16]。鉀長石培養(yǎng)基用于測定KC 121菌株解鉀能力[17]。Ashby無氮培養(yǎng)基用于測定KC 121菌株固氮能力[18]。淀粉水解瓊脂培養(yǎng)基用于測定KC 121菌株水解淀粉能力[19]。

1.2特基拉芽孢桿菌KC 121的抑菌作用

實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌KC 121對腐皮鐮刀菌（F. solani）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和擬枝孢鐮刀菌（F. sporotrichioides）4種鐮刀病原菌的抑菌率分別為76.91%、65.31%、47.88%、82.66%（圖1）。本研究對特基拉芽孢桿菌的抑菌機理進行了初步探究。

1.2.1特基拉芽孢桿菌KC 121對4種病原菌菌絲及孢子生長形態(tài)影響的電鏡觀察菌株活化：從特基拉芽孢桿菌KC 121保藏試管中挑取菌體轉(zhuǎn)接于ISP 2平板上，進行活化培養(yǎng)。同時，從病原菌保藏試管中挑取菌絲接種于PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d。

發(fā)酵液制備：挑取特基拉芽孢桿菌KC 121的單菌落接種至ISP 2液體培養(yǎng)基中，置于200 r/min、28 ℃的搖床培養(yǎng)3 d，制得發(fā)酵液。發(fā)酵液離心后用0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾，再用無菌水分別制成稀釋1×101倍、1×102倍的發(fā)酵濾液稀釋液。

對病原菌菌絲及孢子生長的影響：分別取200 μl不同含量的發(fā)酵濾液涂布于PDA平板上，待培養(yǎng)基表面的液體吸收后將直徑為8 mm的病原菌菌塊接種于平板上[20]，在28 ℃恒溫箱培養(yǎng)7 d，以空白培養(yǎng)基涂板培養(yǎng)為對照。待病原菌長好后，從菌落邊緣切矩形小塊放在樣品臺上，將樣品臺放入提前準(zhǔn)備好的液氮雪泥中，-80 ℃升華10 min后噴金鍍膜2次（每次1 min），進行形態(tài)觀察。

1.2.2特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵濾液對病原菌孢子萌發(fā)影響的顯微鏡觀察病原菌孢子懸浮液制備：用無菌水洗脫產(chǎn)孢病原菌菌絲上的孢子，將孢子懸浮液用無菌水稀釋制得1 ml 104個的病原菌孢子懸浮液。

對病原菌孢子萌發(fā)影響的測定：采用凹玻片法[21]測定不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵濾液（制備方法同1.2.1）對病原菌孢子萌發(fā)的影響。在凹玻片中央滴加20 μl發(fā)酵濾液和20 μl孢子懸浮液，混合均勻，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在28 ℃的條件下培養(yǎng)，每2 h鏡檢1次，觀察并記錄萌發(fā)情況，直至對照組的萌發(fā)率達90%時停止觀察。

1.3特基拉芽孢桿菌KC 121的防病效果測定

試驗在大棚內(nèi)進行，玉米種子在穴盤中育苗后，將長勢一致的玉米幼苗移栽至裝有混合土壤（腐殖土∶紅土=1∶1）的盆中。試驗設(shè)置3個處理，每個處理30株，處理情況如下：

處理一：將玉米幼苗移栽到正常土壤中；

處理二：將玉米幼苗移栽到拌有病原菌的土壤中，隨后灌入200 ml的特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液（菌體含量為4.97×106CFU/ml），每7 d澆灌1次；

處理三：將玉米幼苗移栽到拌有病原菌的土壤中，隨后灌入200 ml的空白培養(yǎng)基，每7 d澆灌1次。

自移栽之日起每7 d觀察玉米幼苗的生長及發(fā)病情況并記錄，共觀察21 d。根據(jù)記錄結(jié)果，按照劉治剛[22]和樊炳君[23]的分級標(biāo)準(zhǔn)進行病情指數(shù)和防治效果的測定。

1.4特基拉芽孢桿菌KC 121對玉米促生效果的測定

1.4.1特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液促玉米種子萌發(fā)試驗按照1.2.1的方法制備發(fā)酵液原液，并用無菌水分別制成稀釋1×101倍、1×102倍、1×103倍、1×104倍、1×105倍、1×106倍的發(fā)酵液稀釋液，分別吸取10 ml上述稀釋液加入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。挑選清水浸泡了24 h的飽滿玉米種子，置于培養(yǎng)皿中，每皿10 粒，浸濕濾紙，以空白培養(yǎng)基（CK）為對照。將處理好的種子放置在光照培養(yǎng)箱（溫度28 ℃，濕度70%）中培養(yǎng)，每天補充2 ml發(fā)酵濾液稀釋液（共培養(yǎng)5 d），每天進行觀察，記錄主根長和芽長。

1.4.2特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液促玉米植株生長試驗將種子放入清水中浸泡24 h后取出，挑選飽滿的玉米種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中催芽。待80%的種子萌發(fā)后挑選長勢一致的種子播種于穴盤中。每穴播入1粒種子，待株高為10 cm左右時，將其移栽至花盆中繼續(xù)種植，每周每盆加入200 ml的發(fā)酵液原液灌根，每4 d進行觀察并記錄株高和莖粗。栽種24 d后將植株拔出，用清水洗掉根部附著的土壤，放在通風(fēng)處自然晾干表面水分后分別進行地上部分和地下部分鮮質(zhì)量的稱量；隨后將植株放入烘箱65 ℃恒溫烘干后稱量干質(zhì)量。

1.5特基拉芽孢桿菌KC 121的促生機制初探

從固氮、溶磷、溶鉀、產(chǎn)吲哚乙酸以及對玉米幼苗葉綠素含量的影響等方面探究特基拉芽孢桿菌KC 121促生作用的機理。根據(jù)黃濤[24]的方法對特基拉芽孢桿菌KC 121促生功能進行測定：利用Ashby無氮培養(yǎng)基測定菌株固氮能力，菌株在平板上能正常生長即具有固氮能力；利用蒙金娜無機磷培養(yǎng)基測定菌株溶磷能力，菌落周圍產(chǎn)生透明圈即說明菌株具有溶無機磷能力；利用鉀長石培養(yǎng)基測定菌株溶鉀能力，菌落周圍產(chǎn)生透明圈即說明菌株具有溶鉀能力。

使用IAA試劑盒測定特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液中IAA的含量[25]；利用淀粉水解瓊脂培養(yǎng)基測定特基拉芽孢桿菌KC 121水解淀粉的能力[23]；采用李合生[26]的方法測定玉米幼苗的葉綠素含量。

2結(jié)果與分析

2.1特基拉芽孢桿菌KC 121的抑菌作用

2.1.1特基拉芽孢桿菌KC 121對病原菌菌絲及分生孢子形態(tài)影響的電鏡觀察由于未經(jīng)稀釋的發(fā)酵液即原液對病原菌的抑制效果最好，因此選用該含量平板上的菌絲觀察特基拉芽孢桿菌KC 121對4種病原菌形態(tài)的影響。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的4種病原菌菌絲表面光滑，呈現(xiàn)正常的管狀結(jié)構(gòu)，長且直，并均勻地從頂端延伸生長。經(jīng)過菌株KC 121發(fā)酵液處理的4種病原菌菌絲相比對照有較大變化，菌絲粗細(xì)不一，表面均出現(xiàn)皺縮和凹陷。其中，B6、B7和B8病原菌在經(jīng)過發(fā)酵液處理后菌絲發(fā)生明顯黏連現(xiàn)象，B6和B9的菌絲體彎折明顯且易斷裂，B7和B8的菌絲體則出現(xiàn)了一定程度的皺縮和凹陷（圖2）。以上結(jié)果表明菌株KC 121發(fā)酵液可以通過使4種鐮刀病原菌菌絲發(fā)生不同程度的皺縮、凹陷和彎折而抑制其菌絲的生長。

通過光學(xué)顯微鏡初步觀察（圖3）可以看出，與對照相比，B6病原菌處理組的分生孢子數(shù)量減少，分生孢子形態(tài)變小且細(xì)長。B7病原菌處理組及對照均未發(fā)現(xiàn)分生孢子，經(jīng)處理的B7病原菌，菌絲分隔減少。B8病原菌處理組的分生孢子數(shù)量也明顯減少，視野中僅有極少的分生孢子分布，且分生孢子形態(tài)變得小且細(xì)長。B9病原菌處理組的分生孢子數(shù)量同對照相比減少，而分生孢子形態(tài)無明顯變化。該結(jié)果表明特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液可以通過減少病原菌分生孢子的數(shù)量來抑制腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌的生長，通過減少菌絲分隔來抑制禾谷鐮刀菌的生長。

2.1.2特基拉芽孢桿菌KC 121對病原菌分生孢子萌發(fā)的顯微鏡觀察由于多次培養(yǎng)均未找到禾谷鐮刀菌的分生孢子，因此本試驗僅研究了特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液對其他3種病原菌分生孢子萌發(fā)的影響（表1）。

對于腐皮鐮刀菌（F. solani）來說，當(dāng)培養(yǎng)至4 h時，對照的分生孢子萌發(fā)率為59.37%，發(fā)酵液原液處理過的分生孢子萌發(fā)率僅為22.16%，稀釋1×101倍的發(fā)酵濾液處理的分生孢子萌發(fā)率為38.44%，稀釋1×102倍的發(fā)酵濾液處理的分生孢子萌發(fā)率與對照無明顯差異；當(dāng)培養(yǎng)至6 h時，對照的分生孢子萌發(fā)率為87.06%，發(fā)酵液原液處理過的分生孢子萌發(fā)率僅為27.49%，而稀釋1×101倍和稀釋1×102倍的發(fā)酵濾液處理的分生孢子萌發(fā)率則較高（表1）。以上結(jié)果表明隨著發(fā)酵液含量的降低，對分生孢子萌發(fā)的抑制能力也降低。

對分生孢子萌發(fā)的顯微觀察發(fā)現(xiàn)，2 h時對照的部分分生孢子已開始萌發(fā)，而處理組的分生孢子在4 h時才開始萌發(fā)。隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組的分生孢子不斷萌發(fā)并發(fā)育成正常菌絲；發(fā)酵液原液和稀釋1×101倍的發(fā)酵濾液處理的分生孢子則未能正常萌發(fā)，二者在分生孢子萌發(fā)芽管的不同位置發(fā)生膨大，進而減緩甚至阻止了菌絲的形成，該現(xiàn)象在培養(yǎng)8 h時稀釋1×101倍的發(fā)酵濾液處理組中表現(xiàn)得最為明顯（圖4）。稀釋1×102倍的發(fā)酵濾液對分生孢子萌發(fā)的影響不明顯。

對于尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）來說，培養(yǎng)6～8 h時對照的分生孢子萌發(fā)率為55.65%～90.54%，而發(fā)酵液原液極大地降低了分生孢子萌發(fā)率（表1），發(fā)酵濾液稀釋液對分生孢子萌發(fā)的抑制作用則顯著減弱。通過顯微鏡觀察到培養(yǎng)8 h時發(fā)酵液原液處理的尖孢鐮刀菌僅有少數(shù)開始萌發(fā)且產(chǎn)生的芽管發(fā)生膨大。

對于擬枝孢鐮刀菌（F. sporotrichioides）而言，在培養(yǎng)2 h到8 h的時間段內(nèi)，發(fā)酵液原液始終對分生孢子萌發(fā)有較強的抑制作用（表1），少數(shù)萌發(fā)的分生孢子芽管較短且出現(xiàn)不同程度的膨大。發(fā)酵濾液稀釋液對分生孢子萌發(fā)的抑制作用明顯降低。

綜上所述，特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液原液會使萌發(fā)分生孢子的芽管延伸受阻，使芽管發(fā)生膨大，進而抑制菌絲的正常形成。由表1可以看出，處理時間高于2 h時，菌株KC 121發(fā)酵液原液對腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果最好。

2.2特基拉芽孢桿菌KC 121的防病效果

盆栽試驗結(jié)果（表2）表明，菌株KC 121發(fā)酵液原液灌根處理對由腐皮鐮刀菌（F. solani）和擬枝孢鐮刀菌（F. sporotrichioides）引起的玉米根腐病的防治效果分別為66.67%和76.00%，對由尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和禾谷鐮刀菌（F. graminearum）引起的玉米根腐病在盆栽試驗中的防治效果僅有3.43%和4.64%。以上結(jié)果表明，特基拉芽孢桿菌KC 121對由腐皮鐮刀菌（F. solani）和擬枝孢鐮刀菌（F. sporotrichioides）引起的玉米根腐病有較好的防治效果，而對尖孢鐮刀菌和禾谷鐮刀菌引起的根腐病防治效果較差。

2.3特基拉芽孢桿菌KC 121對玉米的促生效果

2.3.1KC 121發(fā)酵液促玉米種子萌發(fā)的作用利用發(fā)酵液處理玉米種子，自第2 d起，稀釋1×102倍～1×106倍的發(fā)酵濾液處理組的主根長和芽長就始終優(yōu)于對照（圖5）。當(dāng)培養(yǎng)至5 d時，稀釋1×103倍的發(fā)酵濾液處理組的促生效果最好，其主根長已達10.46 cm（圖5A），較對照提高了61%；芽長達7.24 cm，較對照提高了162%（圖5B）。因此，發(fā)酵濾液稀釋1×103倍是促進種子根和芽生長的最佳處理（圖6）。

2.3.2KC 121發(fā)酵液原液促玉米植株生長的作用培養(yǎng)24 d時，發(fā)酵液原液對玉米幼苗的促生作用最為明顯（圖7）。培養(yǎng)8 d和16 d時KC 121發(fā)酵液原液處理的株高與對照有顯著差異，在第16 d時株高較對照提高了0.38倍（圖8A），但對莖粗影響不大（圖8B）。種植24 d后進行干質(zhì)量和鮮質(zhì)量測量，經(jīng)過特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液原液灌根的玉米植株地上部分鮮質(zhì)量為5.7 g，較對照提高了90%，而干質(zhì)量則較對照提高了130%；KC 121對地下部分干質(zhì)量和鮮質(zhì)量的影響不大。

2.4特基拉芽孢桿菌KC 121的促生功能測定

前面的研究結(jié)果顯示，特基拉芽孢桿菌KC 121可以促進玉米種子萌發(fā)時的芽長和根長，同時也可以促進玉米幼苗生長時的地上部分干質(zhì)量和鮮質(zhì)量，但其機理尚不明確。因此，本研究初步探究了其促生機理。

2.4.1菌株解磷、鉀及固氮功能通過對特基拉芽孢桿菌KC 121固氮、溶磷、溶鉀能力的測定發(fā)現(xiàn)，該菌株在蒙金娜無機磷培養(yǎng)基平板及鉀長石培養(yǎng)基平板上均無透明圈的產(chǎn)生，且在Ashby無氮培養(yǎng)基平板上不能生長。因此，該菌株不具有固氮、溶磷、溶鉀的功能。

2.4.2分泌IAA能力經(jīng)檢測，特基拉芽孢桿菌KC 121具有產(chǎn)IAA的能力且質(zhì)量濃度達6.19 ng/ml。

2.4.3特基拉芽孢桿菌KC 121水解淀粉能力淀粉水解試驗結(jié)果表明，加碘液后在淀粉水解瓊脂培養(yǎng)基上的菌落周圍出現(xiàn)了透明圈，表明該菌株可分泌淀粉酶，具有較強的水解淀粉能力。

2.4.4玉米幼苗葉綠素含量經(jīng)特基拉芽孢桿菌KC 121稀釋1×103倍的發(fā)酵濾液處理后玉米幼苗中葉綠素a含量、葉綠素b含量及葉綠素a+b含量較對照均明顯增加。其中，稀釋1×103倍的發(fā)酵濾液處理組葉綠素a含量為2.41 mg/L，較對照（0.87 mg/L）增加了117.01%，葉綠素b的含量為1.08 mg/L，較對照（0.72 mg/L）則增加了50.00%，總?cè)~綠素含量為3.49 mg/L，較對照（1.59 mg/L）增加了119.50%。

3討論與結(jié)論

本研究探究了特基拉芽孢桿菌KC 121的防病促生作用及其機理。防病試驗結(jié)果表明，菌株KC 121發(fā)酵液灌根能減輕由腐皮鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌引起的玉米根腐病，這為玉米鐮刀根腐病的生物防治提供了微生物資源。促生試驗結(jié)果表明適宜含量的菌株KC 121發(fā)酵液對玉米種子萌發(fā)及幼苗生長均具有促進作用，可用于促進玉米生長菌劑的開發(fā)。對特基拉芽孢桿菌KC 121的防病促生機理的探究，為后期開發(fā)防治玉米鐮刀根腐病及促生菌劑的研究提供了參考。

特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）是在2006年由Gatson 等[27]從墨西哥一座墓穴中首次分離得到的菌株。隨后，研究人員陸續(xù)報道了該菌株的抑菌活性，如從健康水稻植株中分離出來的特基拉芽孢桿菌對多種植物病原真菌和卵菌具有抑制作用[28]，從土樣中分離出來的特基拉芽孢桿菌對立枯絲核菌具有拮抗作用[29]等。目前有關(guān)特基拉芽孢桿菌生物防治作用的研究主要集中于防治馬鈴薯黑痣病、西瓜枯萎病、枸杞根腐病等[29-31]，對特基拉芽孢桿菌防治玉米鐮刀根腐病的報道較少。本研究利用盆栽試驗進一步探究了菌株KC 121對4種玉米鐮刀菌病害的防治效果。盆栽試驗結(jié)果表明，菌株KC 121發(fā)酵液灌根能減輕由腐皮鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌引起的玉米根腐病，防治效果分別達66.67%和76.00%；但對禾谷鐮刀菌及尖孢鐮刀菌的盆栽防治效果只有4.64%和3.43%，因此特基拉芽孢桿菌KC 121僅適合防治由腐皮鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌引起的玉米根腐病。

一些研究結(jié)果表明，特基拉芽孢桿菌可以使尖孢鐮刀菌的菌絲體發(fā)生皺縮、彎折[32]。本研究通過對特基拉芽孢桿菌KC 121抑菌機理的初探發(fā)現(xiàn)，菌株KC 121發(fā)酵液可以使4種病原菌菌絲皺縮和凹陷，使腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌以及禾谷鐮刀菌菌絲體發(fā)生黏連，通過使腐皮鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌的菌絲體彎折明顯且易斷裂等方式來抑制菌絲體的生長。孢子是真菌的主要繁殖器官。本研究發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌KC 121發(fā)酵液可以降低腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌的產(chǎn)孢量，還能使病原菌孢子萌發(fā)的芽管變得膨大，以此來延緩或抑制病原菌孢子的萌發(fā)。特基拉芽孢桿菌KC 121可以通過降低鐮刀菌的產(chǎn)孢量及延緩或抑制孢子萌發(fā)來抑制鐮刀菌病害的傳播。綜上，特基拉芽孢桿菌KC 121通過干擾、抑制菌絲生長，降低病原菌產(chǎn)孢量、抑制孢子萌發(fā)等方式來實現(xiàn)對病原菌的防治作用。

在進行特基拉芽孢桿菌KC 121對玉米根腐病防病效果試驗的過程中發(fā)現(xiàn)該菌株對玉米生長具有促進作用，因此對該菌株的促生效果和促生機制進行了初步探究。結(jié)果顯示，稀釋1×103倍的發(fā)酵濾液浸種5 d可以使玉米種子萌發(fā)時的主根長和芽長增加，發(fā)酵液原液灌根24 d使幼苗地上部分的干、鮮質(zhì)量增加。已有研究結(jié)果表明，從特基拉芽孢桿菌中提取出的生物表面活性劑（Biosurfactants，BS）能夠促進玉米種子萌發(fā)及幼苗生長[33]，而本研究中特基拉芽孢桿菌的發(fā)酵液原液即可促進玉米種子萌發(fā)及幼苗成長，不僅使得操作更加簡便，還降低了生產(chǎn)成本。在玉米種子萌發(fā)的過程中，胚乳中的淀粉被水解后為種子的萌發(fā)提供營養(yǎng)和能量。本研究對菌株KC 121促生機制的探究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較強的水解淀粉的能力，可加快玉米種子萌發(fā)的能量供應(yīng)，從而促進種子萌發(fā)。菌株KC 121還能通過產(chǎn)生6.19 ng/ml的IAA以及增加玉米幼苗的葉綠素含量來促進玉米幼苗地上部分的生長。

生防菌能夠防治植物病害的原因一方面是生防菌對病原菌具有抑菌活性，另一方面能通過固氮、溶磷，產(chǎn)生生長素等方式促進植物健康生長從而提高植物的抗逆性[34-40]。本研究對特基拉芽孢桿菌KC 121防治玉米鐮刀根腐菌以及促進玉米生長的機理探究結(jié)果表明，該菌株一方面產(chǎn)生了抑制玉米鐮刀根腐病的活性物質(zhì)，同時又通過產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)IAA以及提高幼苗葉綠素含量的方式促進玉米健康生長和抗病性的產(chǎn)生。本研究結(jié)果為鐮刀菌引起的植物真菌病害的生物防治以及生物防治菌劑的開發(fā)提供了參考。然而，我們對于抑制鐮刀菌的活性物質(zhì)尚不清楚，今后仍需進一步加強對特基拉芽孢桿菌KC 121抑菌活性物質(zhì)的詳細(xì)研究，以助力防治鐮刀菌病害生防菌劑的研發(fā)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）