葉雨昕，李慧嫻，閻 濤，張 赟，孫玉琳*

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院 1.分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.麻醉科，北京 100021

不可控的炎性反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療反應(yīng)密切相關(guān),是腫瘤的十四大特征之一[1]。此外,各種感染性和損傷性應(yīng)激也會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)[2],參與各種疾病。在此過程中,外周血單核細(xì)胞的數(shù)量和活性是了解機(jī)體全身性炎性反應(yīng)狀態(tài)的重要窗口。大量研究表明,人類和小鼠腫瘤中外周血單核細(xì)胞數(shù)量明顯升高并與不良預(yù)后相關(guān),而其可進(jìn)一步被活化,激活細(xì)胞內(nèi)的炎性小體等相關(guān)信號(hào)通路,產(chǎn)生大量的細(xì)胞和趨化因子,影響腫瘤和疾病的轉(zhuǎn)歸和進(jìn)程[3]。

炎性小體是機(jī)體天然免疫的重要組成部分,是由模式識(shí)別受體NLRP3、接頭蛋白ASC即凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein)和效應(yīng)蛋白pro-caspase-1組成的多聚蛋白復(fù)合物[4],其激活后產(chǎn)生活性caspase-1,可將下游的細(xì)胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18分別轉(zhuǎn)化為成熟型IL-1β和IL-18并引發(fā)一系列炎性反應(yīng)[5]。通常檢測全身性炎性水平的方法需要先從大量外周血中提取單核細(xì)胞,再經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)或蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)等方法,評(píng)價(jià)炎性小體和下游相關(guān)分子的表達(dá)水平[6-10]。QPCR靈敏,所需樣本量較少,但只能檢測mRNA水平的變化;而傳統(tǒng)的Western blot檢測操作繁瑣,對(duì)樣本量要求較高,需要從比較大量的外周血中分離單核細(xì)胞并提取蛋白質(zhì),不便于臨床使用。微量蛋白質(zhì)定量分析系統(tǒng)(quantita-tive analysis of trace-level proteins)是一種用于高效、自動(dòng)和準(zhǔn)確測量生物樣品中蛋白質(zhì)含量的設(shè)備[11]?；趥鹘y(tǒng)的Western blot,該系統(tǒng)將所需步驟的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電轉(zhuǎn)移、抗體雜交和酶聯(lián)免疫顯影等步驟集中,從而實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化。本研究基于10例乳腺癌患者的術(shù)前、術(shù)后外周血樣本,探索了微量蛋白質(zhì)定量分析在炎性小體相關(guān)通路分子檢測中的應(yīng)用價(jià)值,并與qPCR做了對(duì)比分析,為臨床樣本的微量、快速、精準(zhǔn)檢測提供了標(biāo)準(zhǔn)方法和參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究對(duì)象來自于2022年05月03日至2023年12月01日中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院乳腺外科行乳腺癌單側(cè)乳房切除術(shù)(包括前哨淋巴結(jié)活檢或腋窩淋巴結(jié)清掃)或保乳術(shù)(包括前哨淋巴結(jié)活檢或腋窩淋巴結(jié)清掃)的患者,共10例,年齡為18～70歲,ASA Ⅰ-Ⅲ級(jí);手術(shù)均由同一組乳腺外科醫(yī)生承擔(dān)。排除了合并炎性疾病和近30 d內(nèi)接收過手術(shù)治療的患者。本研究方案經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):20/332-2528)。所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的獲取:使用含檸檬酸鈉抗凝的BD Vacutainer? CPTTM單個(gè)核細(xì)胞制備管(BectonDickinson公司,貨號(hào)362761)采集所有入組患者的手術(shù)前和術(shù)后2 h血液樣本,單次采血量約6 mL。收集后的采血管在22 ℃,1 700 ×g離心30 min,吸取中間白色細(xì)胞層(圖1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),加入3～4倍體積的1×PBS,吹打混勻;300×g離心10 min,離心后棄上清,得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)沉淀(操作用時(shí)約1 h)。

PBMCs.peripheral blood mononuclear cells, created with BioRender.com.

1.2.2 單核細(xì)胞的分離培養(yǎng)和活化處理:使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(大連美侖生物技術(shù)有限公司)重懸上述分離后的單個(gè)核細(xì)胞,吹吸混勻移入T25培養(yǎng)瓶中(操作用時(shí)約5 min),并在含5% CO2的孵箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。在此過程中,未貼壁的淋巴細(xì)胞被換液去除,從而獲得了純化的具有貼壁特性的單核細(xì)胞樣本。隨后使用100 ng/mL脂多糖(lipopolysaccharide, LPS, Sigma-Aldrich公司)對(duì)貼壁的單核細(xì)胞進(jìn)行活化處理4 h(操作用時(shí)約5 min)。將獲取的細(xì)胞分成兩部分,三分之二的細(xì)胞使用適量含有1×蛋白質(zhì)酶抑制劑(Roche公司)、1×磷酸酶抑制劑(Bimake公司)的RIPA強(qiáng)裂解液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解,三分之一的細(xì)胞用TRIzol? Reagent(Invitrogen公司)裂解提取RNA,分別于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR:使用RNAprep Pure微量樣品總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取純化總RNA,將提取的總RNA使用HiFiScript cDNA合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA以1∶2比例稀釋后使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行qPCR檢測(操作用時(shí)約5.5 h)。內(nèi)參基因使用β-actin,相對(duì)基因表達(dá)水平采用了2-ΔΔCt法,引物序列(表1)。

表1 基因引物序列和抗體信息Table 1 Gene primer sequences and antibody information

1.2.4 微量蛋白質(zhì)定量分析:采用JESS全自動(dòng)蛋白質(zhì)定量分析系統(tǒng)(protein simple, USA)進(jìn)行。首先使用BCA法定量蛋白質(zhì)樣品,其次按12～230 ku 中分子量蛋白分析試劑(貨號(hào)SM-W004)操作要求取相應(yīng)體積5×master mix(即 loading buffer)和0.1×sample buffer,混合制成樣品檢測液,95 ℃變性5 min,加入到檢測板的樣品孔道中。然后將一抗稀釋液、一抗(表1)、二抗、發(fā)光液、洗滌液分別加入到檢測板的相應(yīng)孔道中,室溫2 500 r/min離心檢測板5 min。將檢測板和預(yù)制毛細(xì)管板放入儀器,運(yùn)行Compass for SW軟件程序,開展微量蛋白質(zhì)定量分析(操作用時(shí)約4 h),采用細(xì)胞裂解液作為質(zhì)控,運(yùn)行結(jié)束后采集圖像檢測目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值并計(jì)算比值,內(nèi)參基因使用β-actin。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外周血單核細(xì)胞的分離

全部10例患者術(shù)前、術(shù)后外周血中貼壁單核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(表2),可見不同個(gè)體相同體積外周血中單核細(xì)胞數(shù)量差異較大,可達(dá)兩個(gè)數(shù)量級(jí),而絕大部分患者經(jīng)過手術(shù)應(yīng)激后外周血單核細(xì)胞數(shù)量明顯增加。

表2 10例患者手術(shù)前后外周血貼壁單核細(xì)胞數(shù)量

2.2 利用qPCR檢測caspase-1和IL-1β的mRNA在乳腺癌患者手術(shù)前后單核細(xì)胞中的表達(dá)變化

首先選擇炎性小體的效應(yīng)分子caspase-1和下游分子IL-1β,利用qPCR技術(shù)對(duì)10例乳腺癌患者手術(shù)前后外周血單核細(xì)胞中2個(gè)分子mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,與術(shù)前相比,caspase-1的表達(dá)水平在5例患者中術(shù)后顯著升高,在4例患者中顯著降低,而在1例患者中則未呈現(xiàn)出顯著差異(圖2A)。另外,針對(duì)IL-1β的檢測結(jié)果顯示,4例患者的表達(dá)水平術(shù)后顯著升高,5例患者的表達(dá)水平顯著降低,而有1例患者的表達(dá)水平未呈現(xiàn)明顯差異(圖2B)。綜合,6例患者在caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平上呈現(xiàn)出一致的趨勢,其中3例患者的術(shù)后表達(dá)水平均上升(BC1、BC7、BC8),另外3例患者的表達(dá)水平則呈現(xiàn)下降的趨勢(BC3、BC6、BC10),而剩余4例患者的2個(gè)基因呈現(xiàn)不一致的結(jié)果。

A.qPCR detected the expression levels of caspase-1 mRNA in peripheral blood monocytes samples from breast cancer patients before and after surgery; B.qPCR detected the expression levels of IL-1β mRNA in peripheral blood monocytes samples from breast cancer patients before and after surgery;pre.preoperative monocytes; post.postoperative monocytes; The ratio of gene expression level in postoperative monocytes to that in preoperative monocytes was represented on the Y-axis, while different patients are represented on the X-axis;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared to the control group.

2.3 乳腺癌患者單核細(xì)胞中caspase-1和IL-1β蛋白的微量快速檢測

利用微量蛋白質(zhì)定量分析系統(tǒng)檢測了10例乳腺癌患者手術(shù)前后配對(duì)單核細(xì)胞樣本中caspase-1和IL-1β的蛋白水平,結(jié)果顯示,有6例患者的術(shù)后caspase-1表達(dá)水平顯著升高3例患者的顯著降低,而有1例患者的表達(dá)水平未呈現(xiàn)出顯著差異(圖3A,B)。另外,6例患者的術(shù)后IL-1β表達(dá)水平顯著升高,2例患者的顯著降低,而有2例患者的表達(dá)水平未呈現(xiàn)出明顯差異(圖3A,C)。綜合,有8例患者在caspase-1和IL-1β的術(shù)后表達(dá)水平上呈現(xiàn)出一致的趨勢,其中5例患者的術(shù)后表達(dá)水平上升(BC1、BC2、BC3、BC4、BC7),2例患者的則呈現(xiàn)下降趨勢(BC6、BC9),而有1例患者的表達(dá)水平未呈現(xiàn)明顯差異(BC10)。

A.quantitative analysis of trace-level proteins detecting the expression levels of caspase-1 and IL-1β proteins in breast cancer patients before and after surgery, pre.preoperative monocytes; post.postoperative monocytes; The ratio of protein expression level in postoperative monocytes to that in preoperative monocytes was represented on the Y-axis, while different patients were represented on the X-axis; B.quantitative analysis of caspase-1 protein levels in breast cancer patients before and after surgery; C.quantitative analysis of IL-1β protein levels in breast cancer patients before and after surgery; D.quantitative analysis of cleaved caspase-1 protein levels in breast cancer patients before and after surgery; E.quantitative analysis of cleaved IL-1β protein levels in breast cancer patients before and after surgery; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with the control group.

值得注意的是,caspase-1和IL-1β在體內(nèi)均以無活性的酶原形式存在,在炎性反應(yīng)狀態(tài)下,兩者先后被蛋白質(zhì)水解激活,而蛋白質(zhì)水平的檢測能顯示前體蛋白質(zhì)的酶切活化。8例患者表現(xiàn)出明顯的caspase-1和IL-1β活性切割條帶(BC1、BC2、BC3、BC4、BC6、BC7、BC9、BC10),其中4例術(shù)前、術(shù)后均有活性切割條帶(BC1、BC2、BC9、BC10),4例術(shù)后出現(xiàn)活性切割條帶(BC3、BC4、BC7、BC8)且均出現(xiàn)明顯增加的趨勢,1例術(shù)前出現(xiàn)活性切割條帶(BC6)(圖3D,E)。這些結(jié)果提示微量蛋白質(zhì)定量分析系統(tǒng)具有直觀地檢測caspase-1和IL-1β蛋白水解活化的能力,進(jìn)一步深入理解患者體內(nèi)的炎性反應(yīng)狀態(tài)。

2.4 信使RNA(mRNA)和蛋白質(zhì)檢測結(jié)果的比較

對(duì)比mRNA和蛋白質(zhì)水平的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),有4例患者的術(shù)后caspase-1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著升高(BC1、BC4、BC7、BC8),3例患者均顯著降低(BC6、BC9、BC10),而有3例患者(BC2、BC3、BC5)的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈現(xiàn)不一致改變(圖4A)。此外,有4例患者的術(shù)后IL-1β mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高(BC1、BC2、BC7、BC8),2例患者均顯著降低(BC6、BC10),而有4例患者(BC3、BC4、BC5、BC9)的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈現(xiàn)不一致(圖4B)。綜上所述,共3例患者mRNA和蛋白質(zhì)水平caspase-1和IL-1β表達(dá)水平均顯著升高(BC1、BC7、BC8),2例患者的表達(dá)水平均顯著降低(BC6、BC10)。由此可見,僅僅依賴于mRNA水平的檢測不能完全反映機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的真實(shí)表達(dá)情況,結(jié)合蛋白質(zhì)的表達(dá)和活化情況能夠更全面地評(píng)估患者的炎性反應(yīng)狀況。

A.comparison of caspase-1 expression levels in breast cancer patients before and after surgery using quantitative analysis of trace-level proteins and qPCR; B.comparison of IL-1β expression levels in breast cancer patients before and after surgery using quantitative analysis of trace-level proteins and qPCR; The ratio of gene or protein expression level in postoperative monocytes to that in preoperative monocytes was represented on the Y-axis, while different patients were represented on the X-axis.

2.5 比較單核細(xì)胞炎性反應(yīng)水平檢測方法之間的優(yōu)缺點(diǎn)

對(duì)傳統(tǒng)檢測單核細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)水平的qPCR和Western blot,以及本研究中使用的微量蛋白質(zhì)定量分析進(jìn)行了方法學(xué)上的比較和總結(jié)(表3)。QPCR檢測雖然比較靈敏,所需樣本量也比較少,但mRNA水平不能真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化和功能活性狀態(tài)。通過對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),近一半患者的術(shù)后caspase-1和IL-1β改變呈現(xiàn)出mRNA水平和蛋白質(zhì)水平相反的變化,因此并不推薦將qPCR檢測用于單核細(xì)胞炎性小體活化狀態(tài)和全身性炎性反應(yīng)狀態(tài)的評(píng)估。傳統(tǒng)的Western blot檢測雖能在蛋白質(zhì)水平上反映炎性相關(guān)因子的變化,但所需外周血用量過大,操作時(shí)間長,對(duì)患者和操作者負(fù)擔(dān)過重,并不適于臨床樣本檢測。而本研究使用的微量蛋白質(zhì)定量分析具有樣本量需求較少、流程標(biāo)準(zhǔn)化、高可重復(fù)性、高靈敏度等優(yōu)勢,能夠在短時(shí)間內(nèi)快速反映出患者體內(nèi)的真實(shí)蛋白質(zhì)水平改變和活性狀態(tài),為臨床樣本的快速、微量檢測提供了更加適用的方法?？偟膩碚f, 微量蛋白質(zhì)定量分析對(duì)于評(píng)估臨床樣本中的炎性因子表達(dá)水平和炎性反應(yīng)狀態(tài)具有重要意義,其可靠性和高效性使其成為未來臨床樣本檢測的有力工具。

表3 單核細(xì)胞炎性反應(yīng)水平檢測方法之間的比較Table 3 Comparison of inflammatory levels in monocytes detection methods

3 討論

單核細(xì)胞是體內(nèi)各種炎性相關(guān)細(xì)胞因子的主要來源,也是評(píng)估全身性炎性反應(yīng)狀態(tài)的主要對(duì)象。本研究以乳腺癌患者手術(shù)前后分別經(jīng)LPS處理4 h的外周血單核細(xì)胞為樣本,對(duì)比分析了qPCR和微量蛋白質(zhì)定量分析方法對(duì)caspase-1和IL-1β表達(dá)量的檢測結(jié)果,為評(píng)估各種應(yīng)激因素和腫瘤狀態(tài)對(duì)于體內(nèi)炎性微環(huán)境影響的臨床研究,以及腫瘤患者的臨床管理提供了方法學(xué)參考。

文獻(xiàn)報(bào)道[6],單核細(xì)胞對(duì)LPS的響應(yīng)非常迅速,炎性小體相關(guān)分子的mRNA和蛋白水平迅速增加,到3 h IL-1β的mRNA已進(jìn)入平緩增長期,而到6 h部分樣本的mRNA表達(dá)量已明顯下降。因此本文選擇了LPS處理4 h進(jìn)行檢測。研究結(jié)果表明大部分個(gè)體的炎性相關(guān)因子在術(shù)后2 h即明顯升高,但剩余個(gè)體反而表現(xiàn)出降低或沒有明顯變化。這種差異可能對(duì)于患者的全身性炎性反應(yīng)狀態(tài)具有重要影響,但需要更為系統(tǒng)的隨訪觀察。重要的是,近半患者手術(shù)前后caspase-1和IL-1β的mRNA水平的變化與蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化不一致。這提示研究疾病發(fā)展中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況,僅依賴基因水平的檢測可能存在局限性,而蛋白質(zhì)水平的檢測能反映體內(nèi)更多層面的表達(dá)調(diào)控,比如翻譯、翻譯后修飾等,相比于蛋白質(zhì)總量,酶切活性對(duì)于炎性反應(yīng)狀態(tài)的評(píng)估更加重要。

近年來,微量蛋白質(zhì)定量分析系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和產(chǎn)品研發(fā)中。在磷酸化和蛋白異構(gòu)體分析、疫苗研發(fā)和治療性蛋白質(zhì)等不同領(lǐng)域中,其均展現(xiàn)出多方面的優(yōu)勢[12-15]。本研究也證明其在測量蛋白質(zhì)水平上具有樣本需求量小、流程標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)性高、靈敏度高等特點(diǎn),更適用于臨床樣本的檢測。本研究也存在一些局限性,比如樣本量相對(duì)較小,僅檢測了少數(shù)因子的表達(dá)等,限制了結(jié)果的全面性和泛化性。

綜上,本研究通過對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)的qPCR檢測不適于炎性反應(yīng)狀態(tài)的評(píng)估,而微量蛋白質(zhì)分析具有樣本用量少、靈敏度高、重復(fù)性好、操作相對(duì)簡單等優(yōu)點(diǎn),特別適合基于臨床樣本的分析,可為深入了解腫瘤炎性反應(yīng)微環(huán)境的分子機(jī)制、臨床診斷和治療等提供依據(jù)。