吳洋生 蔣 玲 周云峰 黃招光△

心可舒膠囊由葛根、山楂、三七、丹參和木香5味中藥組成,具有活血化瘀、行氣止痛的功效[1],臨床主要用于治療氣滯血瘀型冠心病引起的頭痛、胸悶、高血壓病、心絞痛、頭暈、頸項(xiàng)疼痛及心律失常、高血脂等癥[2,3]。心可舒膠囊方中木香為佐使藥,具有行氣止痛的功效[4],其主要的代表性成分為木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯,屬于倍半萜內(nèi)酯類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、解痙等作用[5-8]。心可舒膠囊的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》[2],該標(biāo)準(zhǔn)只對木香進(jìn)行薄層鑒別,方法專屬性不高,可能無法有效知悉木香的真實(shí)投料情況,有必要對其含量測定方法進(jìn)行研究。目前,涉及心可舒膠囊含量測定的研究主要集中在葛根[9]、山楂[10]、三七[11]、丹參[1],而對該制劑中木香的含量方法的報(bào)道甚少,基于此,本研究首次采用UPLC-MS/MS法建立木香中木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯的含量測定法,報(bào)道如下。

1 儀器與材料

沃特世H-class超高效液相-xevo TQD三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜系統(tǒng)(美國waters公司);KH-250DB超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

木香烴內(nèi)酯(批號(hào):111524-201208,純度:99.5%)、去氫木香內(nèi)酯對照品(批號(hào):111525-201912,純度:99.5%)、木香對照藥材(批號(hào):120921-202010)購于中國食品藥品檢定研究院;山楂(批號(hào):220301,安徽民順堂中藥科技有限公司)、丹參(批號(hào):220801,江西九州堂中藥飲片有限公司)、三七(批號(hào):190801,湖南省松齡堂中藥飲片有限公司)、葛根(批號(hào):220901,江西九州堂中藥飲片有限公司)用于制備缺木香的陰性樣品;乙腈、甲醇、甲酸為色譜純,水為屈臣氏蒸餾水。心可舒膠囊樣品(市售3批,來源于四川百草堂龍人藥業(yè)有限公司,規(guī)格為0.3 g/粒)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0～2 min,20%B～20%B;2～6 min,20%B～80%B;6～9 min,80%B～80%B;9～10 min,80%B～20%B;10～13 min,20%B～20%B),流速0.3 ml/min;色譜柱:Waters ACQUITY UPLC?BEH C18;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:2 μl。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源ESI、多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)、正離子電離模式;毛細(xì)管電壓為0.5 kV,錐孔電壓為24 V,霧化氣流速為900 L/h,溫度 550 ℃;木香烴內(nèi)酯檢測離子對m/z 233→105、m/z 233→187、m/z 233→215;去氫木香內(nèi)酯檢測離子對m/z 231→128、m/z 231→143、m/z 231→185。

2.2 對照品溶液取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解配成含木香烴內(nèi)酯2.1498 μg/ml、去氫木香內(nèi)酯2.1970 μg/ml的對照品混合母液。

2.3 供試品溶液取裝量差異項(xiàng)下的樣品約0.3 g,精密稱定,置于250 ml錐形瓶中,精密加入100 ml甲醇,稱定重量,常溫超聲處理35 min,放冷至室溫,用甲醇補(bǔ)充減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液5～50 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,即得。

2.4 陰性樣品溶液取木香的陰性樣品約0.3 g,按2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.5 對照藥材溶液取木香對照藥材約25 mg,按2.3項(xiàng)下方法制備對照藥材溶液。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密量取對照品混合母液1 ml、2 ml、5 ml、15 ml、25 ml分別置50 ml量瓶中,加甲醇稀釋配制成一系列濃度的對照品溶液,按照2.1項(xiàng)下檢測條件測定,記錄峰面積,以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X),以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出木香烴內(nèi)酯的回歸方程為Y=25386X+1057.2,R2=0.9913;去氫木香內(nèi)酯的回歸方程為Y=5036.9X+331.6,R2=0.9946。

2.7 專屬性分別取陰性樣品溶液、木香對照藥材溶液、供試品溶液、對照品溶液各2 μl,依次進(jìn)行檢測,采集MRM圖。結(jié)果顯示,供試品溶液出現(xiàn)與木香對照藥材溶液、對照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰,而在陰性樣品溶液的色譜中均未有與木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對照品溶液保留時(shí)間一致的離子峰,說明該2種成分歸屬于木香藥味,且該制劑中其他藥味成分對測定無影響,專屬性良好。見圖1。

圖1 總離子流色譜圖

2.8 精密度 重復(fù)性 穩(wěn)定性取一份木香烴內(nèi)酯濃度為0.2150 μg/ml、去氫木香內(nèi)酯濃度為0.2197 μg/ml的對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的峰面積RSD分別為1.6%和2.0%;平行稱取6份樣品(批號(hào):01221101),制備供試品溶液,測定含量,木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的RSD為3.6%和2.2%;取重復(fù)性項(xiàng)下的一份供試品溶液,在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h測定峰面積,木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的RSD分別為4.9%和4.0%。

2.9 加標(biāo)回收平行稱取6份樣品(批號(hào):01221101),每份約0.15 g,精密稱定,置于250 ml錐形瓶中,精密加入混合對照品溶液4 ml(木香烴內(nèi)酯濃度為0.2150 mg/ml,去氫木香內(nèi)酯濃度為0.2197 mg/ml),再精密加入甲醇96 ml,按2.3項(xiàng)下方法制備加標(biāo)樣品溶液,計(jì)算回收率結(jié)果。見表1。

表1 加標(biāo)回收率

2.10 樣品結(jié)果取該廠家3批心可舒膠囊,每批稱取2份平行樣,分別按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,含量測定結(jié)果見表2。

表2 心可舒膠囊中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量結(jié)果

3 討論

UPLC-MS/MS技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn),在中藥質(zhì)量控制,尤其是定量測定方面越來越發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12,13]。本實(shí)驗(yàn)初期采用水和乙腈、水和甲醇作為流動(dòng)相,以正、負(fù)離子掃描模式分別對木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行摸索,發(fā)現(xiàn)該2種成分的響應(yīng)強(qiáng)度均較低且出現(xiàn)峰形拖尾情況,而在水相中加入了0.1%甲酸后,木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在正離子掃描模式下出現(xiàn)較高響應(yīng),且色譜峰峰形尖銳對稱,考慮到乙腈具有較好的分離性,最終選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相,并以梯度洗脫方式減少極性和非極性雜質(zhì)在色譜柱中的殘留及對測定的干擾。

木香烴內(nèi)酯檢測離子對為m/z 233→187,去氫木香內(nèi)酯檢測離子對為m/z 231→185,其裂解規(guī)律為在正離子電離模式下,木香烴內(nèi)酯的母離子為m/z 233[M+H]+,失去一分子甲酸得到子離子m/z 187[M+H-HCOOH]+;去氫木香內(nèi)酯的母離子為m/z 231[M+H]+,失去一分子甲酸產(chǎn)生子離子m/z 185[M+H-HCOOH]+。

木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯不溶于水,可溶于甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮等溶劑中,綜合考慮溶劑的揮發(fā)性、對儀器系統(tǒng)的兼容性和穩(wěn)定性等因素,選擇甲醇作為樣品的提取溶劑。木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯具有熱不穩(wěn)定性,采用加熱回流等方式提取可能會(huì)使上述2種成分加速水解,影響結(jié)果準(zhǔn)確性,故直接考察在常溫下(不高于25 ℃)超聲時(shí)間對提取效果的影響,通過比較不同超聲時(shí)間發(fā)現(xiàn)35 min后木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯即可提取完全。

從含量測定結(jié)果可知,各批次樣品中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量差異較小,含量均一性較好,說明該企業(yè)的生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定,且木香藥味的進(jìn)貨來源相對可控。

綜上所述,本研究所建立的UPLC-MS/MS法快速、準(zhǔn)確,可用于測定心可舒膠囊中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量,對控制木香藥味的質(zhì)量具有重要作用。