摘要：自毒作用是植物連作障礙形成的主要原因之一，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)和糧食生產(chǎn)。前期研究結(jié)果表明，土壤微生物多樣性下降、土傳病害加重是枸杞園連作障礙形成的重要原因，但枸杞殘?bào)w的自毒作用及其物質(zhì)基礎(chǔ)目前仍不明確。為探討自毒物質(zhì)的主要來(lái)源，本研究對(duì)比分析了枸杞（Lycium barbarum L.）葉、莖、根等組織浸提液對(duì)枸杞幼苗生長(zhǎng)的影響。濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，葉片浸提液的抑制效應(yīng)高于根、老根皮及莖浸提液。向無(wú)枸杞種植歷史的農(nóng)田土壤中添加枸杞葉片干粉能夠顯著抑制枸杞幼苗生長(zhǎng)及葉片光合作用，證實(shí)了枸杞葉片具有自毒作用。聯(lián)合UPLC-QTOF-MS和GC-TOF-MS技術(shù)對(duì)生長(zhǎng)季末期枸杞葉片進(jìn)行代謝組分析，共鑒定出有機(jī)酸112種、醇類(lèi)41種、氨基酸37種、醛酮類(lèi)28種和糖類(lèi)48種。對(duì)其中24種有機(jī)酸及衍生物的分析發(fā)現(xiàn)，20種有機(jī)物能夠不同程度抑制枸杞幼苗初生根生長(zhǎng)。其中水楊酸、鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸和香豆素在濃度低至10 μmol/L時(shí)仍具顯著抑制效應(yīng)。UPLC結(jié)果進(jìn)一步顯示，長(zhǎng)期連作導(dǎo)致枸杞園土壤香豆素、水楊酸、苯甲酸、阿魏酸和香豆酸積累。此外，土壤總酚酸含量也隨種植年限增加顯著增加。這些結(jié)果表明土壤中枸杞葉片酚酸能夠在長(zhǎng)期連作下積累并誘發(fā)自毒作用，這為進(jìn)一步探索枸杞連作障礙形成機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：枸杞；連作障礙；自毒物質(zhì)；葉片；酚酸

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.19文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）02-0213-10

Analyzing the autotoxicity of phenolic acids from Lycium barbarum L. leaves

SONG Yan-fang1，2，PENG Tong1，2，MA Shao-lan3，MA Cai-xia4，GAO Na1，2，LI Kai-le1，2，ZHANG Chuan-ji1，2，PU Mei-yun1，2，NA Xiao-fan1，2

（1.School of Life Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China；2.Key Laboratory of Cell Activities and Stress Adaptations， Ministry of Education， Lanzhou 730000， China；3.Pengyang No.1 Middle School， Guyuan 756500， China；4.School of Life Sciences， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract：Autotoxicity is one of the main reasons for the formation of continuous cropping barriers， which seriously affects plant growth and food production. The results of previous studies showed that the decrease of soil microbial diversity and the aggravation of soil-borne diseases were the important reasons for the formation of continuous cropping obstacles. But the self-toxic effects and the material basis of residues of Lycium barbarum were still unclear. In order to study the main sources of autotoxins， the effects of leaf， stem and root extracts of Lycium barbarum L. on the growth of Lycium barbarum L. seedlings were studied. The results of concentration gradient test showed that the inhibition effect of leaf extract was higher than that of root， old root bark and stem extract. The growth and photosynthesis of Lycium barbarum L. seedlings were significantly inhibited by adding Lycium barbarum L. leaf powder to the farmland soil without Lycium barbarum L. planting history. It was proved that the leaves of Lycium barbarum L. had self-toxicity. Combined with UPLC-QTOF-MS and GC-TOF-MS for metabolome analysis of Lycium barbarum L. leaves at the end of growing season， a total of 112 organic acids， 41 alcohols， 37 amino acids， 28 aldehydes and ketones and 48 sugars were identified. Analysis of 24 kinds of organic acids and derivatives showed that 20 kinds of organic compounds could inhibit the primary root growth of Lycium barbarum L. seedlings. Salicylic acid， phthalic acid， p-hydroxybenzoic acid， and coumarin still showed significant inhibitory effects at concentrations as low as 10 μmol/L. UPLC results further showed that long-term continuous cropping led to the accumulation of coumarin， salicylic acid， benzoic acid， ferulic acid and coumaric acid. In addition， the content of total phenolic acids in soil increased significantly with the increase of planting years. These results indicated that phenolic acids could accumulate and induce autotoxicity in the leaves of Lycium barbarum L. under long-term continuous cropping， which provided a basis for further research on the mechanism of continuous cropping failure.

Key words：Lycium barbarum L.；continuous cropping obstacle；autotoxins；leaf；phenolic acid

寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）隸屬茄科（Solanaceae）、枸杞屬（Lycium），兼具經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，已成為中國(guó)西北干旱、半干旱生態(tài)脆弱區(qū)農(nóng)民經(jīng)濟(jì)增收和生態(tài)保護(hù)的特色產(chǎn)業(yè)之一[1]。然而，在集約化、規(guī)?；a(chǎn)的同時(shí)，長(zhǎng)期連作導(dǎo)致枸杞產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降以及病蟲(chóng)害加重等連作障礙[2]，嚴(yán)重阻礙了區(qū)域農(nóng)村經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展。

目前認(rèn)為，土壤理化性質(zhì)變異、土傳病害加重和自毒作用是植物連作障礙形成的三大主要原因[3]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期種植枸杞會(huì)導(dǎo)致土壤氮、磷元素大量積累，全鹽含量及電導(dǎo)率升高，誘發(fā)土壤pH值下降和次生鹽堿化[4]。除土壤微生物α多樣性降低外，土壤理化性質(zhì)改變驅(qū)動(dòng)了枸杞園土壤及枸杞根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化[5]，導(dǎo)致鐮刀菌屬、鏈格孢屬等病原真菌在枸杞根際和非根際土壤大量富集[6-7]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期連作導(dǎo)致的土壤理化性質(zhì)變化迫使枸杞與其根際土壤細(xì)菌群落之間的互作減弱，即解偶聯(lián)[6]。由于根際細(xì)菌群落在植物生長(zhǎng)和生防過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]，因此，枸杞與根際細(xì)菌的解偶聯(lián)可能影響了細(xì)菌群落的正常功能，造成枸杞生長(zhǎng)勢(shì)減弱和土傳病害增加[6]。此外，對(duì)土壤線蟲(chóng)群落的分析結(jié)果也表明，連作超過(guò)9 年會(huì)引起枸杞園土壤線蟲(chóng)群落多樣性下降和致病性線蟲(chóng)群落豐度增加等負(fù)面效應(yīng)[9]。雖然前人對(duì)枸杞連作障礙的土壤微生物生態(tài)學(xué)機(jī)制做了詳盡研究，但在連作過(guò)程中單一型碳源（如枸杞凋落物和根系分泌物）的輸入影響枸杞生長(zhǎng)的作用機(jī)制尚不明確。

自毒作用是指植物通過(guò)揮發(fā)、分泌或凋落物的形式向環(huán)境釋放有機(jī)物，抑制自身或同類(lèi)植物種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)的現(xiàn)象，廣泛存在于多年生植物中[10]。目前，已從植物組織和根系分泌物中鑒定出如酚酸、長(zhǎng)鏈脂肪酸、萜類(lèi)和生物堿等多種自毒物質(zhì)[3]。其中，酚酸是植物中最為常見(jiàn)的一類(lèi)自毒物質(zhì)，其作用已在多種植物中被證實(shí)。例如，趙曉玲等[11]從枸杞根系分泌物中鑒定出阿魏酸、咖啡酸和肉桂酸等多種酚酸。利用定量構(gòu)效關(guān)系法的分析結(jié)果表明，這些酚酸均能抑制枸杞種子萌發(fā)，推測(cè)這些物質(zhì)可能介導(dǎo)了枸杞的自毒作用[12]。在對(duì)枸杞葉片抗氧化機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，枸杞葉片富含山柰酚、綠原酸、蘆丁和龍膽酸等活性物質(zhì)[13]，這些有機(jī)物能夠抑制蘋(píng)果、苜蓿和玉米等植物生長(zhǎng)[14-16]，推測(cè)葉片可能具有抑制枸杞生長(zhǎng)的自毒效應(yīng)。然而，目前有關(guān)枸杞自毒作用、自毒物質(zhì)的主要組織來(lái)源及其在連作土壤中的積累情況尚未見(jiàn)報(bào)道。為探究這些問(wèn)題，本研究通過(guò)對(duì)比不同枸杞組織浸提液抑制枸杞幼苗生長(zhǎng)的效果，結(jié)合UPLC-QTOF-MS、GC-TOF-MS和UPLC等方法分析了生長(zhǎng)季末期枸杞葉片有機(jī)物組成及其所含酚酸在枸杞園土壤中的積累情況，初步揭示枸杞葉片自毒作用的主要酚酸種類(lèi)，為進(jìn)一步理解枸杞連作障礙形成機(jī)理、探索枸杞可持續(xù)種植模式提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1枸杞組織浸提液制備及自毒作用強(qiáng)度分析

為分析枸杞自毒物質(zhì)的主要來(lái)源，于2016年10月中旬在銀川市南梁農(nóng)場(chǎng)采集枸杞葉片、根（直徑＜2 mm根系）、莖段和老根皮（直徑＞10 mm根的皮）。組織材料經(jīng)陰干、粉碎后各取500 g，加入80%乙醇，于室溫、避光條件下浸提7 d。浸提液過(guò)濾后，低溫蒸干制成浸膏。浸膏用少量Dimethyl sulfoxide（DMSO）溶解，取一定量加至1/4 Hoagland培養(yǎng)液，配置成質(zhì)量濃度為1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的水培液；向1/4 Hoagland培養(yǎng)液中加入對(duì)應(yīng)量DMSO作為對(duì)照培養(yǎng)液。選取萌發(fā)程度一致的枸杞種子進(jìn)行水培處理，于25 ℃、16 h/8 h光暗周期下培養(yǎng)7 d后，測(cè)量幼苗初生根長(zhǎng)度。

1.2枸杞落葉對(duì)枸杞幼苗生長(zhǎng)和光合作用的影響分析

為驗(yàn)證枸杞葉片的自毒效應(yīng)，首先分析了農(nóng)田表層土壤（無(wú)枸杞種植歷史）中添加葉片對(duì)枸杞幼苗生長(zhǎng)的影響。土壤樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后，陰干、過(guò)2 mm孔徑的網(wǎng)篩，添加10%洗凈河沙并充分混勻后，分別加入0 mg/g、2 mg/g、4 mg/g、8 mg/g和10 mg/g枸杞葉片干粉（生長(zhǎng)季末期葉片，陰干后粉碎），充分混勻后裝入容積為1 L的花盆。加去離子水至40%田間最大持水量，每盆種植萌發(fā)一致的枸杞幼苗9株。于25 ℃、16 h/8 h光暗周期下培養(yǎng)，期間補(bǔ)充去離子水。培養(yǎng)30 d后測(cè)定幼苗地上部鮮質(zhì)量、根系長(zhǎng)度和葉片光合作用強(qiáng)度。枸杞葉片光合作用強(qiáng)度利用LI6400便攜式光合儀進(jìn)行測(cè)定。光合儀參數(shù)設(shè)置為樣本室內(nèi)氣流速率500 μmol/s，樣品室和參比室CO2濃度均為400 μmol/mol，室內(nèi)光照度為800 μmol/（m·s），葉面積為6 cm2。

1.3不同連作年限土壤中枸杞落葉的自毒效應(yīng)分析

為分析葉片在不同連作年限枸杞園土壤中的自毒效應(yīng)，于寧夏銀川市南梁農(nóng)場(chǎng)和石嘴山市惠農(nóng)區(qū)分別采集連作5年、10年、20年枸杞地表層（0～20 cm）土壤，寧夏銀川市南梁農(nóng)場(chǎng)枸杞連作5年、10年、20年土壤分別記為N5、N10、N20，石嘴山市惠農(nóng)區(qū)連作5年、10年、20年土壤分別記為H5、H10、H20。土壤樣本的理化因子及微生物群落信息見(jiàn)前期研究結(jié)果[7]。土壤樣本帶回實(shí)驗(yàn)室后去除植物殘?bào)w，過(guò)2 mm孔徑的網(wǎng)篩并陰干，加入10%無(wú)菌河沙和10 mg/g枸杞葉片干粉（生長(zhǎng)季末期葉片，陰干后粉碎），充分混勻、裝盆。添加無(wú)菌去離子水至40%田間最大持水量，其中一半土壤種植枸杞幼苗。同時(shí)，為進(jìn)一步探索降解過(guò)程對(duì)葉片自毒作用的影響，將另一半土壤置于25 ℃黑暗中培養(yǎng)，經(jīng)60 d降解后種植枸杞幼苗。幼苗培養(yǎng)條件同材料與方法1.2。培養(yǎng)30 d后測(cè)定幼苗地上部鮮質(zhì)量。

1.4枸杞葉片代謝組分析

采集生長(zhǎng)季末期的枸杞葉片，凍干后粉碎，用GC-TOF-MS和UPLC-QTOF-MS分析。葉片干粉加入適量提取劑（甲醇、乙腈、水體積比為2∶2∶1），于研磨儀振蕩萃取10 min，加入20 μl核糖醇。溶液經(jīng)4 ℃、13 000 r/min離心15 min，將所得上清液真空干燥。干燥有機(jī)物經(jīng)衍生化（BSTFA）后，利用Agilent 7890氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)[17]。進(jìn)樣量1 μl，進(jìn)樣溫度280 ℃；柱溫50 ℃起始，10 ℃/min升至310 ℃，保持8 min；流速為1.0 ml/min。數(shù)據(jù)分析使用Chroma TOF 4.3X軟件和LECO Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)完成。

UPLC-QTOF-MS分析采用安捷倫1290超高效液相串聯(lián)AB Sciex Triple TOF6600高分辨質(zhì)譜儀系統(tǒng)完成。取葉片干粉，加入提取劑（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1，體積比），再加入L-2-氯苯氨酸，渦旋混勻后冰水浴超聲振蕩10 min，零下20 ℃靜置1 h后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；上清液上機(jī)檢測(cè)。流動(dòng)A相為醋酸銨（25 mmol/L）和氨水（25 mmol/L），B相為乙腈，進(jìn)樣量2 μl。質(zhì)譜條件參照Ivanisevic的方法[18]。

1.5枸杞葉片不同酚酸自毒效應(yīng)評(píng)價(jià)

酚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于少量DMSO后，用去離子水配成100 mmol/L母液。后用1/4 Hoagland稀釋成1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L和1 000 μmol/L工作液，用于水培處理萌發(fā)一致的枸杞幼苗。幼苗轉(zhuǎn)至25 ℃、16 h/8 h光暗周期下培養(yǎng)7 d后測(cè)定初生根長(zhǎng)度。

1.6土壤總酚酸提取及酚酸含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取25 g低溫凍干土樣于三角瓶中，加入50 ml 1 mol/L NaOH溶液，于恒溫?fù)u床180 r/min振蕩過(guò)夜。次日超聲振蕩30 min，10 000 r/min離心10 min，上清液用HCl酸化至pH=2.5。靜置2 h后10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜后，直接用于UPLC分析和總酚酸含量測(cè)定。UPLC上機(jī)條件參照Li等[19]的方法進(jìn)行；總酚酸含量利用Folin-Ciocalteau 方法[20]測(cè)定。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

單因素方差分析采用SPSS 22.0完成，數(shù)據(jù)的正態(tài)性采用Shapro-Wilk檢驗(yàn)。繪圖由Prism 9.0軟件完成。

2結(jié)果與分析

2.1不同枸杞組織浸提液自毒作用強(qiáng)度

利用不同濃度枸杞葉片、根、莖和老根皮浸提液水培枸杞幼苗。與對(duì)照相比，質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)所有組織浸提液均顯著抑制枸杞幼苗初生根根長(zhǎng)（P＜0.05）（圖1）。隨組織浸提液質(zhì)量濃度降低，50 mg/L莖浸提液開(kāi)始失去抑制作用，10 mg/L老根皮和20 mg/L根浸提液開(kāi)始失去抑制作用（圖1）。與對(duì)照相比，10 mg/L枸杞葉片浸提液仍能夠顯著抑制枸杞幼苗初生根根長(zhǎng)，其抑制率達(dá)23.4%（P＜0.05）（圖1A）。結(jié)果表明，枸杞不同組織均有一定自毒效應(yīng)，但葉片的自毒作用最強(qiáng)。

為驗(yàn)證枸杞葉片的自毒效應(yīng)，向無(wú)枸杞種植歷史的大田土壤中添加不同含量枸杞葉片干粉，通過(guò)盆栽試驗(yàn)分析枸杞葉片對(duì)枸杞幼苗生長(zhǎng)和光合作用的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，添加4 mg/g枸杞葉片干粉顯著抑制幼苗初生根根長(zhǎng)和地上部鮮質(zhì)量（P＜0.05）（圖2A、圖2B）；當(dāng)枸杞葉片干粉含量達(dá)到8 mg/g時(shí)，枸杞幼苗地上部鮮質(zhì)量?jī)H為對(duì)照的25.0%（圖2B）；10 mg/g枸杞葉片干粉處理的幼苗無(wú)法存活（圖2A、圖2B）。對(duì)光合作用分析發(fā)現(xiàn)，4 mg/g枸杞葉片干粉顯著抑制枸杞幼苗光合作用，導(dǎo)致葉片光合效率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率顯著降低（P＜0.05）（圖2）。

2.2枸杞不同連作年限樣地中枸杞葉片的自毒效應(yīng)

對(duì)枸杞不同種植年限土壤的研究發(fā)現(xiàn)，除H5外，連作土壤添加枸杞葉片干粉后，對(duì)枸杞幼苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，這種抑制作用在H10、N10中最為明顯（P＜0.01）（圖3A）。添加枸杞葉片干粉后土壤經(jīng)60 d室內(nèi)培育，對(duì)枸杞幼苗生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)減弱甚至消失，僅在N20土壤中，與對(duì)照相比，僅添加枸杞葉片干粉土壤中生長(zhǎng)的枸杞幼苗地上部鮮質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），存在抑制效應(yīng)（圖3B）。這些結(jié)果表明，枸杞落葉誘發(fā)的自毒作用可以不同程度加重其連作障礙，且這種抑制效應(yīng)經(jīng)一段時(shí)間降解后可以得到緩解。

2.3枸杞葉片代謝組分析

為解析枸杞葉片中的主要自毒物質(zhì)成分，聯(lián)合超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）和氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC-TOF-MS）技術(shù)分析了生長(zhǎng)季末期葉片的有機(jī)物組成。兩種方法共檢出有機(jī)物646種，其中有機(jī)酸112種、醇類(lèi)41種、氨基酸37種、醛酮類(lèi)28種、糖類(lèi)48種、其他物質(zhì)108種，未知物質(zhì)272種，表1列出部分主要有機(jī)酸。

對(duì)所測(cè)樣本的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，共有64種有機(jī)酸在超過(guò)2/3的樣本中被同時(shí)檢出（n=6），其中酚酸類(lèi)物質(zhì)共34種（表2）?；诖x組結(jié)果中各有機(jī)酸的檢出頻率和豐度以及前人關(guān)于有機(jī)酸自毒效應(yīng)的研究結(jié)果，選取了其中24種有機(jī)酸及其衍生物，分析了這些有機(jī)物對(duì)枸杞幼苗初生根根長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在1 000 μmol/L處理濃度下，20種有機(jī)酸存在顯著抑制效應(yīng)（P＜0.05），相較于對(duì)照，水楊酸、4-羥基苯乙酸、香豆酸、肉桂酸、阿魏酸、高藜蘆酸及苯甲酸對(duì)幼苗初生根生長(zhǎng)的抑制率大于50%（表3）。隨處理濃度降低，100 μmol/L水楊酸、4-羥基苯乙酸、龍膽酸、綠原酸、香豆酸、高藜蘆酸、苯甲酸和香豆素等對(duì)初生根生長(zhǎng)具有顯著抑制效應(yīng)，而水楊酸、鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸和香豆素在濃度低至10 μmol/L時(shí)仍能夠顯著抑制幼苗初生根生長(zhǎng)（P＜0.05）（表3）。

2.4不同連作年限枸杞園土壤酚酸含量變化

對(duì)不同連作年限枸杞園表層（0～20.0 cm）及亞表層（20.1～40.0 cm）土壤總酚酸的分析發(fā)現(xiàn)，表層土壤總酚酸含量隨連作年限增加顯著增加（圖4A）。亞表層土壤的總酚酸含量則成單峰模型，其增幅在連作9年之后逐漸趨于平穩(wěn)（圖4B）。UPLC結(jié)果表明，與連作1年相比，南梁地區(qū)連作20年枸杞園表層土壤（N20）中阿魏酸、香豆素、苯甲酸和水楊酸（圖4C）以及亞表層土壤中苯甲酸和水楊酸（圖4D）的含量均顯著增加（Plt;0.05）。而惠農(nóng)地區(qū)連作20年土壤（H20）表層和亞表層土壤中阿魏酸、香豆酸和香豆素含量較該地區(qū)連作5年土壤（H5）顯著增加（Plt;0.05），且水楊酸在亞表層土壤積累（圖4D）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證多種低濃度酚酸在積累時(shí)是否存在協(xié)同效應(yīng)，利用香豆素、水楊酸、苯甲酸、阿魏酸和香豆酸的混合液（每種濃度為1 μmol/L）處理枸杞幼苗。結(jié)果表明，酚酸混合液處理的幼苗初生根根長(zhǎng)僅為對(duì)照的76.8%。由于這些酚酸在1 μmol/L下均不影響枸杞幼苗根的生長(zhǎng)（表3），因此這一結(jié)果說(shuō)明供試酚酸的抑制效應(yīng)具有一定加成作用，在較低濃度下能夠進(jìn)一步聯(lián)合抑制枸杞幼苗根的生長(zhǎng)和發(fā)育，暗示長(zhǎng)期連作導(dǎo)致的酚酸積累，即使在低濃度時(shí)可能仍存在自毒作用效應(yīng)。

3討論

3.1葉片是枸杞自毒物質(zhì)的主要來(lái)源

對(duì)不同枸杞組織浸提液的分析結(jié)果表明，枸杞葉、根、莖和老根皮均具有一定的自毒效應(yīng)，但葉片浸提液的抑制作用最為明顯，說(shuō)明落葉是誘導(dǎo)枸杞自毒作用發(fā)生的主要組織來(lái)源。這一發(fā)現(xiàn)與毛竹等植物中的研究結(jié)論類(lèi)似[21]。對(duì)田間條件下枸杞落葉量的測(cè)定結(jié)果表明，20年樹(shù)齡枸杞樹(shù)落葉干質(zhì)量約為193 g/m2（SD=37.3，n=10），相當(dāng)于向表層土壤中添加約5 mg/g的風(fēng)干葉片。結(jié)合盆栽試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，大樹(shù)齡枸杞落葉量能夠抑制自身根系生長(zhǎng)和發(fā)育。由于枸杞落葉期與冬灌時(shí)間較近，在土壤封凍之前，落葉中的有機(jī)物借助灌溉水釋放至土壤，進(jìn)而影響枸杞生長(zhǎng)。這一發(fā)現(xiàn)與在田間調(diào)查時(shí)部分杞農(nóng)反應(yīng)的枸杞園東南角枸杞長(zhǎng)勢(shì)較差的現(xiàn)象一致。由于中國(guó)西北地區(qū)冬季多西北風(fēng)，落葉在枸杞園東南部坑洼區(qū)積累并可能誘發(fā)了自毒作用。

3.2酚酸積累與枸杞連作障礙形成

室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，在土壤中施入枸杞葉片粉末能夠顯著抑制枸杞幼苗的生長(zhǎng)和光合作用。鑒于酚酸類(lèi)有機(jī)物種類(lèi)超過(guò)葉片中檢出有機(jī)酸種類(lèi)的30.4%，且其中4-羥基苯乙酸、香豆酸、對(duì)羥基苯甲酸、2，5-二羥基苯甲酸、香草酸、肉桂酸、高藜蘆酸、水楊酸、苯甲酸和阿魏酸等已被證實(shí)具有自毒效應(yīng)[3]，能夠通過(guò)誘發(fā)植物細(xì)胞氧化脅迫、抑制光合作用等影響不同植物生長(zhǎng)[22]。由此推測(cè)酚酸類(lèi)物質(zhì)可能在枸杞葉片自毒作用及枸杞連作障礙形成中發(fā)揮著重要作用，在酚酸抑制效應(yīng)、土壤總酚酸及酚酸含量測(cè)定等試驗(yàn)中得到了證實(shí)。

隨種植年限增長(zhǎng)，枸杞園土壤中水楊酸、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸和香豆素等酚酸含量均有積累趨勢(shì)。UPLC結(jié)果表明，水楊酸在連作枸杞地土壤中積累濃度較低，而香豆素或香豆酸的濃度則相對(duì)較高。其中，香豆酸在石嘴山市惠農(nóng)區(qū)連作20年枸杞土壤（H20）地表層和亞表層中的含量分別高達(dá)94.9 mg/g和31.0 mg/g（圖4）。結(jié)合水楊酸的有效抑制濃度明顯低于香豆素和香豆酸，推測(cè)這兩類(lèi)有機(jī)物在枸杞葉片自毒作用形成中可能扮演了不同的角色，即水楊酸等在葉片落入土壤后立即產(chǎn)生強(qiáng)烈的自毒效應(yīng)，而香豆素和香豆酸則在枸杞葉片自毒效應(yīng)甚至連作障礙中產(chǎn)生長(zhǎng)期效應(yīng)，但這一假設(shè)仍需通過(guò)原位土壤試驗(yàn)進(jìn)行分析和驗(yàn)證。

除直接抑制枸杞生長(zhǎng)外，枸杞葉片中的酚酸在進(jìn)入土壤后仍可能通過(guò)改變微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，間接影響枸杞生長(zhǎng)。例如，香豆素可以作為信號(hào)分子雙向調(diào)控植物-微生物互作，驅(qū)動(dòng)植物根系微生物的組裝[23-24]；而水楊酸、苯甲酸和肉桂酸等酚酸則被證實(shí)具有激活鐮刀菌屬真菌增殖及致病性等功能[25-26]。在長(zhǎng)期連作條件下，落葉等凋落物不僅作為輸入性碳源直接驅(qū)動(dòng)土壤微生物的群落組成，其所含酚酸等活性物質(zhì)也可通過(guò)調(diào)節(jié)特殊微生物群落功能或活性，改變枸杞-土壤微生物互作關(guān)系誘發(fā)連作障礙。在未來(lái)，結(jié)合葉片原位降解、微生物分離與功能分析等試驗(yàn)，闡釋枸杞葉片及其所含酚酸與枸杞園土壤微生物群落功能間的關(guān)系，對(duì)于進(jìn)一步揭示枸杞連作障礙機(jī)制尤為重要。

3.3長(zhǎng)期連作可能影響枸杞園土壤對(duì)凋落物的降解能力

經(jīng)60 d降解處理后，枸杞葉片的自毒作用雖然在連作年限相對(duì)較短的土壤中有所減弱，但其抑制效應(yīng)在連作20年土壤中仍然存在，說(shuō)明當(dāng)連作年限達(dá)到一定程度，部分枸杞園土壤微生物對(duì)葉片的降解能力可能受到干擾。因此，長(zhǎng)期連作不僅導(dǎo)致自毒物質(zhì)積累，而且可能延長(zhǎng)了當(dāng)季葉片凋落物的自毒效應(yīng)周期。前期研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期連作會(huì)導(dǎo)致枸杞園土壤板結(jié)、透氣性變差、次生鹽堿化[27]、土壤微生物群落多樣性喪失[7]和代謝功能改變[28]。在連作條件下，土壤生物和非生物因素的變化可能對(duì)連作土壤中枸杞凋落物的降解造成負(fù)面效應(yīng)，導(dǎo)致自毒物質(zhì)積累并誘發(fā)自毒作用。由于去除生長(zhǎng)季末期枸杞落葉需要大型設(shè)備并導(dǎo)致種植成本增加，維持或提高連作條件下枸杞園土壤對(duì)葉片等凋落物的降解能力，將成為減輕枸杞自毒作用甚至連作障礙的有效途徑之一。

4結(jié)論

綜上，本研究的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)葉片具有明顯的自毒效應(yīng)，能夠顯著抑制枸杞幼苗生長(zhǎng)和光合作用。葉片中的香豆素、水楊酸、苯甲酸、阿魏酸和香豆酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)自毒效應(yīng)，能夠在長(zhǎng)期連作下積累，可能在枸杞連作障礙形成中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）