李曉旭 王猛 李晶晶 馬小霞 梁文裕 王玲霞

摘 要 通過定點突變和生物學(xué)分析，研究了賴氨酸琥珀?；瘜APDH活性的影響。結(jié)果表明：發(fā)菜GAPDH基因全長為1 014 bp，由338個氨基酸組成，其中K264位點在藻類中高度保守。將K264位點的氨基酸K（AAA）突變?yōu)镽（AGA），野生型和突變型GAPDH在大腸桿菌中表達(dá)，獲得一個36.61 ku的外源蛋白。純化后蛋白活性測定發(fā)現(xiàn)，發(fā)生琥珀?；揎棻任窗l(fā)生琥珀?；揎椀腉APDH（K264）活性顯著降低，表明琥珀?；揎梾⑴c發(fā)菜GAPDH活性的調(diào)節(jié)。研究結(jié)果為深入研究發(fā)菜GAPDH的分子信息和生物學(xué)功能提供理論參考。

關(guān)鍵詞 發(fā)菜；干旱脅迫；GAPDH；琥珀?；揎?；定點突變

蛋白質(zhì)琥珀?；揎検且环N普遍存在、可逆且高度調(diào)控的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、復(fù)合體的形成及酶活性等，參與調(diào)控光合作用、糖酵解／糖異生、TCA循環(huán)和脂肪酸代謝等多種細(xì)胞過程，在植物生長、發(fā)育、開花、逆境脅迫及激素信號應(yīng)答等中起重要的調(diào)控作用。近年來，蛋白質(zhì)琥珀酰化修飾調(diào)控機(jī)制研究首先是在哺乳動物、細(xì)菌等物種中展開。Park等[1]在小鼠細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，deacylase Sirtuin 5（SIRT5）是細(xì)胞和組織中去琥珀?；揎椀闹饕福琒IRT5抑制丙酮酸脫氫酶復(fù)合物體（PDC）和琥珀酸脫氫酶（SDH）兩個細(xì)胞呼吸相關(guān)酶活性。另外，研究發(fā)現(xiàn)小鼠中的限速生酮酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶2 （HMGCS2）的活性受特異性的去琥珀酰化酶SIRT5的調(diào)控，HMGCS2作為線粒體中賴氨酸琥珀?；揎椀恼{(diào)節(jié)因子，通過抑制HMGCS2的活性限制酮的生成[2]。在天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）中發(fā)現(xiàn)一種類似Sirtuin的去琥珀?；揎椕窼cCobB2，并證明了它在S. coelicolor的多個生物學(xué)過程中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，主要影響甘油醛-3-磷酸脫氫酶、烏頭酸水合酶和幾種核糖體蛋白的豐度[3]。此外，TCA循環(huán)中的異檸檬酸脫氫酶2 （IDH）被SIRT5去琥珀?；跃S持細(xì)胞NADPH穩(wěn)態(tài)并增強細(xì)胞抗氧化防御[4]。這些研究表明，琥珀?；揎椏赡苁呛粑饔孟嚓P(guān)酶活性的重要調(diào)節(jié)因素。至今植物和藍(lán)藻中有關(guān)琥珀?；揎椪{(diào)節(jié)酶活性的研究報道較少。在植物中，將體外重組表達(dá)蛋白（酶）與SIRT5孵育，然后檢測對照與處理組的酶活性變化，發(fā)現(xiàn)去琥珀酰化修飾酶SIRT5改變了水稻葉片中過氧化氫酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性[5]。在藍(lán)藻中，為了評估蛋白質(zhì)翻譯后修飾（丙?；捅；揎棧?1，6二磷酸酶（FbpI）和磷酸甘油酸酯激酶（PGK）活性的影響，對FbpI的K156和PGK的K205進(jìn)行定點突變，K156和K205的突變導(dǎo)致了FbpI和PGK酶活性顯著降低，表明了賴氨酸丙酰化和丙二?；揎梾⑴c調(diào)節(jié)FbpI和PGK酶活性[6-7]。但是在藍(lán)藻中目前還沒有琥珀?；揎椪{(diào)節(jié)酶活性的相關(guān)報道。

發(fā)菜（Nostoc flagelliforme Born. et Flah）是一種主要分布于西北干旱-半干旱荒漠地區(qū)的陸生固氮耐旱藍(lán)藻，對干旱具有極強的耐受性，研究發(fā)菜耐旱的分子調(diào)控機(jī)理具有重要意義[8]。GAPDH是細(xì)胞質(zhì)中參與糖酵解的重要酶[9]，主要催化依賴于NAD的甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1，3二磷酸甘油酸，為植物的生長發(fā)育提供ATP和細(xì)胞代謝所需中間產(chǎn)物。在植物生長過程中，呼吸作用是植物所需能量及體內(nèi)各種物質(zhì)之間轉(zhuǎn)換代謝的樞紐，對植物的生長發(fā)育尤其是對逆境的適應(yīng)起重要作用。通過呼吸損失的碳水化合物的比例決定了植物的整體代謝效率[10]。干旱脅迫往往會導(dǎo)致植物的光合作用下降，除非碳消耗同時按比例減少，否則干旱期間光合作用能力下降會導(dǎo)致負(fù)碳平衡[11]。有研究報道，干旱脅迫下不同品種金銀花和蘆葦?shù)暮粑俾氏陆?，即呼吸作用消耗的光合產(chǎn)物減少，以利于碳水化合物代謝平衡，提高植物耐旱性[12-13]。耐旱小麥在土壤嚴(yán)重干旱條件下，通過降低根系呼吸和生物量提高其的生長和生理活性，這也使得在干旱地區(qū)耐旱小麥比干旱敏感品種更有優(yōu)勢[14]。值得注意的是，越來越多的證據(jù)表明，GAPDH不僅是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，而且作為一種多功能蛋白廣泛參與生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和 DNA修復(fù)等過程，尤其是生物和非生物脅迫顯著誘導(dǎo)GAPDH的轉(zhuǎn)錄[15]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)GAPDH 中的8個位點發(fā)生了琥珀?；揎?，且干旱脅迫下發(fā)菜的GAPDH（K169、K264）琥珀?；揎椝斤@著上調(diào)（FC>1.5， P<0.05）[16]。但目前為止發(fā)菜GAPDH基因的分子信息及是否會通過琥珀?；揎椄淖兤涿富钚赃M(jìn)而響應(yīng)干旱脅迫尚未明確。因此，本研究從發(fā)菜基因組中克隆GAPDH基因，并采用定點突變對發(fā)菜琥珀?；揎桮APDH的保守性位點進(jìn)行單一點突變，以驗證琥珀?；揎棇ζ涿富钚缘挠绊?，進(jìn)一步闡釋蛋白質(zhì)琥珀酰化修飾對發(fā)菜干旱脅迫的響應(yīng)? 機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)菜藻絲體于2020年10月13日采自寧夏賀蘭山東麓（38.41′N，105.95′E）發(fā)菜自然生長地，自來水沖洗后自然風(fēng)干，貯藏于-80 ℃，? 備用。

1.2 發(fā)菜GAPDH琥珀?；揎椢稽c質(zhì)譜檢測及序列分析

發(fā)菜GAPDH琥珀酰化修飾位點質(zhì)譜檢測參照Li等[16]的方法。運用NCBI中的BLAST進(jìn)行序列比對分析。利用SWISS-MODEL預(yù)測GAPDH的三級結(jié)構(gòu)。

1.3 發(fā)菜野生型GAPDH基因克隆及突變型基因序列的合成

采用CTAB法提取發(fā)菜總DNA[17]。根據(jù)發(fā)菜的GAPDH序列設(shè)計特異性引物（表1），擴(kuò)增條件為94 ℃變性8 min，（94 ℃ 50 s，55.9 ℃?? 50 s，72 ℃ 1 min）進(jìn)行25個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，將回收純化的目的基因與pMD18-T載體進(jìn)行連接，然后涂布于Amp篩選的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR驗證，并對菌液進(jìn)行測序和BLAST檢索比對。對GAPDH琥珀酰化蛋白修飾位點進(jìn)行序列保守性分析，根據(jù)野生型基因的測序結(jié)果，將具有保守性且差異表達(dá)的琥珀?；揎椀鞍譑位點突變?yōu)镽[6，18]，以保持賴氨酸的電性不變，由上海生工生物合成GAPDH突變型基因序列。

1.4 GAPDH基因原核表達(dá)

根據(jù)發(fā)菜GAPDH的基因測序結(jié)果，設(shè)計并合成酶切引物（表1）。對含有GAPDH基因的陽性菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后使用BamH I和Xho I分別對目的基因與pET28a進(jìn)行雙酶切? 1 h。將連接后獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，最后涂布于Kan篩選的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)后挑取陽性克隆子至含Kan的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)12 h，進(jìn)行雙酶切鑒定。過夜培養(yǎng)物加入100 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～1.0。1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)GAPDH，最后進(jìn)行12.5% SDS-PAGE電泳檢測，用BeyotimeTM考馬斯亮藍(lán)超快染色液（中國，上海）染色1 h，蒸餾水脫色。

1.5 GAPDH原核表達(dá)產(chǎn)物的蛋白純化

取2 mL的磁珠懸液用于蛋白純化，磁性分離后棄上清，加入5 mL的Binding buffer（20 mmol/ L Phosphate Buffer， 500 mmol/ L NaCl， 5～50 mmol/ L Imidazole， pH 7.4）重復(fù)洗滌磁珠3次，棄上清。將驗證表達(dá)成功的野生型和突變型GAPDH菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，4 ℃， 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入10 mL的Binding buffer進(jìn)行重懸，低溫下（冰浴）超聲破碎（200 W、15 min），4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，加入裝有預(yù)處理磁珠的離心管中，在4 ℃，100 r/min的搖床上結(jié)合2 h，然后進(jìn)行磁珠洗滌，具體操作步驟參照Beaver BeadsTM His-tag Protein Purification 說明書，最后采用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度[19] 。

1.6 GAPDH酶活性檢測

按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒（中國，江蘇）進(jìn)行GAPDH活性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)菜GAPDH琥珀酰化修飾位點同源性? 比對

GAPDH是發(fā)菜糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，催化1，3-二磷酸甘油酸和NADH的形成。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下，發(fā)菜GAPDH中有8個可靠的琥珀酰化修飾位點（K47、54、110、169、216、226、228、264）（表2），且GAPDH（K264）的琥珀?；揎棸l(fā)生了顯著變化[16]，其相應(yīng)肽段的MS/MS譜見圖1-A。多序列比對分析表明，GAPDH的K264位點在藻類中高度保守（圖1-B）。通過SMART軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)GAPDH（K264）位點在C端結(jié)構(gòu)域上。高度保守的K264位于α-螺旋區(qū)域（圖2）。因此選擇GAPDH的K264作為突變位點，進(jìn)一步分析該琥珀酰化修飾位點是否會影響GAPDH的酶活性。

2.2 發(fā)菜GAPDH基因的突變

以發(fā)菜DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到1 014 bp的單一條帶（圖3-A）。Blastn檢索比對，GAPDH基因由338個氨基酸組成，其理論分子質(zhì)量為36.61 ku。將GAPDH的K264位點突變?yōu)镽，即將該位點的AAA序列突變?yōu)锳GA序列，通過DNA測序驗證表明，該位點突變成功（圖3-B）。

2.3 野生型和突變型GAPDH的原核表達(dá)

構(gòu)建GAPDH表達(dá)載體pET28a-GAPDH，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，然后進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切驗證，分別得到pET28a與GAPDH和GAPDH突變型兩條條帶，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功 （圖4）。IPTG誘導(dǎo)后GAPDH野生型和突變體在大腸桿菌BL21中均可以高效表達(dá)。[FL）]

2.4 野生型和突變型GAPDH蛋白純化和酶活性分析

為了進(jìn)一步檢測發(fā)菜野生型和突變型GAPDH的活性是否受到琥珀?；揎椀挠绊?，對誘導(dǎo)表達(dá)成功的GAPDH蛋白進(jìn)行了純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，野生型和突變型GAPDH蛋白條帶單一且清晰，與預(yù)測蛋白分子量大小一致（圖5-A）。酶活性檢測結(jié)果顯示，與野生型GAPDH（K264）相比，GAPDH突變型（K264R）的活性顯著增加（P <0.05）（圖5-B），表明GAPDH（K264R）琥珀?；揎棔@著影響其酶活性。

3 討? 論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)GAPDH在多種細(xì)胞過程中的新作用，不僅僅作為催化糖酵解的關(guān)鍵酶，而且正在成為許多基本細(xì)胞過程的功能和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵成分，特別是GAPDH在植物細(xì)胞中一個重要的非催化作用是對各種非生物脅迫的響應(yīng)，包括鹽、干旱、熱、冷、厭氧和鎘毒性[20-26]。非生物脅迫誘導(dǎo)GAPDH的表達(dá)，這可能是植物適應(yīng)環(huán)境變化的自然機(jī)制。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)參與發(fā)菜糖酵解的GAPDH有8個位點發(fā)生了琥珀?；揎?，其中K264位點在發(fā)菜響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)生了顯著變化[16]。為了進(jìn)一步驗證GAPDH酶活性是否受琥珀?；揎椨绊戇M(jìn)而響應(yīng)干旱脅迫，筆者對糖酵解的關(guān)鍵酶GAPDH琥珀?；揎椢稽c進(jìn)行分析。本研究通過設(shè)計特異性引物克隆獲得? 1 014 bp的野生型發(fā)菜GAPDH全序列。將GAPDH的K264位點的AAA序列突變?yōu)锳GA序列，獲得突變型GAPDH。原核表達(dá)得到一個分子量大小約36.61 ku的外源蛋白，且野生型和突變型GAPDH在大腸桿菌BL21中均高效表達(dá)。多序列比對分析發(fā)現(xiàn)GAPDH的K264位點在藻類中高度保守，且K264琥珀?；揎椢稽c在發(fā)菜響應(yīng)干旱脅迫時顯著上調(diào)，暗示了這個位點在GAPDH進(jìn)化過程中功能的保守性具有重要的意義。通過位點突變發(fā)現(xiàn)K264對R的突變導(dǎo)致GAPDH酶活性顯著增加（P<0.05），這表明GAPDH（K264）的琥珀酰化修飾會導(dǎo)致GAPDH的酶活性下降，琥珀酰化修飾可能影響GAPDH酶活性。因為琥珀酰化的賴氨酸基團(tuán)被賦予2個負(fù)電荷，價態(tài)從+1變成-1，高于乙?；?1到0）和單甲基化（無變化）造成的電荷改變[27]，并在賴氨酸上增加了一個琥珀?；?00 D）[18]。這種結(jié)構(gòu)變化對發(fā)生琥珀?；揎椀牡鞍椎慕Y(jié)構(gòu)和功能有著更實質(zhì)性的影響。因此，K264位點的琥珀?；餑APDH構(gòu)象和酶活性的顯著變化，并進(jìn)一步改變了發(fā)菜細(xì)胞呼吸作用等代謝過程。呼吸作用決定了植物在長時間干旱下的生存和生產(chǎn)力的快速恢復(fù)[28]。植物在干旱脅迫下，體內(nèi)水分代謝與碳代謝會發(fā)生失衡，而植物根系呼吸速率上升，使得ATP合成減少和活性氧增加[11]，從而對植物的生長造成傷害。為了維持植物新陳代謝，植物通過呼吸作用的下調(diào)，維持碳代謝平衡[29]。因此認(rèn)為發(fā)菜能耐受極端干旱環(huán)境且在復(fù)水后迅速恢復(fù)生理活性[30]，其很可能通過降低呼吸速率和減少碳消耗適應(yīng)干旱。

蛋白質(zhì)的功能受轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)翻譯后修飾等多因素、多水平調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果揭示了琥珀?；揎棇Πl(fā)菜GAPDH活性的調(diào)節(jié)作用，證實了琥珀?；揎椖軌蚋淖僄APDH的活性，并推測發(fā)菜可能由于GAPDH活性下降等原因降低呼吸作用來提高其耐旱性。這一研究發(fā)現(xiàn)為今后進(jìn)一步深入探究發(fā)菜GAPDH響應(yīng)非生物脅迫的重要作用提供了參考。

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Effect of Succinylation Modification on Activity of Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase

Abstract Lysine succinylation，a reversible and widely distributed post-translational modification，is known to play a regulatory role in both eukaryotes and prokaryotes.Our previous study found significant succinylation of GAPDH in Nostoc flagelliforme under drought stress，however，the effect of succinylated modification on GAPDH enzyme activity remains unclear.In this study，we investigated the influence of lysine succinylation on GAPDH activity by site-directed mutagenesis and biological analysis.The results showed that the GAPDH gene of N.flagelliforme was 1 014? bp in length and consisted of 338 amino acids，of which K264 was highly conserved in algae.The amino acid sequence AAA at K264 site was mutated into R （AGA），and wild type and mutant GAPDH of N.flagelliforme were expressed in E.coli to obtain a 36.61 ku foreign protein.The activity of GAPDH （K264） with succinylation modification after purification was significantly lower than that of GAPDH without the modification，indicating that succinylation modification was involved in the regulation of GAPDH activity in N.flagelliforme.These results confirm that the succinylation modification of GAPDH is an regulation mechanism in response to drought stress of N.flagelliforme，which provide a theoretical basis for further research on the molecular information and biological functions of GAPDH in?? N.flagelliforme.

Key words Nostoc flagelliforme；Drought stress；GAPDH；Succinylation; Site-directed mutagenesis