梁蓓蓓, 李惠蓉, 徐 梁, 方 晶, 林建國, 邱 玲*

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,浙江 溫州 325035; 2. 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所 國家衛(wèi)生健康委員會核醫(yī)學(xué)重點實驗室 江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室,江蘇 無錫 214063)

近年來,腫瘤免疫治療取得了重大突破,已有多種靶向程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(Programmed cell death 1, PD-1)及其配體-1(Programmed cell death ligand 1, PD-L1)的抗體藥物在國內(nèi)外批準(zhǔn)上市并取得顯著的療效,如Nivolumab、 Pembrolizumab、 Cemiplimab、 Durvalumab和Atezolizumab等[1-3]。然而,PD-1/PD-L1抑制劑在臨床應(yīng)用中存在一定的局限性,未經(jīng)篩選的患者中僅有10%～30%可以從中獲益,但在PD-L1陽性患者中的響應(yīng)率明顯高于陰性患者[4-6]。因此,準(zhǔn)確篩選能夠從PD-1/PD-L1免疫檢查點阻斷治療中獲益的腫瘤患者具有重要的臨床意義。

目前臨床上主要通過免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IHC)方法檢測腫瘤PD-L1的表達(dá)水平。但免疫組化存在顯著的局限性,只能通過活檢取樣進(jìn)行檢測。由于腫瘤內(nèi)和腫瘤間存在異質(zhì)性,檢測結(jié)果也只能反映取樣部位PD-L1的表達(dá)水平,無法反映患者整體PD-L1的表達(dá)情況[7]。此外,在腫瘤進(jìn)展過程中,PD-L1的表達(dá)情況是動態(tài)變化的,免疫組化難以動態(tài)監(jiān)測免疫治療過程中PD-L1表達(dá)水平的變化情況[8]。正電子發(fā)射斷層掃描(Positron emission tomography, PET)作為一種新型成像技術(shù),具有高靈敏度、高特異性、高安全性、高均勻度和全身顯像等優(yōu)勢,可以無創(chuàng)、動態(tài)、全身地檢測PD-L1在腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)水平[9]。 2015年,百時美施貴寶公司公布了一類聯(lián)苯類的小分子PD-1/PD-L1抑制劑,MIAO等[10]在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上設(shè)計了小分子探針[18F]LN, PET顯像結(jié)果發(fā)現(xiàn),[18F]LN可以區(qū)分不同PD-L1表達(dá)的腫瘤,但在肝臟等正常器官中的攝取較高,導(dǎo)致其顯像效果不佳。LV等[11]在此基礎(chǔ)上設(shè)計了新的PD-L1靶向的小分子探針[18F]LG-1,保留了與PD-L1結(jié)合的母核結(jié)構(gòu),引入[18F]FDG糖基化基團,提高了探針的親水性。PET顯像結(jié)果與[18F]LN相比,[18F]LG-1在非靶器官的攝取降低,獲得了較高對比度的圖像。

考慮到小分子探針具有腫瘤穿透性好、組織攝取快和顯像快等優(yōu)點,而金屬離子螯合劑NOTA具有良好的水溶性,且僅需一步反應(yīng)就可完成放射性標(biāo)記,具有耗時短、操作簡單方便且不需要半制備純化等優(yōu)勢。因此,本研究以聯(lián)苯甲基芳基醚核心結(jié)構(gòu)為靶向基團,在分子結(jié)構(gòu)的溶劑作用區(qū)引入NOTA基團,利用正電子核素68Ga和18F進(jìn)行放射性標(biāo)記,成功獲得2個PET分子探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP,并對其生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Quintix35-1CN型十萬分之一分析電子天平; DF-101Z型油浴鍋; 1525泵型高效液相色譜儀; 2545泵型半制備高效液相色譜儀; Freezone6L型真空冷凍干燥機; H7型回旋加速器; IGG-100型68Ga/68Ge發(fā)生器; 2470Wizard型γ計數(shù)器。

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)購自安耐吉化學(xué)(上海)有限公司。2,2′-(7-(2-((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧乙基)-1,4,7-三氮烷-1,4-二基)二乙酸(NOTA NHS)購自西安齊岳生物科技有限公司。醋酸鈉(分析純)、醋酸(分析純)、氯化鋁(AlCl3,分析純)、碳酸氫鈉(分析純)、正辛醇(分析純)和乙腈(HPLC級)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 前體NOTA-LP的合成

根據(jù)之前報道的方法合成化合物4(LP1)[10-12],稱取化合物L(fēng)P1(10.00 mg, 0.17 mmol)與NOTA NHS(16.00 mg, 0.04 mmol),溶于2 mL DMF中,加入DIPEA調(diào)節(jié)pH至8～9,室溫下反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后,使用半制備高效液相進(jìn)行分離純化,得到白色固體NOTA-LP(圖1, 7.00 mg,產(chǎn)率47.28%);1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ：8.02(s, 1H), 7.88(d,J=7.9 Hz, 1H), 7.85(d,J=7.7 Hz, 1H), 7.64(t,J=7.8 Hz, 1H), 7.56(s, 1H), 7.45(d,J=7.3 Hz, 1H), 7.26(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.20(d,J=5.4 Hz, 1H), 7.19(s, 1H), 6.93(d,J=8.2 Hz, 1H), 6.78(d,J=1.7 Hz, 1H), 6.75(dd,J=8.2 Hz, 1.8 Hz, 1H), 5.35(s, 2H), 5.28(s, 2H), 4.29(s, 4H), 4.08(s, 2H), 3.62(s, 4H), 3.39(s, 6H, overlapped), 2.54(s, 8H, overlapped), 2.50(s, 8H), 2.25(s, 3H);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ：171.73, 165.85, 156.77, 156.74, 142.99, 142.56, 141.73, 138.18, 134.76, 134.33, 134.17, 132.62, 131.92, 131.28, 129.95, 129.87, 129.66, 127.74, 125.56, 122.13, 118.72, 118.42, 117.72, 116.85, 116.04, 111.60, 100.39, 69.76, 69.23, 64.14, 64.12, 54.57, 54.50, 50.44, 49.04, 47.84, 42.12, 15.93; ESI-MSm/z：calcd for C47H53ClN6O9{[M+H]+}881.36, found 881.62。

圖1 前體NOTA-LP的合成路線

1.3 探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP的放射性標(biāo)記

探針[68Ga]NOTA-LP的合成:68GaCl3由68Ge/68Ga發(fā)生器獲得,取1.4 mL68GaCl3溶液(129.5 MBq),加入醋酸鈉溶液(0.25 M)調(diào)節(jié)pH至4.0,加入20 μL前體NOTA-LP(2 μg/μL),振蕩混勻,37 ℃孵育15 min。用Sep-Pak light C18固相萃取柱吸附[68Ga]NOTA-LP,用純水洗滌以去除游離的68Ga3+,用1 mL鹽酸乙醇溶液(10 mM)將探針[68Ga]NOTA-LP從Sep-Pak light C18固相萃取柱上洗脫至裝有20 μL飽和碳酸氫鈉的西林瓶中,即可得到高放射化學(xué)純度的[68Ga]NOTA-LP。

探針[18F]AlF-NOTA-LP的合成:[18F]HF是以[18O]H2O為靶材料,通過18O(p,n)18F反應(yīng)獲得。取6 μL AlCl3溶液(2 mM)、 10 μL醋酸和544 μL乙腈,加入100 μL [18F]靶水(736.3 MBq)和10 μL前體NOTA-LP(2 μg/μL),振蕩混勻,100 ℃反應(yīng)15 min。用Sep-Pak light C18固相萃取柱富集探針[18F]AlF-NOTA-LP,用純水洗去18F離子,用1 mL鹽酸乙醇溶液(10 mM)將產(chǎn)物[18F]AlF-NOTA-LP洗脫至西林瓶中,即可得到高放射化學(xué)純度的[18F]AlF-NOTA-LP。

1.4 體外穩(wěn)定性的測定

將40 μL探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP與360 μL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)或小鼠血清(Serum)混合,在37 ℃下分別孵育1 h、 2 h和4 h,每個時間點孵育結(jié)束后取樣,使用Radio-HPLC對其放射化學(xué)純度進(jìn)行檢測。

1.5 脂水分配系數(shù)的測定

取1μL探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP,分別加入1 mL正辛醇和1 mL去離子水,充分震蕩混勻,高速離心使兩相分離,從兩相各取0.5 mL溶液,使用γ計數(shù)器檢測其放射活度。第1次測試結(jié)束后,補加正辛醇和去離子水各0.5 mL,再次震蕩混勻,重復(fù)上述操作2次。LogP=Log(Co/Cw),其中Co表示探針在正辛醇相的放射活度值,Cw表示探針在水相中的放射活度值。

1.6 細(xì)胞攝取研究

人惡性黑色素瘤細(xì)胞系(A375)和人PD-L1基因轉(zhuǎn)染的高表達(dá)惡性黑色素瘤細(xì)胞系(A375-hPD-L1)均由蘇州智核生物科技有限公司提供,小鼠黑色素瘤細(xì)胞系(B16-F10)和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系(MC38)均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝取實驗。前期研究中已有免疫印跡實驗證實A375-hPD-L1細(xì)胞PD-L1的表達(dá)水平明顯高于A375細(xì)胞[13], B16-F10細(xì)胞和MC38細(xì)胞均為鼠源高表達(dá)PD-L1的細(xì)胞系[14]。細(xì)胞攝取實驗分為A375-hPD-L1陽性組、A375-hPD-L1阻斷組、A375陰性組、B16-F10陽性組和阻斷組以及MC38陽性組和阻斷組,每組設(shè)置3個平行組。將細(xì)胞置于放免管中(每管1×106個),阻斷組加入50 μM前體NOTA-LP,其他組加入等體積的培養(yǎng)基,震蕩混勻后在37 ℃下孵育30 min。孵育結(jié)束后每管加入0.037 MBq探針,震蕩混勻,37 ℃下分別孵育30 min、 60 min和120 min。孵育結(jié)束后,加入500 μL冷PBS緩沖液(pH=7.4, 10 mM)終止攝取,高速離心5 min,吸棄上清液,重復(fù)1次,用γ計數(shù)器檢測樣品的放射活度值,細(xì)胞攝取結(jié)果以細(xì)胞內(nèi)的放射活度與總劑量的放射活度的比值表示(%AD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前體NOTA-LP的表征

利用高效液相色譜對前體NOTA-LP的純度進(jìn)行表征,結(jié)果如圖2所示,其純度在95%以上,保留時間為19.7 min。ESI-MS結(jié)果如圖3(a)所示,前體NOTA-LP的精確相對分子質(zhì)量為880.36,質(zhì)荷比為881.62的離子峰為前體NOTA-LP的準(zhǔn)分子離子峰{[M+H]+}。通過1H NMR和13C NMR進(jìn)一步驗證了前體NOTA-LP結(jié)構(gòu)的正確性,結(jié)果如圖3(b～c)所示。

Time/min

m/z

2.2 探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP的放射性標(biāo)記及體外穩(wěn)定性

螯合劑NOTA可以與金屬離子發(fā)生絡(luò)合,僅需一步反應(yīng)就可完成放射性標(biāo)記,具有耗時短、操作簡單方便和不需要半制備純化等優(yōu)勢。利用正電子核素68Ga和18F分別對前體NOTA-LP進(jìn)行放射性標(biāo)記,結(jié)果如圖4～5所示,僅需30 min即可完成實驗操作,獲得分子探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP,摩爾活度分別為3.60 GBq/μmol和15.8 GBq/μmol,放射化學(xué)產(chǎn)率分別為39.3±4.8%和21.9±8.6%,二者的放射化學(xué)純度均高于95%。

圖4 探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP的放射性合成路線

Time/min

考慮到探針的穩(wěn)定性可能會對其生物活性造成影響,本研究將探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP分別與PBS和小鼠血清孵育1 h、 2 h和4 h,然后利用Radio-HPLC對其放射化學(xué)純度進(jìn)行分析,結(jié)果如圖6～7所示,在PBS和小鼠血清中孵育4 h后,2個探針的放射化學(xué)純度仍大于95%,表明2個探針的穩(wěn)定性良好,可用于后續(xù)的生物學(xué)性質(zhì)研究。

Time/min

Time/min

2.3 脂水分配系數(shù)的測定

探針的脂水分配系數(shù)通常會對其在體內(nèi)的藥代動力學(xué)行為產(chǎn)生影響。本文在聯(lián)苯類PD-L1小分子抑制劑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入NOTA基團,以期增強其親水性,降低探針在肝臟等非靶器官的攝取。實驗測得[68Ga]NOTA-LP的LogP為1.53±0.04, [18F]AlF-NOTA-LP的LogP為2.04±0.13。雖然與聯(lián)苯類的母核結(jié)構(gòu)相比,親脂性得到降低,但與其他應(yīng)用于臨床研究的PD-L1靶向PET探針相比,如68Ga-NOTA-WL12和18F-NOTA-NF12[15-16],仍具有較強親脂性,可能在一定程度影響探針PET顯像的腫瘤背景比。

2.4 細(xì)胞攝取研究

細(xì)胞攝取結(jié)果如圖8所示,PD-L1轉(zhuǎn)染高表達(dá)的人源惡性黑色素瘤細(xì)胞A375-hPD-L1對探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP的攝取值在孵育60 min后達(dá)到最大值(3.12±0.02%AD和3.04±0.11 %AD),高于PD-L1低表達(dá)的A375細(xì)胞(1.98±0.11 %AD和1.74±0.04 %AD),高于A375-hPD-L1細(xì)胞經(jīng)前體NOTA-LP阻斷的攝取(2.01±0.08 %AD和1.93±0.02 %AD),表明探針可區(qū)分不同PD-L1表達(dá)水平的細(xì)胞。PD-L1高表達(dá)的鼠源黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10細(xì)胞與探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP孵育60 min后,攝取值(3.01±0.12 %AD和2.80±0.12 %AD)明顯高于前體NOTA-LP阻斷組(1.90±0.06 %AD和1.55±0.07 %AD)。在孵育60 min后,PD-L1高表達(dá)的鼠源結(jié)腸癌細(xì)胞系MC38細(xì)胞對探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP的攝取值(2.90±0.10 %AD和3.05±0.17 %AD)也明顯高于前體NOTA-LP阻斷組(2.00±0.08 %AD和1.80±0.04 %AD),表明探針對PD-L1具有較好的靶向特異性。

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本文設(shè)計合成了對PD-L1具有高親和力的化合物NOTA-LP,利用68Ga和18F進(jìn)行放射性標(biāo)記,可在短時間內(nèi)方便快速獲得2個PET分子探針[68Ga]NOTA-LP和[18F]AlF-NOTA-LP。 2個探針都具有較高的放射化學(xué)純度,且在PBS和小鼠血清中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,可以在細(xì)胞水平上對PD-L1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。該類放射性探針標(biāo)記方法簡便、理化性質(zhì)良好,為進(jìn)一步深入其研究生物學(xué)性質(zhì)提供了堅實的基礎(chǔ)。